贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法
【专利摘要】一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，属于电化学检测【技术领域】，首先是通过在裸金电极表面电聚合硫堇-亚甲基蓝复合膜，再利用电极表面修饰技术，将纳米金和抗体依次修饰至电极表面，制备一种电化学免疫传感器；其次是将制备的免疫传感器用于贝类中大田软海绵酸的电化学检测。本发明借助硫堇-亚甲基蓝的复合聚合膜和纳米金的协同作用使峰电流信号放大，提高传感器的灵敏度；利用具有特殊分子结构的大田软海绵酸与其抗体特异性结合生成以阴离子形式存在的免疫产物，能阻碍电极表面电子传递的特性，实现非标记电化学检测。本发明方法用于贝类样品中大田软海绵酸的测定,检测快速，灵敏度高，结果准确可靠。
【专利说明】贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于电化学检测【技术领域】，具体地涉及一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法。
【背景技术】
[0002]大田软海绵酸(Okadaic acid，0A)属多环聚醚类脂溶性贝类毒素，是海洋腹泻性贝类毒素的主要成分。OA可通过食物链富集于贝类等滤食性海洋生物体内，导致消费者胃肠功能紊乱，出现腹泻、呕吐和腹痛等中毒症状。研究证实，OA及其衍生物鳍藻毒素能够抑制蛋白磷酸酶的活性，是一类潜在的肿瘤促进因子，且呈现出发生频率增加、分布区域扩大、危害日益严重的发展趋势，已成为国际社会共同关注的重大食品和生态安全问题，也是发达国家制定监控计划和贸易壁垒的主要目标。欧盟、德国和英国等多个国家规定双壳贝类可食性组织中腹泻性贝类毒素不大于160 μ g/kg(以OA计)，不过近期欧盟对OA的毒性进行了重新评估，认为现行限量标准不足以保护消费者安全，拟将该限量标准降低到45 μ g/kg0
[0003]目前，检测大田软海绵酸的方法有小鼠生物法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析法等。小鼠生物法的毒素提取过程繁琐，需时较长(通常需24h)，且易出现假阳性，检出限偏高，重现性较差，而液相色谱和液相色谱-串联质谱法需要价格昂贵的仪器和专业的人员操作，过程复杂，不能实现快速和现场检测。电化学检测法具有灵敏度高、操作简便、快速、经济、环保等优点，尤其是电化学免疫传感器分析技术因干扰少，检出限低，样品预处理及仪器设备简单而易实现现场检测，可提供实时快速、简单便携和低成本的分析方法，但在贝类毒素的检测上应用较少，具有自主知识产权的贝类毒素电化学检测技术有待突破。
[0004]硫堇属于吩噻嗪类，具有优良的电化学活性，聚硫堇相对于单体而言有强大的附着力，不易流失，比表面积大，反应活性高，催化效果好；亚甲基蓝作为一种生物染料也是一种比较活泼的电子转移体，在导电基质上具有良好电化学行为，其导电聚合膜具有良好的电化学活性和电催化性能。目前，聚硫堇和聚亚甲基蓝作为高性能的电子交换聚合物已被广泛用作直接电化学电极的功能基质膜和电子媒介体，但鲜有聚硫堇-亚甲基蓝复合电聚合膜用于非标记型电化学免疫传感器的构建。

【发明内容】

[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，以克服现有检测贝类毒素大田软海绵酸技术上的不足，如仪器复杂、昂贵、步骤繁琐等缺点。本发明在金电极表面通过循环伏安法电聚合一层聚硫堇-亚甲基蓝复合膜，并借助纳米金的导电性、生物相容性与高比表面的特性实现抗体的有效固定，利用具有特殊分子结构的OA与其抗体特异性结合生成以阴离子形式存在的免疫产物，能阻碍电极表面电子传递的特性，构建了一种非标记型电化学免疫传感器，结合电化学工作站，实现了对贝类中大田软海绵酸的电化学检测。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]—种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，包括以下步骤:
[0008](I)金电极的预处理:金电极打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡,在稀H2SO4溶液中于-1.0?1.55V电位下循环扫描，取出后用水冲洗，吹干；
[0009](2)传感器的制备:将步骤(2)处理后的金电极置于含有终浓度为lmmol/L硫堇、4mmol/L亚甲基蓝、0.lmol/L氯化钾和pH6.010mmol/L PBS缓冲液的混合溶液中，于+1.5V恒电位下静置，然后用循环伏安法扫描，形成硫堇-亚甲基蓝复合聚合膜；用水充分淋洗金电极后，将其浸于纳米金溶液中，以在金电极上获得纳米金层；取大田软海绵酸单克隆抗体涂覆在金电极表面，室温下反应；滴加牛血清白蛋白(BSA)溶液以覆盖多余的非特异性位点，即完成传感器的制备；
[0010](3)大田软海绵酸的测定:将不同浓度梯度的OA标准溶液或样品溶液滴加到步骤
(2)所制备的传感器表面，反应后，使用电化学工作站进行差示脉冲伏安测量，记录免疫反应前后峰电流值。
[0011]进一步，步骤(2)所述的纳米金溶液的合成方法为:取HAuCl4溶液加热煮沸，在搅拌回流状态下迅速加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，待溶液颜色变为深酒红时，即完成纳米金的合成，其中HAuCl4与柠檬酸三钠的质量比为1:3。
[0012]进一步，所述的HAuCl4溶液和柠檬酸三钠的浓度分别为0.01% (重量比)、1% (重量比)。
[0013]进一步，步骤(3)所述的样品溶液的获取方法:称取贝样，加入甲醇水溶液均质提取，离心后定容；取提取液用氮气吹干，用PBS缓冲溶液定容，超声波震使荡残留物充分溶解，溶解液过滤膜后待测。
[0014]进一步，所述的PBS缓冲溶液具体是指pH7.4的Na2HPO4-KH2PO4缓冲体系，浓度为10mmol /I, η
[0015]进一步,所述的滤膜为0.45 μ m。
[0016]进一步,步骤(I)所述的金电极用0.05μηι招粉打磨,对打磨后的金电极清洗是依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声清洗。
[0017]进一步，步骤(I)所述的稀H2SO4溶液的浓度为0.lmol/L。
[0018]进一步,步骤(I)所述的piranha溶液的成分为浓H2SO4:30%H202=7:3,所述的比例为体积比。
[0019]进一步，步骤(2)所述的循环伏安法扫描的条件是-0.45?0.15V电位、50mV/s速率下扫描25圈。
[0020]进一步,步骤(2)所述的大田软海绵酸单克隆抗体溶液浓度为0.lmg/mL,所用的体积为20 μ L ;所述的BSA溶液浓度为0.5% (重量比)，体积为20 μ L。
[0021]进一步，步骤(3)中电化学工作站为三电极工作模式，其中传感器作为工作电极，钼电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
[0022]进一步，步骤(3)中所述的差示脉冲伏安法测量的脉冲范围是-0.6?0.6V。进一步，步骤(3)中所述的OA标准溶液浓度分别为:0.2、2、10、20和100 μ g/L ;滴加大田软海绵酸标准溶液所测电流差值与大田软海绵酸标准溶液浓度的对数呈线性关系，并绘制工作曲线；滴加样品溶液后记录其电流的变化值，根据所得到的工作曲线，计算贝类样品中大田软海绵酸的含量。
[0023]本发明与现有技术相比的有益效果:
[0024](I)硫堇聚合膜致密稳定，富含构建传感界面所用的氨基；亚甲基蓝加速电极表面的电子传递；纳米金可提高抗体分子的组装量，本发明利用硫堇-亚甲基蓝的复合聚合膜和纳米金的协同作用使峰电流信号放大，提高传感器的检测灵敏度。
[0025](2)本发明利用分子结构中含有羧基和酚基的大田软海绵酸与其抗体结合后可以提供额外的负电荷，生成以阴离子形式存在的免疫产物能阻碍电子传递的特性，依据免疫反应前后传感器界面的电流变化与免疫产物的量成正比关系实现了对大田软海绵酸的非标记电化学检测，与标记型电化学免疫传感器检测技术相比，简化了制备和测试过程。
[0026](3)本发明中制备的非标记型电化学免疫传感器，特异性好，灵敏度高，响应快速，且便携、小巧，适合现场快速筛选。
[0027](4)本发明的电化学检测方法，简化了样品前处理步骤，经济、环保且重现性好，结果准确可靠。
【专利附图】

【附图说明】
[0028]图1为免疫传感器修饰过程的电化学交流阻抗表征图。
[0029]图2为大田软海绵酸电化学检测的电流响应图。
【具体实施方式】`
[0030]下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0031]一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，包括以下步骤:
[0032](I)样品前处理:称取Ig贝样于50mL离心管中，加入8mL80%甲醇水溶液，1000Or/min均质提取2min，再以8000r/min离心5min，转移上清液至IOmL比色管中，并用甲醇定容至10mL。移取ImL提取液氮吹至近干，用10mmol/L PBS (pH7.4)定容至lmL，超声30s充分溶解残留物，溶解液过0.45 μ m滤膜后待测。
[0033](2)纳米金的合成:取50mL HAuCl4 (0.01%)加热煮沸，在搅拌回流状态下迅速加入1.5mLl%柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸lOmin，待溶液颜色变为深酒红时，即完成纳米金的合成。
[0034](3)金电极的预处理:将金电极用0.05 μ m铝粉打磨后，置于超纯水、无水乙醇和超纯水中分别超声清洗5min，再用piranha溶液(浓H2SO4:30%H202=7: 3)浸泡20min，在
0.lmol/L H2SO4溶液中于-1.0~1.55V电位下循环扫描lOmin，取出后用水冲洗，氮气吹干。
[0035](4)传感器的制备:将步骤(3)处理的金电极首先置于含有终浓度分别为lmmol/L硫堇、4mmol/L亚甲基蓝、0.lmol/L氯化钾和10mmol/L PBS (pH6.0)缓冲溶液的混合溶液中，于+1.5V恒电位下静置IOmin,然后于-0.45~0.15V电位、50mV/s速率下用循环伏安法扫描25圈，形成硫堇-亚甲基蓝复合聚合膜；用超纯水充分淋洗电极后，将其浸于步骤(2)合成的纳米金溶液中4h，以获得纳米金层；取2(^1^大田软海绵酸单克隆抗体(&社1-(^，0.lmg/mL)涂覆在电极表面，室温下反应Ih ;最后，滴加20 μ L0.5%牛血清白蛋白溶液(BSA)以覆盖多余的非特异性位点，置于4°C下保存待用。
[0036]图1为免疫传感器修饰过程的电化学交流阻抗表征图。图中谱线a为裸金电极的阻抗图，电阻较小，表明电极表面的电子传递只受扩散控制；谱线b为形成聚硫堇-亚甲基蓝聚合膜后的电极阻抗图，界面电子转移阻力增大，而谱线c为纳米金颗粒自组装到电极界面的阻抗图，纳米金加快了电极表面的电子传递，电阻略有减小；当ant1-OA进一步组装在电极表面后，阻抗值剧增(谱线d)，说明电极表面已形成自组装抗体层，传感界面即构建完毕。
[0037](5 )大田软海绵酸的测定:将20 μ L不同浓度的OA标准溶液(分别为0.2、2、10、20和100 μ g/L)滴加到步骤(4)制备的传感器表面，反应lh。电极经超纯水充分淋洗后，进行差示脉冲伏安(DPV)测量，脉冲范围为-0.2~0.6V，记录免疫反应前后峰电流变化。
[0038](6)根据步骤(5)所测电流差值与大田软海绵酸标准溶液浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线。
[0039]将按步骤(1)处理好的样品溶液按照步骤(5)的方法进行测试，根据其电流的变化值与步骤(6)得到的OA工作曲线，计算贝类样品中OA的含量。
[0040]图2为免疫传感器对大田软海绵酸的电流响应图，内插图为测定OA含量的校准曲线。不同浓度的OA溶液与电极上的抗体结合，反应前后电流发生变化，用差示脉冲伏安法记录电流变化大小(反应前电流记为1(1，反应后记为I，电流变化为Δ I=Itl-1),免疫反应前后峰电流的变化值(Λ I)随着OA浓度的增加而增大，且Λ I与OA浓度的对数线性相关，得出OA的线性范围为0.2~100 μ g/L，相关系数为0.9920。根据空白信号3倍标准偏差所计算得到OA的检出限为0.1 μ g/L。
[0041](7)选取四份贝类样品做加标回收实验，并与液相色谱-串联质谱法对比，结果见表1。
[0042]表1贝类中大田软海绵酸的对比测定结果
[0043]
【权利要求】
1.一种贝类中大田软海绵酸的电化学检测方法，其特征是包括以下步骤: (1)金电极的预处理:金电极打磨、清洗，再用piranha溶液浸泡,在稀H2SO4溶液中于-1.0?1.55V电位下循环扫描，取出后用水冲洗，吹干； (2)传感器的制备:将步骤(I)处理后的金电极置于含有终浓度分别为lmmol/L硫堇、4mmol/L亚甲基蓝、0.lmol/L氯化钾和pH6.010mmol/L PBS缓冲液的混合溶液中，于+1.5V恒电位下静置，然后用循环伏安法扫描，形成硫堇-亚甲基蓝复合聚合膜；用水充分淋洗金电极后，将其浸于纳米金溶液中，以在金电极上获得纳米金层；取大田软海绵酸单克隆抗体涂覆在金电极表面，室温下反应；滴加牛血清白蛋白溶液以覆盖多余的非特异性位点，即完成传感器的制备； (3)大田软海绵酸的测定:将不同浓度梯度的大田软海绵酸标准溶液或样品溶液滴加到步骤(2)所制备的传感器表面，反应后，使用电化学工作站进行差示脉冲伏安测量，记录免疫反应前后峰电流值。
2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(2)所述纳米金溶液的合成方法为取HAuCl4溶液加热煮沸，在搅拌回流状态下迅速加入柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，待溶液变为深酒红色时，即完成纳米金溶液的合成，其中HAuCl4与柠檬酸三钠的质量比为 1:3。
3.根据权利要求2所述的电化学检测方法，其特征在于所述的HAuCl4和柠檬酸三钠的浓度分别为0.01% (重量比)、1% (重量比)。
4.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(I)所述的金电极用0.05 μ m铝粉打磨，对打磨后的金电极清洗是依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声清洗。
5.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(2)所述的循环伏安法扫描的条件是-0.45?0.15V电位、50mV/s速率下扫描25圈。
6.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(2)所述的大田软海绵酸单克隆抗体溶液浓度为0.lmg/mL,所用的体积为20 μ L，所述滴加的BSA溶液浓度为0.5%(重量比),体积为20 μ L。
7.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(3)中所述样品溶液的制备为称取贝样，加入甲醇水溶液均质提取，离心后定容；取提取液用氮气吹干，用PBS缓冲溶液定容，超声波震荡使残留物充分溶解，溶解液过滤膜后待测。
8.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(3)中电化学工作站为三电极工作模式，其中所述步骤(2)制备的传感器作为工作电极，钼电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
9.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的差示脉冲伏安法测量的脉冲范围是-0.6?0.6V。
10.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的大田软海绵酸标准溶液浓度分别为:0.2、2、10、20和100 μ g/L，滴加大田软海绵酸标准溶液所测电流差值与大田软海绵酸标准溶液浓度的对数呈线性关系，并绘制工作曲线；滴加样品溶液后记录其电流的变化值，根据所得到的工作曲线，计算贝类样品中大田软海绵酸的含量。
【文档编号】G01N27/48GK103713035SQ201410009128
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】郭萌萌, 谭志军, 吴海燕, 李兆新, 王联珠, 翟毓秀 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所