专利名称：一种快速微量检测鲜河鲀血液中ttx反相离子对hplc法的制作方法
技术领域：
本发明属于河飩鱼河飩毒素检测技术领域，具体涉及鲜河飩毒素微量快速高效检测技术与河飩鱼安全食用技术应用领域。
背景技术：
我国现在食用的河飩鱼都属于东方飩(I^akifugu )，是飩科("Tetrodanti dae )的一个属，该属鱼类全世界约有20余种，绝大多数分布于中、日近海，其肉味之美，有“鱼中之王”的美誉，在我国沿海城市以及日本、韩国等地深受消费者欢迎，具有很高的经济价值。 现已成为我国沿海地区的重要人工养殖对象。但因该鱼类含有“河飩毒素”(Tetrodoxin TTX)，但在其美味的诱惑下，连日本食用河飩盛行、而且法规制度严格，每年仍有因吃河飩中毒事件发生。我国民间早就有“拼死吃河飩”的传说，特别是在具有千百年饮食河飩鱼历史文化、已成为我国最大的河飩鱼消费地，具有“河飩之乡”美誉的江苏省扬中地区，也偶有误食有毒河飩而中毒事件发生。东方飩属鱼类皆有毒性，但其毒力大小，不仅随河飩鱼种类、个体、而且在河飩鱼不同组织器官，毒性皆有很大差别，河飩鱼的卵巢、肝脏(特别是繁殖期个体)、血液毒性最强，肠、精巢和皮肤次之，肌肉毒力最弱。因肌肉仅含微量毒素 (<5mu/g小鼠单位)的红鳍东方飩、假睛东方飩、暗纹东方飩、菊黄东方飩等几种则成为高经济价值的重要食用飩类。河飩毒素是一种毒性很强的神经毒素，主要表征是TTX能过与钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动作电位导致与之相关的生理活动障碍，主要是神经肌肉麻痹。毒素作用于脑干、运动神经、感觉神经和植物神经系统而引起中枢神经、肌肉神经、心血管和胃肠道功能障碍等临床特征。呼吸中枢麻痹而导致突然呼吸停止是TTX致死的直接原因之一。目前还没有有效的解毒剂。河豚毒素的化学性质稳定， 一般的烹饪手段难以破坏。为了确保食用者的安全，同时又能享受河飩美味佳肴，建立快速微量检测河飩中TTX的方法，可避免消费者食用有毒河飩导致中毒的事件发生。检测河豚毒素方法很多各有其优缺点，大致分为生物检测法、仪器分析法、免疫化学法等，其中采用仪器检测TTX分析法最多。但目前主要采用带有荧光检测器与柱后衍生的液相色谱仪与液相色谱-串联四极杆质谱仪的国家标准《水产品中河豚毒素测定液相色谱-荧光检测法》和酶联免疫法检测的国家标准《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》。因液-质联用的检测方法，质谱设备昂贵在国内普及率不高，检测成本很高(仅所需TTX标准品10mg， 进口 TTX 4500元/lmg，IOmg量就需45000元)，难以普及应用。酶联免疫法特异性强、检测灵敏高，但是检测过程繁杂、周期长(需近2天工作日)、难以掌握、试剂盒成本高，也难以普遍推广应用。由于现行采用的检测方法主要采用河飩鱼肌肉与肝脏样品，前处理过程复杂、 耗时耗材、TTX回收率较低，而且在分析检测时常受样品中杂质干扰，极易造成TTX假阳性结果，因而仍不能满足实际应用的需求。我国拥有丰富的河飩鱼类资源，为了保障食用者的安全，国家目前禁止河飩鱼的食用与销售，仅在部分地区开设少数试食点，因而造成了这一资源的极大浪费。目前国际市场上河飩的价格很高，因此国内一些水产部门迫切希望开放河飩鱼的经营，同时国内人工养殖河飩的规模也很大，因此迫切需要修订、完善原有管理办法，做到既发挥河飩资源在促进经济发展中的作用，又保障消费者的身体健康。因此，急需建立一种先进的以科学、可靠、 简便、快速、经济、实用为基础的河飩毒素检测方法。

发明内容
本发明克服了河飩鱼血液样品难以采集的技术难题；建立一种新的快速微量检测鲜河飩血液样品中河飩毒素(Tetrodoxin TTX)含量的反相离子对高效液相色谱法；利用该法检测结果判断鲜河飩是否可以安全食用。为河飩鱼的安全食用等方面提供了科学依据和新的检测手段。本发明的目的在于改进传统的仅以河飩鱼肌肉与肝脏作为检测TTX样品的方法， 而以河飩鱼血液作为检测TTX样品，减化样品前处理耗时耗材的操作步骤，减少检测成本， 不需高昂的检测设备，达到适用于基层检测中心高效快速微量检测TTX目的。为河飩鱼的安全食用提供准确定性定量依据。本发明的基本原理(1) TTX对人体的最低致死量为0. 5mg。理论上计算即一个人食用一条500g的河飩鱼，只要在河飩样品中检出TTX含量超过1 μ g/g则不可食用。利用河飩鱼血液TTX含量高于肌肉的特性；如在河飩血液样品中检出TTX含量低于0. 5 μ g/ mL则可安全食用，以其作为鲜河飩鱼安全食用的检测指标较为科学合理。(2)河飩毒素与庚烷磺酸钠形成离子对后可在UV200nm处检测；(3)河飩毒素为弱碱性，当与庚烷磺酸钠形成离子对后在反相色谱柱能很好的分离；(4)根据检测TTX标准品的保留时间和峰面积，可对所检测样品中TTX准确定性定量分析；(5)根据检结果即可判断河飩鱼是否可以安全食用。本发明所述快速微量检测鲜河飩血液中TTX反相离子对HPLC法，包括以下5个步骤1.鲜河飩鱼血液样品采集与前处理；2.配制流动相；3.配制标准样品；4.设置色谱分析条件；5.进样检测分析与结果判断。所述步骤1，鲜河飩鱼血液样品采集与前处理鲜河飩鱼血液样品采集与前处理 以无菌注射器吸取约50 μ L肝素钠注射液，于解剖的河飩腹腔动脉吸取血样ImL于1. 5mL 离心管中，离心IOmin后取0. 5mL上清液过SupeLcLean LC-18柱，所述SupeLcLean LC-18 柱使用前分别用3mL甲醇、3mL 0. 2%乙酸活化，流速lmL/min ；然后用0. 75mL 0. 2%乙酸淋洗C18小柱，合并两次收集液于1. 5mL离心管中13000rpm/min离心lOmin，取1. OmL上清液于做好标记的样品瓶中待分析。所述步骤2，配制流动相50mmol/L磷酸二氢铵、lOmmol/L庚烷磺酸钠分别用磷酸将pH调至4. 0后用0. 22 μ m滤膜过滤；分别量取磷酸二氢铵和庚烷磺酸钠溶液890mL与 HPLC级的乙腈IlOmL,合并混勻后超声波脱气。 所述步骤3，配制标准样品配制100 μ g/mL TTX标准储备液。取Img TTX冻干标准品加纯水溶解定容到10mL，4°C贮存。取标准储备液，加纯水分别配制成浓度为0. 2μ g/ mL>0. 5μ g/mLU. 0μ g/mL>5. 0μ g/mLUO. 0μ g/mL>50. 0μ g/mLU00. 0μ g/mL 的梯度标准工作液。所述步骤 4，色谱条件色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2. 7 μ m ；流动相11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氢铵-10mmol/L庚烷磺酸钠(pH 4. 0)(V/V)；进样量20 μ L ；柱温250C ；检测波长200nm ；流速0. 6mL/min。所述步骤5，进样分析检测，根据色谱工作站获得的TTX标准曲线，对目标样品进行定性定量分析，检测结果TTX含量<0. 5 μ g/mL判断河飩鱼可以安全食用。本发明主要特点体现在7个方面1.以鲜河飩鱼血液作为TTX检测样品，大幅减少了样品前处理的复杂步骤和所需时间、耗材，既简便又快速(如按常规鲜河飩鱼肌肉或肝脏样品方法检测，仅前处理10个样品，因工作量大，操作步骤复杂，就需耗时8 10小时； 而检测10个血液样品从采样、样品前处理到完成分析仅需2. 5小时左右)；2.检测方法线性好，0. 2 μ g/mL 100 μ g/mL的范围内峰面积与测定浓度呈良好的线性关系，相关系数 ^=0. 99999 ；3.显著提高检测方法准确度，TTX的回收率达到95%以上，7P5ZK2. 09% ；4.方法重现性好，TTX检测峰的保留时间7 5ZK0.007%，TTX检测峰的含量7Ρ5ΖΧ1. 0828 ；5.最低检测限为0. 135 μ g/mL Wn= ,. 1)；最低定量限约为0. 5 μ g/mL (5//7=11. 7)可满足河飩鱼安全食用的检测需求；6.与现行TTX检测方法相比无需昂贵的质谱仪或荧光检测器、柱后衍生装置(荧光检测法，用4N NaOH 100°C的条件将TTX水解成C9碱进行检测，虽然检测灵敏度高，但仪器长时间在高温、强碱性条件下使用，很容易腐蚀荧光检测器)，具有操作简单、 快速、定性定量准确、适合基层检测单位应用；7.减少了检测人员的工作量，节省了检测费用。本发明为检测河飩鱼TTX提供了新的检测手段，为安全食用鲜河飩鱼提供了科学依据，使消费者不再为享用河飩美味时而为“拼死吃河飩”担忧。同时将为进一步修订、完善原有管理办法、促进河飩开禁、推动河飩经济产业、河飩饮食文化的发展发挥重要作用。


图1 检测TTX标准样品7种浓度线性色谱图。图2 :TTX检测方法线性范围与方程。
3 =TTX 最低检测限 s/n=3. 3 浓度 0. 135 μ g/mL。图4 =TTX 最低定量限 s/n=ll. 7 浓度 0. 5 μ g/mL。图5 菊黄东方飩血液对照样品与加三种浓度TTX标样后血液样品的色谱图。
具体实施例方式本发明具体检测TTX实例如下 1仪器与材料
1.1 仪器 Agilent HPLC 1100 Series(美国安捷伦1100高效液相色谱仪):QuatPump G1311A (四元泵)、DEGASSER G1379A (脱气装置)、DAD G1315B (二级管阵列检测器)、C0LC0M G1316A (柱温控制器)、ALS G1313A (自动进样器)、Agilent HPLC 1100化学工作站。台式离心机(美国Thermos)、循环水式多用真空泵、电子天平、旋涡振荡器、固相萃取装置。耗材SupeLcLean LC-18 SPE Tubes 3mL/500mg (美国 SUPELC0)，2mL —次性使用无菌注射器。药品与试剂纯度为85%河飩毒素标准品Img (河北省水产研究所)；纯度为98. 5% 河飩毒素标准品Img (上海洽姆仪器科技有限公司)；乙腈HPLC级；磷酸二氢铵分析纯；乙酸分析纯；甲醇HPLC级；肝素钠注射液2mL 12500单位。
实验材料人工养殖暗纹东方飩、菊黄东方飩 2实验方法
2.1 试剂配制0. 2%醋酸水溶液；流动相50mmol/L磷酸二氢铵-lOmmol/L庚烷磺酸钠(用磷酸将PH调至4. 0后用0. 22 μ m滤膜过滤);100 μ g/mL TTX标准储备液(标品TTX Img 溶于IOmL纯水，4°C保存)；梯度标准工作液(取TTX储备液分别配制成0. 2 μ g/mL、0. 5 μ g/ mL>1. 0 μ g/mL>5. 0 μ g/mL、10. 0 μ g/mL>50. 0 μ g/mL、100. 0 μ g/mL)。色谱条件色谱柱AgilentPoroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2· 7 μ m ；流动相11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氢铵-IOmmol/L庚烷磺酸钠CpH 4. 0)；进样量20 μ L ； 柱温25 °C ；检测波长200nm ；流速0. 6mL/min。样品前处理以无菌注射器吸取约50 μ L肝素钠注射液，于解剖的菊黄东方飩腹腔动脉吸取血样ImL于1. 5mL离心管中，离心IOmin后取0. 5mL上清液过SupeLcLean LC-18 柱(使用前分别用3mL甲醇、3mL 0. 2%乙酸活化，流速lmL/min)，后用0. 75mL 0. 2%乙酸淋洗C18小柱，合并两次收集液于1. 5mL离心管中13000rpm/min离心lOmin，取1. OmL上清液于做好标记的样品瓶中待分析。结果与分析 3.1色谱条件确定
3.1. 1固定相的确定以8 5 %纯度T T X标准品进样，在流动相、柱温、U V检测波长以及流速都不变的条件下，通过对85%纯度TTX标品与杂质的分离度以及保留时间对比，对 Agilent ZORBAX SB-C18 4. 6mm X 250mm 5ym，Beckman ULTRASPHRE-ODS C18 4. 6mmX250mm 5 μ m ,Waters Symmetry C18 4. 6mmX 250mm 5 μ m ,Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2. 7 μ m四种固定相进行选择。结果表明使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2.7 μ m作为固定相，可将85%纯度TTX标准品与相邻的杂质峰有效分离。且色谱峰的对称性较好。流动相的确定以Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm 2.7 μπι 作为固相，在柱温、流速、UV检测波长均不变的条件下，通过对乙腈-乙酸铵、乙腈-0. 1%甲酸、 50mmol/L磷酸二氢铵-10mmol/L庚烷磺酸钠、50mmol/L磷酸氢二钠-5mmol/L磷酸二氢钠-庚烷磺酸钠5mmOl/L[、0. 05mol/L磷酸氢二钠-0. 05mol/L磷酸二氢钠-庚烷磺酸钠 2. 5mmol/L、乙腈-磷酸二氢铵-庚烷磺酸钠六种流动相以及pH对样品的分离度与保留时间的影响，最终确定以11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氢铵-lOmmol/L庚烷磺酸钠(磷酸调 PH 4.0)为色谱流动相，可将85%纯度TTX标准品与相邻的杂质峰有效分离，而且流动相中含有>10%有机相对反相色谱柱有较好的保护作用。柱温的确定在流动相、流速和检测波长固定的条件下，观察200C、25°C、30°C时柱温对色谱柱分离TTX与杂质效果的影响，当柱温升高TTX与杂质分离效果降低，保留时间缩短，柱温降低分离度增加，但保留时间延长。柱温为25°C时，色谱柱对TTX与杂质分离较好， 柱压为160bar左右，样品分析时间可在IOmin内完成。
3. 1.4检测波长的确定在固定相、流动相、流速、柱温下确定的条件下，分别比较 196nm、198nm、200nm、204nm、205nm检测波长下对分离TTX的响应值影响，结果表明以200nm 为检测波长时信噪比较好，色谱积分准确。流速的确定在固定相、流动相、柱温、检测波长确定的条件下，分别比较0.5mL/min、0. 6 mL/min、0. 7 mL/min、0. 8 mL/min、0. 9 mL/min 流速条件长下对分离 TTX 与杂质分离度的影响，结果表明以0. 6 mL/min流速条件下TTX与杂质能较好的分离，色谱积分准确， 检测河飩样品时色谱图较好。方法评价
3. 2. 1 方法线性范围与检测限取纯度98. 5%TTX标准品用纯水配制成0. 2 μ g/mL、 0. 5μ g/mLU. 0μ g/mL、5· 0 μ g/mL、10. 0 μ g/mL、50. 0 μ g/mL、100. 0 μ g/mL 7 种浓度的标准溶液，以TTX进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，化学工作站给出面积-浓度标准曲线。结果表明在0. 2 μ g/mL 100 μ g/mL的范围内峰面积与测定浓度呈良好的线性关系(图 1)，相关系数#=0. 99999 (图2)。运用该方法检测TTX标准品，当浓度为0. 135 μ g/mL时， 化学工作站计算信噪比为3. 3，浓度为0. 5 μ g/mL时，化学工作站计算信噪比为11. 7，因此， 本法的最低检测限约为0. 135 μ g/mL (图3)，最低定量限约为0. 5 μ g/mL (图4)。方法重现性配制TTX样品检测液低、中、高三种浓度，即0.2 μ g/mL,5.0 μ g/ mL、100. 0 μ g/mL三种浓度，每个浓度做3个平行，用本方法，经连续五天的检测，统计检测 TTX含量与保留时间，并计算标准偏差，结果见表1。
权利要求
1.一种快速微量检测鲜河飩血液中TTX反相离子对HPLC法，依次包括下列步骤(1) 鲜河飩鱼血液样品采集与前处理；( 配制流动相；C3)配制标准样品；(4)设置色谱分析条件；(5)进样检测分析与结果判断。
2.根据权利要求1中所述的快速微量检测鲜河飩血液中TTXHPLC法，(1)鲜河飩鱼血液样品采集与前处理以无菌注射器吸取约50 μ L肝素钠注射液，于解剖的河飩腹腔动脉吸取血样ImL于1. 5mL离心管中，离心IOmin后取0. 5mL上清液过SupeLcLean LC-18柱， 所述SupeLcLean LC-18柱使用前分别用3mL甲醇、3mL 0. 2%乙酸活化，流速lmL/min ；然后用0. 75mL 0. 2%乙酸淋洗C18小柱，合并两次收集液于1. 5mL离心管中13000rpm/min离心 lOmin，取1. OmL上清液于做好标记的样品瓶中待分析。
3.根据权利要求1中所述的快速微量检测鲜河飩血液中TTXHPLC法，其特征在于所述步骤⑵配制流动相50mmol/L磷酸二氢铵、lOmmol/L庚烷磺酸钠分别用磷酸将pH调至 4. 0后用0. 22 μ m滤膜过滤；分别量取磷酸二氢铵和庚烷磺酸钠溶液890mL与HPLC级的乙腈IlOmL,合并混勻后超声波脱气。
4.根据权利要求1中所述的快速微量检测鲜河飩血液中TTXHPLC法，其特征在于步骤 (4)色谱条件色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18 4. 6mmX 150mm2. 7 μ m ；流动相 11%乙腈-89% 50mmol/L磷酸二氢铵-10mmol/L庚烷磺酸钠(V/V)，pH 4. 0 ；进样量20 μ L ； 柱温25 °C ；检测波长200nm ；流速0. 6mL/min。
全文摘要
本发明属于河鲀鱼河鲀毒素检测技术领域，具体涉及一种快速微量检测鲜河鲀血液中TTX反相离子对HPLC法，该方法包括下列步骤(1)鲜河鲀鱼血液样品采集与前处理；(2)配制流动相；(3)配制标准样品；(4)设置色谱分析条件；(5)进样检测分析与结果判断。本发明方法与现行TTX检测的国家标准等方法相比具有取样简便、样品制备简单、省时快速、检测成本低，微量、定性定量准确度高，重现性好，无需质谱或其它高昂设备、易于基层检测中心推广应用等特点，为安全食用鲜河鲀提供又一新的检测手段和科学依据，必将为促进我国河鲀开禁、推动河鲀产业、河鲀饮食文化的发展发挥重要作用。
文档编号G01N30/02GK102445509SQ20111031750
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者何百彩, 刘子列, 尹绍武 申请人:南京师范大学, 扬中市河豚协会