溪黄草药材hplc指纹图谱的建立及其指纹图谱的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种溪黄草药材指纹图谱的建立及其指纹图谱，涉及中药药材的质量控制方法，具体是建立HPLC指纹图谱以检测溪黄草药材提取液的方法。本发明步骤为，对照品溶液的制备；提取溶剂与方法的选择；样品溶液的制备；色谱条件考察：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为0.1%～0.3%乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：25～40℃，紫外检测波长为230～270nm，时间100～120min；不同品种溪黄草药材HPLC指纹图谱测定；特征峰的标记与参照峰的选择。本发明的有益效果：解决溪黄草的入药基源争议。综合运用了指纹图谱的共有峰比较、聚类分析和特有峰分析等方法对三个品种溪黄草HPLC指纹图谱进行鉴别，实现对溪黄草药材的基源鉴别，划分了产地归类，为溪黄草药材的质量控制、临床正确使用提供依据。
【专利说明】溪黄草药材HPLC指纹图谱的建立及其指纹图谱
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药药材的质量控制方法，具体涉及溪黄草药材高效液相色谱法指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。
【背景技术】
[0002]溪黄草原植物为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Isodon 1phanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara.的干燥地上部分。主产于长江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、广东、广西、福建等省区。性味苦、甘、寒，归肝、胆经，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效，用于治疗湿热黄疸、湿热泻痢、跌打瘀痛、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎等疾病。
[0003]溪黄草为华南地区民间习用草药。溪黄草作为清肝利胆药在广东大部分地区民间有着很长的使用历史。民间和历代名医把溪黄草用作清热祛湿、利胆退黄药，治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎，为预防和治疗肝胆疾病的常用药。
[0004]现作商品“溪黄草”入药的除线纹香茶菜外，还有同属植物狭基线纹香茶菜R.1ophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) Hara var.gerardiana (Benth.) Hara、纤花香茶菜R.1ophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) Hara var.gracilifl ora (Benth.) Hara 和溪黄草R.serra(Maxim.)Hara0广东部颁标准和国家药典2010版(附录)对溪黄草的基源收载以及学者间都存在争议。中药溪黄草来源复杂，同名异物、品种混乱普遍，且这类植物外形类似，开花前和干品都不易鉴别。为保证和提高药材质量，促进中药标准化，在研究过程中应重视对所用药材作基源鉴定；并应对多来源药材在鉴定、化学、药理和临床进一步比较研究，以便在各种药材之间找出功效、主效异同点，为临床用药的安全、有效提供准确可靠的依据。

【发明内容】

[0005]本发明的目的为溪黄草药材的质量控制和真伪鉴别提供一个新的方法，通过建立溪黄草药材指纹图谱的方法，并由此方法得到溪黄草药材共有模式的指纹图谱。
[0006]为达到本发明的目的所采用的技术方案:用高效液相色谱法建立溪黄草药材指纹图谱的方法，具体包括如下步骤:
①、对照品溶液的制备:精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为
0.115mg/mL的混合对照品溶液。；
②、样品溶液的制备:精密称定溪黄草药材粉末，精密加入50%乙醇20mL，称摇匀，滤过，作为供试品溶液；
③、色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为230?270nm ；
④、测定:精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
[0007]进一步优选的方法可以通过下述步骤实施:
①、对照品溶液的制备:精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为
0.115mg/mL的混合对照品溶液。；
②、样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22 μ m微孔滤膜滤过，作为样品溶液；
所述步骤；
③、色谱条件，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为
0.1%?0.3%乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，柱温:25?40°C，紫外检测波长为230?270nm，时间 100 ?120min ；
④、测定，采用精密吸取样品溶液10?20μ L注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
[0008]本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施:
步骤②样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g,精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22 μ m微孔滤膜滤过，作为样品溶液；步骤③色谱条件中流动相为0.3%乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，流速为0.8mL/min，柱温:30°C，紫外检测波长为254nm,分析时间 120min ；
在步骤③中，所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行:
O分钟时，流动相A为8%的乙腈溶液、流动相B为92%的0.3%的磷酸溶液；
5分钟时，流动相A为12%的乙腈溶液、流动相B为88%的0.3%的磷酸溶液；
30分钟时，流动相A为18%的乙腈溶液、流动相B为82%的0.3%的磷酸溶液；
60分钟时，流动相A为23%的乙腈溶液、流动相B为77%的0.3%的磷酸溶液；
80分钟时，流动相A为50%的乙腈溶液、流动相B为50%的0.3%的磷酸溶液；
100分钟时，流动相A为70%的乙腈溶液、流动相B为30%的0.3%的磷酸溶液；
120分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液、流动相B为10%的0.3%的磷酸溶液。
[0009]具体见下表:
【权利要求】
1.一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤: ①、对照品溶液的制备:精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为0.115mg/mL的混合对照品溶液； ②、样品溶液的制备:准确称定溪黄草药材粉末，精密加入50%乙醇20mL，摇匀，滤过，作为供试品溶液； ③、色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为230~270nm ； ④、测定:精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于: 所述步骤②样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22 μ m微孔滤膜滤过，作为供试品； 所述步骤③色谱条件，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-0.1%~0.3%磷酸组成的梯度洗脱液，柱温:25~40°C，紫外检测波长为230~270nm，时间 100 ~120min ； 所述步骤④测定，采用精密吸取样品溶液10~20 μ L注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
3.根据权利要求1所述的一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于: 所述步骤②样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g,精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22 μ m微孔滤膜滤过，作为样品溶液； 所述步骤③色谱条件中流动相为乙腈-0.3%磷酸组成的梯度洗脱液，流速为0.SmL/min，柱温:30°C，紫外检测波长为254nm，分析时间120min。
4.根据权利要求2或3所述的一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于: 所述步骤③色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行: O分钟时，流动相A为8%的乙腈溶液、流动相B为92%的0.3%的磷酸溶液； 5分钟时，流动相A为12%的乙腈溶液、流动相B为88%的0.3%的磷酸溶液； 30分钟时，流动相A为18%的乙腈溶液、流动相B为82%的0.3%的磷酸溶液； 60分钟时，流动相A为23%的乙腈溶液、流动相B为77%的0.3%的磷酸溶液； 80分钟时，流动相A为50%的乙腈溶液、流动相B为50%的0.3%的磷酸溶液； 100分钟时，流动相A为70%的乙腈溶液、流动相B为30%的0.3%的磷酸溶液； 120分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液、流动相B为10%的0.3%的磷酸溶液。
5.一种溪黄草药材的指纹图谱，其特征在于: 溪黄草药材指纹图谱的建立，具体包括如下步骤 ①、对照品溶液的制备:精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为0.115mg/mL的混合对照品溶液； ②、样品溶液的制备:精密称定溪黄草药材粉末，精密加入50%乙醇20mL，摇匀，滤过，作为供试品溶液； ③、色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为230~270nm ； ④、测定:精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
6.一种溪黄草药材的指纹图谱，其特征在于:通过高效液相色谱仪获得的指纹图谱是联合运用色谱峰保留时间(t)和二极阵列检测器采集各色谱峰紫外光谱(UV)确定4个特征峰(见图2和图3);其中，S4号峰(迷迭香酸)的峰高最高(见图1)，且均为4个品种溪黄草药材均含有的色谱峰，峰面积最大，与相邻峰分离度较好，在测定时比较稳定，因此选作参照峰；咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸均为线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜和纤花线纹香茶菜共有的色谱峰(分别为2-Sl、3-S2、5-S3、9-S4峰)，而溪黄草仅有咖啡酸和迷迭香酸峰(分别为3-S1U5-S4峰)；指纹图谱中特征峰的差异可作为区别溪黄草与正品线纹香茶的标准。
【文档编号】G01N30/02GK103776926SQ201410008547
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】赖小平, 黄松, 蒋东旭 申请人:东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院