口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒，所述双抗夹心酶联免疫试剂盒包括：标准品，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，抗BHK21细胞蛋白抗体液，稀释液，封闭液，洗液，终止液2M?H2SO4，显色液，其中，所述的标准品为幼仓鼠肾细胞蛋白，包被抗体和检测抗体均为兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体。本发明检测试剂盒中包被抗体量更加稳定均一、对微量抗原的乳化更加简便充分、结合抗体与检测抗体为同一抗体在制作试剂盒过程中更加便捷高效，避免不同抗体之间的交叉影响。
【专利说明】口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法，具体涉及一种用于检测口蹄疫疫苗中宿主细胞(即幼仓鼠肾细胞)残留蛋白的双抗体夹心酶联免疫试剂盒及其使用方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行口蹄疫，时刻威胁着无口蹄疫国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7-8纳米，是目前所知病毒中最细微的一级。
[0003]牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感，骆驼、绵羊、山羊次之，猪也可感染发病。本病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50% -100%，犊牛死亡率较高，其他则较低。病畜和潜伏期动物是最危险的传染源。病畜的水疱液、乳汁、尿液、口涎、泪液和粪便中均含有病毒。该病人侵途径主要是消化道，也可经呼吸道传染。本病传播虽无明显的季节性，且春秋两季较多，尤其是春季。风和鸟类也是远距离传播的因素之一 O
[0004]口蹄疫是目前我国最具影响的动物传染病之一。口蹄疫病毒型多易变，宿主广泛，致病性强，而免疫原性又相对较弱。该病传播方式及感染途径多而复杂，康复动物可长期带毒排毒，致使口蹄疫的防控十分困难。因此对口蹄疫疫苗质量要求越来越高，致使用以衡量疫苗质量，检测其他无关蛋白方法及相关产品呼之欲出。随着无血清细胞培养技术的产生和应用，宿主细胞残留蛋白成为影响疫苗的主要因素，所以对宿主细胞残留蛋白的检测尤为重要。与这一需求相矛盾的情况是，口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白检测相关产品的缺失，这为疫苗的检测监督造成了缺口和漏洞。在这种供求矛盾面前显得这一发明尤为重要。

【发明内容】

[0005]本发明的目的之一提供一种口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法。
[0006]本发明的目的之二提供一种微量抗原乳化的方法
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]—种用于检测口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒,所述双抗夹心酶联免疫试剂盒包括:标准品，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，稀释液，抗BHK21细胞蛋白抗体液，封闭液，洗液，终止液2M H2SO4,显色液，其中，所述的标准品为幼仓鼠肾细胞蛋白，包被抗体和检测抗体均为兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体。
[0009]1、兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体的制备
[0010]首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射BHK21细胞蛋白总量IOOOug/只；首次免疫后14天后进行二次免疫，步骤及剂量与首次免疫相同，二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同；之后每隔21天检测抗体效价，免疫一次，效价超过1:32000可以心脏大量采血。
[0011]2、BHK21细胞(幼仓鼠肾细胞)蛋白的制备
[0012]BHK21细胞(幼仓鼠肾细胞)购自中检所，应用DMEM培养基加马血清培养传代，待细胞长满培养瓶底用PH7.2的10XPBS洗涤5次，将培养基洗涤干净，胰酶消化细胞待细胞脱落，后再用10XPBS洗涤5次后装入孔径为8000-14000nm的透析袋，在100倍体积10XPBS缓冲液中4°C透析12小时，而后将细胞放入离心管中，_80°C反复冻容5次，镜下观察无完整细胞后进行7500r/min离心，去除细胞碎片，取上层溶液，此溶液为所需抗原蛋白溶液，考马斯亮蓝法检测蛋白含量。
[0013]3、抗原蛋白溶液的乳化方法
[0014]将2中获得的抗原蛋白溶液用10XPBS稀释成所需浓度，再与蛋白液等体积的弗氏佐剂混合后乳化。做冰水点滴试验，冰水中超过IOmin不扩散即达到乳化标准。本发明的乳化方法可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，具体操作方法为硅胶管两端分别加装5号针头，硅胶管处加蠕动泵作为乳化动力源，两针头放入同一装有抗原液与佐剂混合的混合液的尚心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
[0015]5、包被抗体血清的制备
[0016]应用3中获得的乳化抗原进行免疫，首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射BHK21细胞蛋白总量IOOOug/只；首次免疫后14天后进行二次免疫，二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，步骤及剂量与首次免疫相同；二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同；之后每隔21天免疫一次并且采血检测抗体效价，当效价超过1:32000可以大量采血，置于血凝管中离心制备血清。
[0017]6、间接ELISA法检测抗体效价
[0018]用2中提取的蛋白以10ug/ml量包被后，用0.1%BSA封闭90分钟，然后将4中制备的血清稀释16倍后加入第一列，然后依次两倍稀释，结合110分钟，加入稀释到工作浓度的酶标二抗20分钟，之后显色终止，酶标仪设定波长为450nm，读取数据，每个步骤完成后用洗涤液洗涤3到5次。
[0019]7、包被抗体的纯化
[0020]( I)辛酸硫酸铵法粗提抗体
[0021]首先动物血清用4倍体积的乙酸乙酸钠缓冲液稀释，0.1mol/LNaOH调pH至4.5，室温下搅拌并缓慢加入辛酸，10000r/min离心20min，取上清，量体积，按1/10体积加入10XPBS,并用5mol/L的NaOH调pH至7.4，在4°C按277g/L缓慢加入硫酸铵粉末，加完后继续搅拌30min,离心弃上清，收集沉淀,沉淀用10XPBS溶解,透析过夜,透析后的抗体溶液在50-55°C水浴中加热20min，5000r/min离心20min，取上清液放置_20°C保存。[0022](2)亲和层析柱纯化抗体
[0023]用结合缓冲液稀释4中获得的抗体，至pH接近7.0，然后将蛋白A填料装入柱子，用5倍体积结合缓冲液平衡柱子。上样，结合缓冲液洗柱子，收集洗脱缓冲液洗下的结合在柱料上的抗体，然后用结合缓冲液复生柱料。
[0024]8、酶标板的处理
[0025]用10%硫酸鱼精蛋白溶液每孔100ul37°C 2小时处理酶标板，后用抗体效价对照稀释包被，即将间接ELISA检测效价为1:2048的抗体液稀释32倍后加入酶标板每孔lOOul，37°C包被过夜，后封闭2小时，封存。
[0026]9、使用本发明双抗夹心酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0027](I)加入待测样品:取出酶标板加入稀释后的待测样品，IOOul每孔，37 C，2小时；
[0028](2)加入检测抗体:取出检测抗体稀释32倍，每孔加入100ul，37°C，1.5小时；
[0029](3)加酶标二抗:将酶标二抗稀释10000倍后每孔加入lOOul，37°C，20分钟；
[0030](4)显色:每孔加入显色液100ul37°C 4分钟；
[0031](5)终止:每孔加入40ul2M硫酸溶液；
[0032](6)酶标仪测量在波长为450nm的值，计算BHK21细胞蛋白含量；
[0033]其中，所述的计算方法为:
[0034]采用样品读取值与阴性值作差后引入公式y=Z (4925.2χ-702.52)中计算细胞蛋白含量，其中Y代表细胞蛋白含量，单位ug/ml，X值为阴阳性吸光值之差，Z为稀释倍数。
[0035]Y=Z (4925.2X-702.52)的确立过程如下:
[0036]依照双抗夹心ELISA体系对BHK21细胞蛋白液进行检测，具体方法如下:
[0037](I)将提取的BHK21细胞破碎提取蛋白；
[0038](2)用考马斯亮蓝法定量蛋白液中蛋白含量；
[0039](3)稀释蛋白液使蛋白含量分别为100ug/ml200ug/ml300ug/ml400ug/ml四个梯度，完成ELISA ;
[0040](4)进行多次实验分别得到四个蛋白含量梯度阴阳性差值的平均值，依照得到的四个平均值确定标准曲线建立方程。
[0041]试验阴阳性差平均值如下:
[0042]
【权利要求】
1.一种用于检测口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述双抗夹心酶联免疫试剂盒包括:标准品，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，抗BHK21细胞蛋白抗体液，稀释液，封闭液，洗液，终止液2M H2SO4,显色液,其中,所述的标准品为所述标准品为幼仓鼠肾细胞蛋白，包被抗体和检测抗体均为兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体。
2.根据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体的制备方法为: 首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射BHK21蛋白总量IOOOug/只；首次免疫后14天后进行二次免疫,步骤及剂量与首次免疫相同,二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同；之后每隔21天检测抗体效价，免疫一次，效价超过1:32000可以心脏大量采血。
3.根据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述幼仓鼠肾细胞蛋白的制备方法如下: 将BHK21细胞用DMEM培养基加马血清培养传代，待细胞长满培养瓶底用pH为7.2的10 X PBS洗涤5次，将培养基洗涤干净，胰酶消化细胞待细胞脱落，后再用10 X PBS洗涤5次后装入孔径为8000-14000nm的透析袋，在100倍体积10XPBS缓冲液中4°C透析12小时，而后将细胞放入离心管中，-80°C反复冻容5次，镜下观察无完整细胞后进行7500r/min离心，去除细胞碎片，取上层溶液，此溶液为所需抗原蛋白溶液，考马斯亮蓝法检测蛋白含量。
4.根据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，方法为硅胶管两端分别加装5号针头，硅胶管处加蠕动泵作为乳化动力源，两针头放入同一装有抗原液与佐剂混合的混合液的离心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
5.酶标板处理方法用10%硫酸鱼精蛋白溶液每孔100ul37°C2小时处理酶标板，后用抗据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述抗体效价对照稀释包被，即将间接ELISA检测效价为1:2048的抗体液稀释32倍后加入酶标板每孔lOOul，37°C包被过夜，后封闭2小时，封存。
6.使用如权利要求1-5任一项所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)加入待测样品:取出酶标板加入稀释后的待测样品，IOOul每孔，37°C，2小时； (2)加入检测抗体:取出检测抗体稀释32倍，每孔加入100ul，37°C，1.5小时； (3)加酶标二抗:将酶标二抗稀释10000倍后每孔加入lOOul，37°C，20分钟； (4)显色:每孔加入显色液IOOul，37°C，4分钟； (5)终止:每孔加入40ul，2M硫酸溶液； (6)酶标仪测量在波长为450nm的值，计算BHK21细胞蛋白含量； 其中，所述的计算方法为: 采用样品读取值与阴性值作差后引入公式y=Z (4925.2x-702.52)中计算细胞蛋白含量，其中Y代表细胞蛋白含量，单位ug/ml，X值为阴阳性吸光值之差，Z为稀释倍数。
【文档编号】G01N33/543GK103792366SQ201410026997
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】赵炳武, 赵宏凯, 任美荣, 刘金萍, 王永伟, 吕宏亮, 张澍 申请人:内蒙古必威安泰生物科技有限公司