专利名称：一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法
一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法。
背景技术：
草莓(Fragaria ananassa Duch)属蔷薇科多年生草本植物,果实鲜美红嫩,浓郁多汁，果味芳香并且营养丰富，素有“水果皇后”之称。近年来，随着草莓经济价值的日益走俏，人们开始越来越重视草莓的果实品质。类胡萝卜素(Carotenoids)既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素。越来越多的医学研究表明，除了不少类胡萝卜素是维生素A的前体外，许多类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用。目前草莓类胡萝卜素提取和测定尚未见报道，缺少准确可靠的检测方法，因此建立一种快速、准确的测定方法对研究草莓果实类胡萝卜素积累规律、合理开发和利用我国草莓资源具有重要的理论价值和应用前景。检测植物中类胡萝卜素的方法有纸层析法、柱层析法、薄层层析法、膜层析法和高效液相色谱法。超高效液相色谱(Ultra performance liquid chromatography, UPLC)是近几年推出的一种新的液相色谱技术，相较于传统的分析方法带来的分辨率限制、操作繁杂、无法检测到更多种类的类胡萝卜素的缺点，UPLC以更短的填料色谱柱，耐受超高压(40mpa)色谱泵和色谱系统，使分离速度、灵敏度、分离度达到普通HPLC的9、3、1.7倍，体现出明显的超高选择性、超高分离度、超高灵敏度以及超高速等优势，在蛋白组学、代谢组学、天然产物、环境监测等众多高端领域得到应用。利用UPLC测定草莓类胡萝卜素含量国内外还未见报道。

发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，该测定方法简单快速，结果准确可靠。本发明是这样实现的:一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，采用超高效液相色谱法在同一色谱条件下对草莓果实中的4种分别为叶黄素、β-胡萝卜素、隐黄质以及番茄红素的类胡萝
卜素成分同时进行含量测定；该方法包括如下步骤:(I)制备对照品溶液:分别称取叶黄素、β -胡萝卜素、β -隐黄质、番茄红素对照品，加丙酮得到四种单个对照品溶液；再分别精密量取四种单个对照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合对照品溶液；(2)制备供试品溶液:精密称定草莓果肉，用液氮快速研磨至粉末状，置具塞锥形瓶中，精密加入丙酮:石油醚=1:2提取剂，于50°C下，避光浸提3小时，过滤出上清液；残渣反复浸提至残渣发白，合并上清液，用旋转蒸发仪40°C蒸至糊状；加入石油醚和10%K0H-甲醇，避光，室温萃取，阜化过夜；然后过滤，将滤液转入250ml分液漏斗中，并将分液漏斗下层的皂化液转入锥形瓶，用石油醚反复萃取皂化液至石油醚层为无色，接着合并石油醚层至另一 250ml分液漏斗中，用双蒸水反复洗涤石油醚层，去残余的丙酮至双蒸水层为中性，继续加入无水硫酸钠脱水后旋转蒸发仪40°C蒸干，最后用丙酮定容，即得；(3)制定色谱条件:仪器:WATERSACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱；色谱柱:ACQUITYUPLC BEH C18 规格为 2.1mmX50mm, 1.7u m 的色谱柱；流动相:乙腈与甲醇；流动相流速:0.5ml/min ;检测波长:450nm；进样体积:5ul ;柱温:27O;(4)进行常规系统适应性试验，注入超高效液相色谱仪进行叶黄素、β -胡萝卜素、β-隐黄质以及番茄红素含量测定。进一步地，流动相各组分的体积比为乙腈:甲醇=9:1。进一步地，步骤(I)对照品溶液的制备为:分别精密称取叶黄素、胡萝卜素、β -隐黄质、番爺红素对照品各1.0mg,加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到浓度为200ug/ml单个对照品溶液；分别精密量取单个对照品溶液，置同一容量瓶，得到混合对照品溶液。进一步地，步骤(2)中加入的丙酮、石油醚以及10%K0H_甲醇中均含0.1%BHT。本发明具有如下优点:本发明确定了适用于草莓类胡萝卜素成分测定的超高效液相法，本方法精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高，本发明的流动相组合可以将4种类胡萝卜素成分彻底分离，且在同一色谱条件下对草莓中4种类胡萝卜素成分同时进行分离和含量测定，流动相试剂用量少，方法简单快速，结果准确可靠，在5分钟内就可完成检测，大大提高了分析速度和减少了溶剂消耗；本发明方法采用皂化处理工艺步骤，可以提高草莓果实中类胡萝
卜素提取效果，因此本发明是适合草莓果实类胡萝卜素定性和定量分析的最佳方法，为草莓果实类胡萝卜素研究提供技术基础。

下面参照附图结合实施例对本发明`作进一步的说明。图1为叶黄素对照品溶液超高效液相色谱(UPLC)图。图2为β -胡萝卜素对照品溶液超高效液相色谱(UPLC)图。图3为β -隐黄质对照品溶液超高效液相色谱(UPLC)图。图4为番茄红素对照品溶液超高效液相色谱(UPLC)图。图5为叶黄素、β -隐黄质、番茄红素、β -胡萝卜素对照品混合溶液超高效液相色谱(UPLC)图。图6为实施例1的供试品溶液的超高效液相色谱(UPLC)图。图7为实施例2的供试品溶液的超高效液相色谱(UPLC)图。
具体实施方式
请参阅图1 7所示，对本发明的实施例进行详细的说明。一、实验条件1、仪器与试药超高效液相色谱仪为美国WATERS ACQUITY UPLC H_Class，包括四元溶剂管理器、自动进样器、柱温箱、PDA检测器以及Empower色谱工作站；β -胡萝卜素对照品，番茄红素对照品，叶黄素对照品，β-隐黄质对照品为美国Sigma公司产品；乙睛和甲醇为色谱纯，来自Fisher公司；其他试剂均为分析纯。2、流动相各组分的体积比为乙腈:甲醇=9:1。3、本试验选择450nm作为类胡萝卜素检测吸收波长。4、提取剂为丙酮:石油醚=1:2提取剂且含0.1%BHT。二、保留时间和峰面积的重复性、精密度试验取上述四种类胡萝卜素对照品制成四种对照品溶液，在超高液相色谱仪中分别重复进样5次，分别计算保留时间和峰面积的平均值、标准差和变异系数，来测定仪器的性能以及方法的精密型，结果见表1，四种类胡萝卜素对照品保留时间的变异系数分别为
1.90%、1.43%、1.92%、1.91%,峰面积的变异系数分别为 1.38%、1.97%、1.98%、1.53%，均小于2%，说明超高液相色谱仪性能良好，用该方法测定类胡萝卜素成分的重现性高。表I四种对照品的保留时间和峰面积的平均值、标准差和变异系数(n=5)
权利要求
1.一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，其特征在于:采用超高效液相色谱法在同一色谱条件下对草莓果实中的4种分别为叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质以及番茄红素的类胡萝卜素成分同时进行含量测定；该方法包括如下步骤: (1)制备对照品溶液:分别称取叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、番茄红素对照品，加丙酮得到四种单个对照品溶液；再分别精密量取四种单个对照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合对照品溶液； (2)制备供试品溶液:精密称定草莓果肉，用液氮快速研磨至粉末状，置具塞锥形瓶中，精密加入丙酮:石油醚=1:2提取剂，于50°C下，避光浸提3小时，过滤出上清液；残渣反复浸提至残渣发白，合并上清液，用旋转蒸发仪40°C蒸至糊状；加入石油醚和10%K0H-甲醇，避光，室温萃取，阜化过夜；然后过滤，将滤液转入250ml分液漏斗中，并将分液漏斗下层的皂化液转入锥形瓶，用石油醚反复萃取皂化液至石油醚层为无色，接着合并石油醚层至另一 250ml分液漏斗中，用双蒸水反复洗涤石油醚层，去残余的丙酮至双蒸水层为中性，继续加入无水硫酸钠脱水后旋转蒸发仪40°C蒸干，最后用丙酮定容，即得； (3)制定色谱条件: 仪器:WATERS ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱； 色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 规格为 2.1mmX 50mm, 1.7u m 的色谱柱； 流动相:乙腈与甲醇； 流动相流速:0.5ml/min ； 检测波长:450nm ； 进样体积:5ul ； 柱温:27°C ; (4)进行常规系统适应性试验，注入超高效液相色谱仪进行叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质以及番茄红素含量测定。
2.根据权利要求1所述一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，其特征在于:流动相各组分的体积比为乙腈:甲醇=9:1。
3.根据权利要求1所述一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，其特征在于:步骤(1)对照品溶液的制备为:分别精密称取叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、番茄红素对照品各1.0mg，加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到浓度为200ug/ml单个对照品溶液；分别精密量取单个对照品溶液，置同一容量瓶，得到混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，其特征在于:步骤(2)中加入的丙酮、石油醚以及10%K0H-甲醇中均含0.1%BHT。
全文摘要
本发明提供一种草莓类胡萝卜素成分的含量测定方法，即采用超高效液相色谱法在同一色谱条件下对草莓果实中的4种分别为叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质以及番茄红素的类胡萝卜素成分同时进行含量测定，本发明以丙酮石油醚=12作为提取剂，皂化提取草莓果实中类胡萝卜素，以乙腈甲醇=91为流动相，检测吸收波长为450nm，检测可以在5min内完成。本方法精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高，对草莓中4种类胡萝卜素成分同时进行分离和含量测定，方法简单快速，结果准确可靠，试剂用量少是适合草莓果实类胡萝卜素定性和定量分析的最佳方法。
文档编号G01N30/88GK103175934SQ201310069898
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者朱海生, 温庆放, 陈敏氡 申请人:福建省农业科学院作物研究所