一种松萝凤梨细胞核悬液制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种松萝凤梨细胞核悬液制备方法。步骤如下：1）取松萝凤梨嫩叶50mg，置于塑料培养皿中加入1ml提取液，所述提取液主要由终浓度如下的组分组成：21g/L一水柠檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及体积浓度0.5%吐温20）使用刀片在提取液中切碎松萝凤梨嫩叶，然后收集提取液经350目尼龙网过滤，获得松萝凤梨细胞核悬液。本发明的有益效果：1）最大限度地减少了有害试剂的使用，如巯基乙醇，减轻了提取液对人体的危害；2）提取液成分简单，只有三种，均为常规实验室试剂，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；3）步骤简单，无需离心，节省了时间提高了效率，可以在短时间内获得高质量的细胞核悬液用于流式细胞仪检测。
【专利说明】一种松萝凤梨细胞核悬液制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适用于流式细胞仪分析的松萝凤梨细胞核悬液制备方法。
【背景技术】
[0002]松萝凤梨(TYJJaflWa usuneoides L.),是一种生长在空气中、不需要土壤、生长所需的水分和营养可以全部来自空气的特殊植物。松萝凤梨抗逆性强又可吸收有毒有害物质，已应用于环境指示、室内观赏、装饰，市场前景广阔，发展潜力巨大。但由于松萝凤梨特殊的生长方式，相关分子生物学、细胞学及遗传育种研究极少，新品种培育也因此受到限制。随着研究深入，使用流式细胞仪进行植株倍性鉴定、基因组大小测定以及细胞周期等应用和基础研究对拓宽松萝凤梨育种基础具有重要意义。而其中获得适用于流式细胞仪分析的松萝凤梨细胞核悬液成为其中关键技术。
[0003]松萝凤梨叶片含有较多次生代谢物质，采用已报道的方法难以获得适用于流式细胞仪分析的松萝凤梨细胞核悬液，或相关方法繁琐、含有对人体有害的试剂，这些都阻碍了相关研究的进行。为了对松萝凤梨更深入的研究，必须找到一种高效、快捷而又经济的松萝凤梨细胞核悬液制备方法，这样才能更有利于松萝凤梨相关研究的开展。

【发明内容】

[0004]本发明目的是提供一种适用于流式细胞仪分析的松萝凤梨细胞核悬液，该方法高效、快捷、经济。
[0005]本发明采用的技术方案是:
一种松萝凤梨细胞核悬液制备方法，步骤如下:
1)取松萝凤梨嫩叶50mg，置于塑料培养皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由终浓度如下的组分组成:21g/L —水柠檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及体积浓度0.5%吐温20 ；
2)使用刀片在提取液中切碎松萝凤梨嫩叶，然后收集提取液经350目尼龙网过滤，获得松萝凤梨细胞核悬液。
[0006]在步骤2)所述的松萝凤梨细胞核悬液中加入DNA突光染料碘化丙锭(propidiumiodide ,终浓度为50 μ g/ ml)，及Rnase (终浓度为50 μ g/ ml)，染色后的提取液用于流式细胞仪的检测。
[0007]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在于:
1)最大限度地减少了有害试剂的使用，如巯基乙醇，减轻了提取液对人体的危害；
2)提取液成分简单，只有三种，均为常规实验室试剂，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；
3)步骤简单，无需离心，节省了时间提高了效率，可以在短时间内获得细胞核悬液用于流式细胞仪检测；
4)可获得较高质量细胞核悬液用于流式细胞仪检测。【专利附图】

【附图说明】
[0008]图1采用本发明制备的松萝凤梨细胞核悬液流式细胞仪分析直方图；
图2采用LBOl法制备的松萝凤梨细胞核悬液流式细胞仪分析直方图。
【具体实施方式】
[0009]下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此: 实施例1
一、试剂的配置
O细胞核提取液配置:称取2.1g—水柠檬酸、Ig聚乙烯吡咯烷酮K-30于一干净的250ml烧杯中，加入体积0.5 ml吐温20 ;加超纯水定容到100ml。用0.22微米滤膜过滤后
4度保存备用。
[0010]2)突光染料配置:称取25mg碘化丙锭、25mg核糖核酸酶于一干净的250ml烧杯中加超纯水定容到50ml。用0.22微米滤膜过滤后4度保存备用。
[0011]二、松萝凤梨细胞核悬液提取方法
(I)取松萝凤梨嫩叶(约50 mg)，置于塑料培养皿中加入I ml提取液。(2)使用锋利剃须刀片在提取液中切碎叶片；(3)收集提取液经350目尼龙网过滤，获得松萝凤梨细胞核悬液；(4)过滤后的提取液中加入DNA荧光染料碘化丙锭(终浓度为50 μ g/ ml)及Rnase(终浓度为SOyg/ ml)。染色后的提取液上流式细胞仪检测。
[0012]松萝凤梨细胞核悬液的流式细胞仪检测
采用Quanta SC流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司),在488 nm激光的激发下发出桔红色荧光，由FL2通道检测出荧光强度。从随机软件CellLab Quanta SC获取数据，并通过ModFit LT软件显示直方图(横坐标以DNA相对含量反映突光曲线的面积纵坐标为细胞核次数)，结果见图1。本发明制备的松萝凤梨细胞核悬液不仅适用Quanta SC流式细胞仪，也适用于FACSCalibur (美国Becton-Dickinson公司)等目前市场是所有具有488nm激光器的流式细胞仪。
[0013]对比例1:采用已报道的 LBOl 法(Dolezel J, Binarova P, Lucretti S.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.BiologiaPlantarum 1989，31: 113 - 120)提取松萝凤梨细胞核悬液经流式细胞仪检测的直方图，结果见图2。无明显荧光峰，碎片较多，无法用于相关研究。
【权利要求】
1.一种松萝凤梨细胞核悬液制备方法，其特征在于，步骤如下: 1)取松萝凤梨嫩叶50mg，置于塑料培养皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由终浓度如下的组分组成:21g/L —水柠檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及体积浓度0.5%吐温20 ； 2)使用刀片在提取液中切碎松萝凤梨嫩叶，然后收集提取液经350目尼龙网过滤，获得松萝凤梨细胞核悬液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)所述的松萝凤梨细胞核悬液中加入DNA突光染料碘化丙锭(propidium iodide ,终浓度为50 μ g/ ml),及Rnase(终浓度为50 μ g/ ml),染色后的提取液用于流式细胞仪的检测。
【文档编号】G01N1/30GK103940656SQ201410115860
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】金亮, 郁永明, 李小白, 沈福泉, 俞信英, 沈晓岚, 丁华侨, 王炜勇 申请人:浙江省农业科学院花卉研究开发中心