专利名称：一种人胎盘成肌纤维母细胞的简易分离及鉴定方法
一种人胎盘成肌纤维母细胞的简易分离及鉴定方法发明领域
本发明涉及从人胎盘蜕膜面分离成肌纤维母细胞并对成肌纤维母细胞进行鉴定的方法。
背景技术：
胎盘被认为是最具有吸引力的“成体干细胞”，能在适宜的体内或体外环境下分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。由于胎盘干细胞材料来源相对方便，易于分离和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且不存在免疫排斥的特性；因此近年来已成为干细胞研究中的热点，在免疫疾病治疗、造血干细胞移植、组织工程、基因工程等领域具有较好的应用前景。
成肌纤维母细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞，来源于中胚层干细胞，在胚胎发育过程中先由间充质细胞分化而来，然后分裂、融合成多核肌纤维，形成肌小管，再进一步分化为成熟的骨骼肌细胞。
Oliver C从胎盘蜕膜中分离得到一种细胞，该细胞能表达平滑肌肌动蛋白并且有类似于成肌纤维细胞的亚显微结构；Zuzana Strakova从胎盘中分离的成肌纤维细胞,在特定培养基诱导下，能够分化为脂肪细 胞、成骨细胞，证明了胎盘成肌纤维细胞的多潜能性，为其在再生医学领域的研究提供理论支持；Lud0ViC Micallef研究发现成肌纤维细胞在受伤组织伤痕修复及功能恢复方面起着重要的作用；而01^ Eyal在体外把胎盘肌纤维细胞于雌激素等诱导因子共同培养，证明了催乳素可通过自我分泌的机理阻止子宫细胞的蜕膜化。成肌纤维细胞独有的特点和多潜能性，及其材料来源丰富，为细胞模型建立及再生医学的研究提供了良好材料。
然而，目前国内针对胎盘成纤维母细胞的分离鲜有报道，即使有报道，也主要集中在MSC或干细胞的分离方面，如CN 102586184 A(中国专利申请号201210044638.6，
公开日期2012年7月18日)公开题为“建立胎盘间充质干细胞库的方法”的发明；CN 101395266 A(中国专利申请号200680053575.3，
公开日期2009年3月25日)。
在国际上关于胎盘纤维母细胞的报道中，分离方法都集中于酶消化法，但在消化过程中有很多酶的参与:如美国伊利诺伊大学Zuzana Strakova在分离胎盘成纤维细胞时,使用胶原酶、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶、链霉蛋白酶四种酶混合反应消化获得成纤维细胞，多种酶的参与势必会造成实验步骤上的复杂和资源的不必要浪费。
成肌纤维母细胞由间充质干细胞分化而来，那么其应该保持着间充质干细胞的一些特性，包含贴壁生长特性，特定细胞表面抗原标志物的表达，向成脂，成骨方向的分化的能力坐寸ο 成肌纤维母细胞是成体干细胞的一种，能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞，其可能表达一种或者多种多能干细胞因子。
结蛋白(Desmin)是一种中间丝蛋白，广泛存在于大血管的平滑肌细胞，通过鉴定结蛋白的表达，可以验证细胞的肌原特性。且有文献报道随着成肌纤维母细胞的纯化，结蛋白的表达也逐步增强。

发明内容
本发明的目的是提供一种简单实用的从胎盘蜕膜层大量分离成肌纤维母细胞的方法和鉴定分离的成肌纤维母细胞的方法。
本发明的胎盘成纤维母细胞分离方法是，利用手术刀及镊子剔除蜕膜面的输血组织等组织，仅留取靠近胎儿的蜕面，只是用胶原酶消化组织，其具体步骤包括:
1、取新鲜胎盘组织，用手术刀在胎盘中央处取约5cm长宽的组织；用生理盐水清洗去除组织中血液；
2、用镊子手术刀剥除羊膜和底蜕膜上的血管组织，留取胎儿面蜕膜组织；
3、胎盘婴儿面蜕膜组织用75%酒精快速洗涤10秒；
4,75%酒精消毒洗涤后以生理盐水洗涤两次； 5、用手术刀把胎儿面蜕膜组织切割成0.5cm左右碎片；
6、以与组织碎片等体积的含1%胶原酶I的DMEM消化液37°C消化16-18 h， 消化溶液中无胎盘组织片后停止消化；
7、离心收集单个核细胞，用10%胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞；
8、在37°C、5% CO2、饱和湿度下培养箱中培养48 h，诱导贴壁；
9、细胞形成单克隆后，挑取单克隆细胞培养，待细胞融合度达到90%时，0.25%胰酶消化，即得胎盘成肌纤维母细胞。
本发明还通过流式检测细胞表面抗原和细胞周期、细胞多项分化潜能实验鉴定分离纯化后所得细胞的间质细胞特性，通过多能性干细胞因子的检测鉴定细胞的干性，通过细胞形态学观察及细胞结蛋白的表达鉴定细胞的肌原性。
10、正常条件下培养分离的成肌纤维细胞，培养过程中观察细胞生长特点及形态学变
化；
11、取培养的第三代细胞，流式检测细胞表面抗原⑶90、⑶44、⑶29、⑶45、HLA-DR，同时进行细胞周期检测；
12、取培养的第三代细胞进行多能干细胞因子0CT4、S0X2、Nanog的表达检测；
13、取培养的第三代细胞进行肌原性结蛋白的表达检测；
14、取培养的第三代细胞进行向成骨，成脂肪分化的检测。
本发明利用手术刀及镊子剔除蜕膜面的输血组织等组织，仅留取近胎儿的蜕面，只是用胶原酶消化组织，剔除不必要的组织，不仅能减少酶使用量、降低成本，减少消化时间，同时避免了大量杂细胞的引入，使细胞纯化更为方便。可使所得原代细胞在较短的培养时间内纯化为目的细胞。
本发明采用机械分散法与一种酶消化的一步法，此法操作简单，耗时时间较短，使用少量的消化酶即可达到好的分离效果，有利于后期此类分离方法的规模放大。同时采用特殊试剂前处理组织样本，在样本来源不确认的情况下，大大降低污染的风险。
本发明提供的分离所得肌原纤维母细胞的鉴定方法组合，一站式解决细胞的鉴定问题，且鉴定方法和结果可信、有效。


图1:细胞形态: A:单个细胞照片 B:细胞单克隆照片 C:细胞融合度达到90%照片 图2:流式细胞术检测细胞表型 图3:流式细胞术检测细胞周期 图4:细胞成骨细胞鉴定检测 图5:细胞成脂肪细胞检测 图6:细胞多能干细胞因子检测，从左至右分别为:0CT4、S0X2、Nanog的RT-PCR电泳照片 图7:细胞结蛋白表达检测 实施方式
本发明公开了一种人胎盘成肌纤维母细胞的分离和鉴定方法，本领域的技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明中。
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体具体实施例对本发明做进一步详细的说明。 实施例一胎盘成肌纤维母细胞分离培养 在无菌生物安全柜中取顺产婴儿的新鲜胎盘组织(12小时以内)，用手术刀在胎盘中央处取约5 cm长宽的组织，250 mL生理盐水洗涤2次，使劲挤压胎盘组织，使组织中的血液充分洗出，用镊子和手术刀剥除羊膜和底蜕膜上的输血组织；留取胎儿面蜕膜组织，250 mL生理盐水洗涤I次，用手术刀把胎儿面蜕膜组织切割成1.5 cm长、0.5 cm宽的大小；75%酒精快速清洗消毒10秒，再以250 mL生理盐水洗涤2次；以与组织碎片等体积的含1%胶原酶I的DMEM消化液37 °C消化16-18 h,消化溶液中无胎盘组织片后停止消化；将消化后的组织液平均分装于2个50 mL离心管中，添加生理盐水到50 mL, 2300 rpm,离心10 min离心收集单个核细胞；生理盐水洗涤2次，2000 rpm，离心10 min，用含10%胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基中重悬单个核细胞；在37 °C、5% CO2、饱和湿度下培养。
原代细胞培养48小时后全量换液，去除非贴壁细胞，添加新鲜培养基，待散在贴壁细胞形成单克隆后，挑取单克隆细胞单独培养，获得胎盘成纤维母细胞，待细胞融合度达到90%时，胰酶消化传代。
实施例二胎盘成肌纤维母细胞形态学鉴定 培养按照实施例一方法分离的成肌纤维细胞，诱导贴壁2天后，显微镜下可见散在的梭形贴壁细胞，将培养上清液全部倒掉，同时去除不贴壁的杂质细胞，培养5-7天后，可见成放射状的单克隆细胞形成，用细胞刮刀刮取单克隆细胞于12孔板中培养，待细胞数量达到5X106左右时，用于后续其它鉴定。
显微镜下观察可见(图1)细胞呈梭形或纺锤形，有两极，体积小，随着培养时间的增力口，细胞体积变大，融合生长，这些特点符合成肌纤维细胞的生长特点和形态学特点。
实施例三胎盘成肌纤维母细胞表面标志物鉴定
分别取不同胎盘来源按照实施例一培养的第3代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，观察不同胎盘来源细胞表面标志的变化。消化收集细胞，计数后取I X IO6个，PBS洗涤一次，1500 rpm，离心10 min ;弃上清，残留200 uL，吹打混匀细胞，加入FITC标记的CD90、⑶45和APC标记的⑶29、HLA-DR及PE标记的⑶44抗体各10 uL，并设I管为空白对照，在4 °C下避光反应30 min, PBS洗漆一次，1500 rpm,离心10 min,弃上清,残留200 uL,上机检测。
流式检测结果图2显示不同胎盘来源细胞⑶90 (99%左右)、⑶44 (98%左右)、⑶29(97%左右)三种抗原的表达均高于95%以上，⑶45 (0.7%左右)、HLA-DR (0.4%左右)两种抗原的表达均低于2%。细胞表面标志物结果表明细胞具有间质纤维细胞特性。
实施例四胎盘成肌纤维母细胞细胞周期检测
按照实施例一培养细胞，待细胞生长融合度为90%时，进行细胞周期检测。消化收集细胞，计数后取I X IO6个，PBS洗涤一次，弃上清，加入70%的乙醇-20 °C固定2 h，离心去除乙醇，用PBS洗涤一次，加入RNaseI 5 uL(20 mg/mL), 37 °C反应30 min，PBS洗涤一次，力口入碘化丙啶(PI，50 ug/mL) 0.5 uL，4 1:避光反应30 min，上机检测DNA含量。
细胞周期分析结果图3显示，处于G0/G1期、S期、G2M期细胞比例平均为93.72%、3.7%、
2.57%。证明培养中的胎盘成肌纤维母细胞大部分细胞处于G0/G1静息期，只有少数细胞处于活跃的S增殖期，具有典型的干细胞增长特点。
实施例五胎盘成肌纤维母细胞成骨分化潜能鉴定
按照实施例一培养3代以上细胞，消化制成`单细胞悬液，按照2 X IO4个/cm2的密度使用含10%胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基接种于预铺了 I型鼠尾胶原6孔板中，在37 °C、5% CO2、饱和湿度下培养，待细胞融合度达到50%后，更换含地塞米松
0.1 u M、抗坏血酸磷酸盐50 u g/mL、^ -磷酸甘油10 mM的新鲜培养基诱导培养，3天换液一次，共诱导3周，使用95%乙醇固定细胞，茜素红染色，显微镜下观察胞外钙基质沉淀的形成。
观察图4结果显示,细胞基质明显有I丐基质沉淀,表明细胞已向成骨细胞转化,具有间质干细胞的特性。
实施例六胎盘成肌纤维母细胞成脂分化潜能鉴定
按照实施例一培养3代以上细胞，消化制成单细胞悬液，按照I X IO5个/cm2的密度使用含10%胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基接种于预铺了 I型鼠尾胶原6孔板中，在37 °C、5% CO2、饱和湿度下培养，待细胞融合度达到80%后，更换含地塞米松IU M、消炎痛0.1 mM、IBMX 0.5 mM、胰岛素5 u g/ml的新鲜培养基诱导培养，3天换液一次，共诱导3周，10%多聚甲醛固定细胞，油红染色。
观察图5结果显示，细胞产生的脂肪被特异性染成红色，表明细胞已向脂肪细胞转化，具有间质干细胞的特性。
实施例七胎盘成肌纤维母细胞多能干细胞因子表达鉴定
取不同胎盘来源按照实施例一培养的第3代细胞，细胞量达到5X IO6个，提取细胞的总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，使用下述引物进行RT-PCR，检测0CT4、S0X2和Nanog基因的表达状况，该操作以试剂盒说明书进行，引物序列如表I所示。
表I =RT-PCR引物序列及其特性
权利要求
1.一种人胎盘成肌纤维母细胞的简便分离方法，包括取胎盘，用镊子手术刀剥除羊膜和底蜕膜上的血管组织，留取胎儿面蜕膜组织，使用75%酒精快速消毒洗涤组织10秒，然后以生理盐水洗涤2次，用手术刀把胎儿面蜕膜组织割成1.5 cm长、0.5 cm宽的大小碎片；加入与组织碎片等体积的含1%胶原酶I的DMEM消化液，37 °C消化16-18 h，消化溶液中无胎盘组织片后停止消化，离心收集单个核细胞；用含10%胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基在37°C、5%C02、饱和湿度下培养48h，诱导贴壁，细胞形成单克隆后，挑取单克隆细胞单独培养，待细胞融合度达到90%时，胰酶消化。
2.根据权利要求1，胎盘成肌纤维母细胞来自于在胎盘婴儿面蜕膜组织。
3.根据权利要求1，以75%酒精快速洗涤胎盘组织10秒。
4.根据权利要求1，用手术刀把胎儿面蜕膜组织割成1.5 cm长、0.5 cm宽的大小片段。
5.根据权利要求1，消化液为含胶原酶I的DMEM溶液。
6.根据权利要求1,消化时间为16-18h0
7.根据权利要求1，细胞培养使用含10%胎牛血清和200单位青链霉素双抗的DMEM/F12培养基。
8.根据权利要求1，形成单克隆后，挑取单克隆细胞单独培养，来纯化细胞。
9.一种鉴定人胎盘来源成纤维母细胞的鉴定方法组合，包含:细胞形态学，细胞周期，细胞表面标志物检测，细胞分化能力检测，细胞多能干细胞因子检测及细胞结蛋白表达检测共6种方法。
10.根据权利要求9，细胞表面标志物检测包括表面抗原⑶90、⑶44、⑶29、⑶45、HLA-DR。
11.根据权利要求9，采用向成脂，成骨分化的方法检测细胞的分化能力。
12.根据权利要求9，采用检测0CT4、S0X2、Nanog3种因子进行细胞多能性的鉴定。
13.根据权利要求9，采用结蛋白表达鉴定细胞的肌原性。
全文摘要
本发明涉及建立人胎盘成肌纤维母细胞的分离及鉴定方法。把胎盘胎儿面蜕膜组织机械破碎后，通过含胶原酶I的DMEM消化液消化，分离为单个核细胞，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，诱导贴壁，48小时后全量换液，去除非贴壁细胞，添加新鲜培养基，待贴壁细胞形成单克隆后，分别培养各单克隆细胞，当细胞融合90%左右时，胰酶传代，即得成肌纤维母细胞。本发明采用细胞形态学，细胞周期，细胞表面标志物检测，细胞成脂、成骨分化能力检测，细胞多能干细胞因子检测及细胞结蛋白表达检测的组合方法鉴定所得成肌纤维母细胞。
文档编号G01N15/14GK103173405SQ20131009074
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者王云虹, 李志刚, 丁炜, 王颖颖, 高长青, 杨海莲, 武晓云, 黄芳蕾, 聂晨飞, 刘洁, 李大为, 安志达, 吴兰兰, 马瑞, 吕岩, 康会彦, 刘学敏, 柏小丽 申请人:北京京蒙高科干细胞技术有限公司