专利名称：狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法
狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法技术领域：
本发明涉及用于检测作为抗磷脂抗体综合征的责任抗体之一的狼疮抗凝物的试剂盒。本发明还涉及判断从受试者得到的待测样品中的狼疮抗凝物的存在与否的方法。
背景技木抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome ;以下称之为“APS”)是血中有抗磷脂抗体，呈动静脉血栓症及习惯性流死产等的临床症状的疾病组的总称(參照吉田美香等，日本检查血液学会杂志.2008、9(1) :69-76)。抗磷脂抗体(antiphospholipidantibodies ;以下称之为“aPL”)是结合到磷脂、或者，磷脂和蛋白质的复合物的自身抗体的总称(參照渥美达也、日本血栓止血学会志· 2008、19 (3) :329-332)。
在aPL中有各种各样的抗体，根据该抗体识别的磷脂或磷脂结合蛋白质赋予抗体的名称。在aPL中，可例举抗心磷脂抗体(anti-cardiolipin antibodies ;aCL)、抗β2糖蛋白I抗体(anti-β 2glycoprotein I antibodies ;aβ 2GPI)、磷脂酰丝氨酸依赖性抗凝血酶原饥体(phosphatidylserine-dependent anti-prothrombin antibodies ；aPS/PT)、狼疮抗凝物(lupus anticoagulant ;以下也称为 “LA”)。aCL、a β 2GPI、aPS/PT 用酶免疫測定法(ELISA)检测，LA用磷脂依赖性凝固时间的延长检测(參照家子正裕等，日本血栓止血学会志· 2007、18 (3) :226-233)。LA被定义为“不抑制每种凝固因子活性，抑制磷脂依赖性的血液凝固反应的免疫球蛋白”，被认为在磷脂依赖性的凝固反应中抑制磷脂自体的自身抗体。现在，LA的检查基准如下(I)在测定活化部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastintime :APTT)、稀释鲁塞尔蜂蛇毒时间(dilute Russel vipervenom time dRVVT)及高岭土凝固时间(kaolin clotting time KCT)等的磷脂依赖性凝固时间的筛选检查中确认凝固时间的延长，(2)即便进行与健康人血浆的混合试验，凝固时间的延长也不改善，(3)通过过量的磷脂的添加确认凝固时间的缩短(磷脂依赖性的确认试验)。最后，通过除外凝固因子的抑制剂等的明显的凝固异常、及，肝素等的抗凝固剂的影响，诊断受试者是LA阳性(參照吉田美香等，日本检查血液学会杂志，2008、9(1)69-76)。作为那样的LA的磷脂依赖性的确认试验之一，有分别使用以低浓度含磷脂的凝固时间测定试剂及以高浓度含磷脂的凝固时间测定试剂来測定凝固时间，通过基于从各试剂得到的凝固时间的比确认凝固时间磷脂浓度依赖性的延长，确认待测样品中的LA的存在的方法。本发明人至今完成了可通过调节试剂中含的磷脂的组成来高灵敏度检测LA的试剂盒(參照 U. S. Patent Publication No. 2004/0091952, U. S. Patent PublicationNo. 2005/0175983，及，特开 2006-133002 号公报)。
虽然也可根据上述的方法检测LA，但有即便使用含高浓度的磷脂的试剂也无法确认凝固时间的延长的情況。即，在以往的方法中，有即便是LA阳性待测样品，凝固时间的比与阴性待测样品示同程度的值的情況，因此难以明确地区分LA阳性的待测样品组和阴性的待测样品组。

发明内容本发明的范围仅 由随附的权利要求定义，且不以任何程度受此发明内容部分的影响。本发明人发现，通过使用含碱金属盐的凝固时间测定试剂，可抑制由LA的凝固时间的延长，可明确地区分LA阳性的待测样品组和阴性的待测样品组，从而完成本发明。SP，本发明是(I)狼疮抗凝物检测用试剂盒，其包括第I凝固时间测定试剂；及第2凝固时间测定试剂；其中第I凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂之中至少一方含碱金属盐。(2) (I)所述的检测用试剂盒，其中上述第I凝固时间测定试剂含碱金属盐，上述第2凝固时间测定试剂含相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度的碱金属盐，或者，不含碱金属盐。(3)⑴或⑵所述的检测用试剂盒，其中上述第I凝固时间测定试剂含磷脂，上述第2凝固时间測定试剂以相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度含磷脂。(4)⑴或⑵所述的检测用试剂盒，其中上述碱金属盐是无机酸的碱金属盐。(5)⑴或⑵所述的检测用试剂盒，其中上述碱金属盐是钠盐或钾盐。(6)⑴或⑵所述的检测用试剂盒，其中上述第I凝固时间测定试剂及上述第2凝固时间测定试剂含活化剂。(7) (6)所述的检测用试剂盒，其中上述活化剂选自鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅。(8) (3)所述的检测用试剂盒，其中上述磷脂是选自下列的至少I种的磷脂磷脂酰こ醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸。(9)⑴或⑵所述的检测用试剂盒，其还包括含钙盐的第3凝固时间测定试剂。(10)判断狼疮抗凝物的存在与否的方法，其包括将从受试者采集的待测样品和含碱金属盐的第I凝固时间测定试剂混合，測定第I凝固时间；将上述待测样品和含相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度的碱金属盐，或者不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂混合，測定第2凝固时间；及基于测定的第I凝固时间及第2凝固时间，判断上述待测样品中是否含狼疮抗凝物。(11) (10)所述的判断方法，其中在上述判断步骤中，通过比较基于上述第I凝固时间及第2凝固时间得到的值和指定的阈值，判断上述待测样品中是否含狼疮抗凝物。(12) (10)或(11)所述的判断方法，其中上述第I凝固时间测定试剂含磷脂，上述第2凝固时间測定试剂以相比上述第I 凝固时间测定试剂更低浓度含磷脂。(13) (10)或(11)所述的判断方法，其中上述碱金属盐是无机酸的碱金属盐。(14) (10)或(11)所述的判断方法，其中上述碱金属盐是钠盐或钾盐。(15) (10)或(11)所述的判断方法，其中上述第I凝固时间测定试剂及上述第2凝固时间测定试剂含活化剂。(16) (15)所述的判断方法，其中上述活化剂选自鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅。(17) (12)所述的判断方法，其中上述磷脂是选自下列的至少I种的磷脂磷脂酰こ醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸。通过本发明的LA检测用试剂盒，可抑制由LA的凝固时间的延长，从而可明确地区分LA阳性待测样品组和阴性待测样品组。另外，通过本发明的判断狼疮抗凝物的存在与否的方法可正确地判断从受试者得到的待测样品中是否含LA。

图I是示从使用含作为碱金属盐含氯化钠的第I凝固时间测定试剂和不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂的本发明的LA检测用试剂盒測定的凝固时间算出的LA阴性待测样品及LA阳性待测样品的狼疮比率的分布的分布图。图2是示从使用含作为碱金属盐含氯化钾的第I凝固时间测定试剂和不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂的本发明的LA检测用试剂盒測定的凝固时间算出的LA阴性待测样品及LA阳性待测样品的狼疮比率的分布的分布图。图3是示从使用含作为碱金属盐含硫酸钠的第I凝固时间测定试剂和不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂的本发明的LA检测用试剂盒測定的凝固时间算出的LA阴性待测样品及LA阳性待测样品的狼疮比率的分布的分布图。实施方式以下參照

本发明的优选实施方式。本发明的LA检测用试剂盒是含第I凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂的LA检测用试剂盒，第I凝固时间测定试剂及第2凝固时间测定试剂之中至少一方含碱金属盐。优选是包括含碱金属盐的第I凝固时间测定试剂，和以相比第I凝固时间测定试剂更低浓度含碱金属盐的，或者，不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂的LA检测用试剂盒。接下来，作为本发明的试剂盒，对包括含碱金属盐的第I凝固时间测定试剂，和以相比第I凝固时间测定试剂更低浓度含碱金属盐的，或者，不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂的情况进行说明。本发明的试剂盒的第I及第2凝固时间测定试剂中可含的碱金属盐只要是在适当的溶剂中，优选在各试剂中可含的缓冲液中发生碱金属离子，并且从该碱金属盐发生的阴离子不抑制血液凝固反应的碱金属盐，就不特别限定。那样的碱金属盐而言，用到例如，作为盐酸、硫酸、硝酸等的碱金属盐的，无机酸的碱金属盐。特别是优选使用无机酸的钠盐或钾盐。具体而言，可例举氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钾、硝酸钾等，特别是，优选氯化钠、硫酸钠、氯化钾。碱金属盐是无水物也可，是水和物也可。第I凝固时间测定试剂中的碱金属盐浓度是O. 001 40%、优选是O. 01 10%、更优选是O. I 5%。第2凝固时间测定试剂也可不含碱金属盐，但在第2凝固时间测定试 剂含碱金属盐时，其碱金属盐浓度优选是相比第I凝固时间测定试剂更低浓度。例如，当第I凝固时间测定试剂中的碱金属盐浓度是1%之时，第2凝固时间测定试剂中的碱金属盐浓度可为O. 1%。在本发明的试剂盒中，相对于第I凝固时间测定试剂的第2凝固时间测定试剂的碱金属盐的浓度比值([第2凝固时间测定试剂的碱金属盐浓度]/[第I凝固时间测定试剂的碱金属盐浓度])是O I、优选是O O. 2。在本发明的试剂盒中，为了促进血液凝固，第I凝固时间测定试剂含磷脂，第2凝固时间测定试剂优选以相比该第I凝固时间测定试剂更低浓度含磷脂。那样的磷脂而言，可例举磷脂酰こ醇胺(以下也称为PE)、磷脂酰胆碱(以下也称为PC)及磷脂酰丝氨酸(以下也称为PS)。上述的第I及第2凝固时间测定试剂含选自PE、PC及PS的I种、优选是2种、更优选是全部种的磷脂。第I及第2凝固时间测定试剂中含的磷脂是天然来源磷脂也可，是合成磷脂也可。在它们之中，从升高LA的检测灵敏度的观点来看，也优选合成磷脂或纯化到纯度99%以上的天然来源磷脂。PE、PC及PS的脂肪酸侧链虽然不特别限定，但可例举例如棕榈酸、油酸、硬脂酸等，它们之中优选油酸。第I及第2凝固时间测定试剂的磷脂的含有量是，在将待测样品和第I或第2凝固时间测定试剂等量混合(例如，将待测样品50 μ I和第I或第2凝固时间测定试剂50 μ I混合)来测定凝固时间时则如下。第I凝固时间测定试剂中的磷脂浓度是100 2000 μ g/ml、优选是100 600 μ g/ml,第2凝固时间测定试剂中的磷脂浓度是20 100 μ g/ml、优选是 30 70 μ g/ml。在上述的情况中，第I及第2凝固时间测定试剂作为磷脂含PE、PC及PS之时，第I凝固时间测定试剂中的PE浓度是30 700 μ g/ml、优选是40 300 μ g/ml, PC浓度是50 1000 μ g/ml、优选是 60 500 μ g/ml，PS 浓度是 5 300 μ g/ml、优选是 10 150 μ g/ml。第2凝固时间测定试剂中的PE浓度是I 100 μ g/ml、优选是10 80 μ g/ml，PC浓度是5 200 μ g/ml、优选是20 150 μ g/ml，PS浓度是I 100 μ g/ml、优选是3 50 μ g/ml ο待测样品和第I或第2凝固时间测定试剂的混合比例不是I : I时，将该待测样品和第I或第2凝固时间测定试剂的混合物中的磷脂的终浓度调节到与使用上述的磷脂浓度的各试剂时的混合物相同即可。在本发明的试剂盒中，第I及第2凝固时间測定试剂为了在体外引起血液凝固而再含必要的其他成分也可。那样的其他成分而言，可例举例如活化剂、蛇毒、组织因子、钙盐
坐寸ο活化剂而言，优选使用选自鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅的I种以上。鞣花酸是与金属离子形成鳌合物的状态也可。蛇毒而言，优选使用选自鲁塞尔蝰蛇毒、Textarin蛇毒及Ecarin蛇毒的I种以上。 组织因子而言，优选使用兔脑或人胎盘来源的组织因子或重组型组织因子。上述的其他成分可根据待测样品的凝固时间的測定方法适宜选择。例如，基于活化部分促凝血酶原激酶时间測定的原理測定凝固时间之时，第I及第2凝固时间测定试剂可含活化剂及钙盐。基于鲁塞尔蝰蛇毒时间測定的原理測定凝固时间之时，第I及第2凝固时间测定试剂可含蛇毒及钙盐。基于凝血酶原时间测定的原理測定凝固时间之时，第I及第2凝固时间测定试剂可含组织因子及钙盐。第I及第2凝固时间测定试剂含高岭土及钙盐而，基于高岭土凝固时间測定的原理测定凝固时间之吋，由于待测样品中含的内源性磷脂被用于凝固反应，所以该第I及第2凝固时间測定试剂不含上述的磷脂也可。在本发明的试剂盒中，第I凝固时间测定试剂及第2凝固时间测定试剂含在PH5 10、优选是在pH6 9有缓冲作用的缓冲液也可。那样的缓冲液而言，可例举例如4-(2-羟こ基)哌嗪-I-基こ磺酸(HEPES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、磷酸缓冲液(PBS)等。各试剂中的缓冲液的浓度只要是在临床化学领域一般地使用的浓度即可，可通过简单的重复实验适宜确定。本发明的试剂盒的第I凝固时间測定试剂是在上述的缓冲液中含碱金属盐和上述的磷脂及/或其他成分的溶液或悬浮液的形态的混合物也可。第2凝固时间測定试剂是在上述的缓冲液中含上述的磷脂及/或其他成分，含或不含碱金属盐的，溶液或悬浮液的形态的混合物也可。本发明的试剂盒再含含钙盐的第3凝固时间测定试剂也可。钙盐只要是在适当的溶剂中，优选是在各试剂中含的缓冲液中发生钙离子(Ca2+)的钙盐，就不特别限定，例如可例举氯化钙等。第3凝固时间测定试剂中的钙盐的浓度只要是在上述的第I或第2凝固时间测定试剂和待测样品的混合物中，对于使凝固开始充分的浓度，就不特别限定，但优选是10 40mM。本发明的试剂盒是将第I或第2凝固时间测定试剂和上述的第3凝固时间测定试剂组合的形态也可。即，在本发明的试剂盒中，第I凝固时间测定试剂由含碱金属盐的第I部分试剂和含钙盐的第2部分试剂构成也可，第2凝固时间测定试剂由以相比该第I凝固时间测定试剂更低浓度含碱金属盐或不含碱金属盐的第3部分试剂和含钙盐的第4部分试剂构成也可。接下来，对于判断待测样品中的LA的存在与否的方法(以下也称为本发明的方法)进行说明。再有，在本发明的方法中，适宜地使用上述的本发明的LA检测用试剂盒。
在本发明的方法中，首先，将从受试者采集的待测样品和含碱金属盐的第I凝固时间测定试剂混合而测定第I凝固时间。待测样品而言，使用从受试者得到的血液，但优选是从该血液得到的血浆、更优选是除去血小板的血浆。再者优选是，将从该受试者得到的血浆与正常血浆或除去血小板的正常血浆混合而得到的样品作为待测样品。通过这样的与正常血浆的混合，可防止受试者缺损凝固因子之时的凝固时间的延长，磷脂依赖性血液凝固检查的灵敏度升高。受试者的血楽·和正常血楽·的混合比一般而目是4 : I I : 4,优选是I : I。在本发明的方法中，将上述的待测样品分成2个，将一方用于测定第I凝固时间，将另一方用于测定第2凝固时间。将上述的分成2个的待测样品之一方和第I凝固时间测定试剂混合。该试剂由第I部分试剂和第2部分试剂构成时，将待测样品与第I部分试剂和第2部分试剂的混合物混合也可，将待测样品和第I部分试剂(或者第2部分试剂)的混合物与第2部分试剂(或者第I部分试剂)混合也可。第I凝固时间测定试剂和待测样品的混合比(体积比)是4 I I : 4左右即可，优选是I : I。将第I部分试剂和第2部分试剂分别向待测样品添加之时，在第I部分试剂(或者第2部分试剂)的添加后，第2部分试剂(或者第I部分试剂)的添加前根据需要将待测样品和部分试剂的混合物温育也可。温育之时间是I 10分钟左右、温度是室温 45°C左右即可。如此将待测样品和第I凝固时间测定试剂混合之后，測定第I凝固时间。该凝固时间的測定用在所述技术中公知的方法进行即可，例如可使用公知的自动測定装置进行测定。接下来，将上述的待测样品与以相比第I凝固时间测定试剂更低浓度含碱金属盐的，或者，不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂混合，測定第2凝固时间。第2凝固时间的測定通过将上述的分成2个的待测样品的另一方和第2凝固时间測定试剂混合来进行。更具体而言，除了代替第I凝固时间測定试剂而使用第2凝固时间測定试剂以外，如同第I凝固时间的測定所述进行。第I凝固时间和第2凝固时间是依次測定也可，同时测定也可。基于如上述一样测定的第I凝固时间及第2凝固时间，判断上述的待测样品中是否含LA。具体而言，此待测样品中的LA的存在与否的判断优选使用基于上述的第I凝固时间及第2凝固时间得到的值来进行。基于第I凝固时间及第2凝固时间得到的值而言，可例举第I凝固时间和第2凝固时间的差值或比值。该差值而言，可例举“(第2凝固时间)_(第I凝固时间)”及“(第I凝固时间)_(第2凝固时间)”的值。该比值而言，可例举“(第2凝固时间)/(第I凝固时间)”及“(第I凝固时间)パ第2凝固时间)”的值。在本发明的试剂盒中，由于由LA的第I凝固时间的延长被第I凝固时间测定试剂中的碱金属盐抑制，所以预测第I凝固时间是与第2凝固时间同程度，或相比第2凝固时间更短。从而，在上述的判断中，作为第I凝固时间和第2凝固时间的差值，使用例如“(第2凝固时间)_(第I凝固时间)”的值时，在该值大之时可判断从受试者得到的待测样品中存在LA。相反，在“(第2凝固时间)_(第I凝固时间)”的值小(含O或负的值)时，可判断该待测样品中不存在LA。作为第I凝固时间和第2凝固时间的比值，使用例如“(第2凝固时间V(第I凝固时间)”的值来判断待测样品中的LA的存在与否之时，在该比值大之时可评价为该待测样品中存在LA。相反，在“(第2凝固时间)パ第I凝固时间)”的值小之时可判断该待测样品中不存在LA。
上述的待测样品中的LA的存在与否的判断可通过对于分别从健康者及LA患者得到的待测样品的第I及第2凝固时间的数据的蓄积依经验进行，但从更正确地判断的观点来看，待测样品中的LA的存在与否的判断优选是比较基于从受试者的待测样品得到的第I凝固时间及第2凝固时间得到的值与后述的阈值，基于比较结果来进行。阈值而言，优选基于例如罗斯纳指数(E. Rosner等，Thromb. Haemast. 1987、57 144-147)或狼疮比率(也称为 LR 值)(R. Schjetlein 等，Thromb. Res. 1993,69 :239-250)一祥的，相对于正常血浆的凝固时间的从受试者得到的待测样品的凝固时间的比来进行判断。本说明书中“狼疮比率(LR值)”是指通过以下的式⑴算出的值。式(I):狼疮比率=(b/a)/(d/c)= bc/ad(式⑴中，a、b、c及d各自表示以下的測定值。a:从受试者的待测样品和第I凝固时间测定试剂得到的凝固时间、b :从受试者的待测样品和第2凝固时间测定试剂得到的凝固时间、c :从健康者的待测样品(正常血浆)和第I凝固时间测定试剂得到的凝固时间、d:从健康者的待测样品(正常血浆)和第2凝固时间测定试剂得到的凝固时间。)在正常血浆的情况中，LR值是I左右。在从血液凝固因子缺损患者、华法林施用患者或肝素施用患者得到的待测样品的情况中，相比正常血浆凝固时间也延长，但由于在第I凝固时间和第2凝固时间之间几乎确认不到差异，LR值成为I左右。对此，在从LA阳性患者得到的待测样品的情况是，由于通过该待测样品中的LA的存在而第2凝固时间相比第I凝固时间更延长，所以LA阳性患者的LR值相比I更大。从而，通过与正常血浆的LR值比较，可自动地检测含LA的待测样品、即LA阳性患者来源的待测样品。本发明的方法中使用的第I及第2凝固时间测定试剂中可含的碱金属盐只要是在适当的溶剂中，优选是在各试剂中可含的缓冲液中发生碱金属的离子，并且不抑制磷脂依赖性的血液凝固反应的碱金属盐，就不特别限定。作为那样的碱金属盐，用到例如，作为盐酸、硫酸、硝酸等的碱金属盐的，无机酸的碱金属盐。特別是优选使用无机酸的钠盐或钾盐。具体而言，可例举氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钾、硝酸钾等，特别是，优选氯化钠、硫酸钠、氯化钾。另外，碱金属盐是无水物也可，是水和物也可。本发明的方法中使用的第I凝固时间測定试剂优选含磷脂，第2凝固时间测定试剂以相比该第I凝固时间测定试剂更低浓度含磷脂。那样的磷脂而言，是选自磷脂酰こ醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸的至少I种。另外，本发明的方法中使用的第I及第2凝固时间测定试剂含如活化剂、蛇毒、组织因子、钙盐等一祥的其他成分也可。该活化剂而言，可例举鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅等。
接下来说明实施例，但本发明不限于这些实施例。
实施例通过含碱金属盐的LA检测用试剂检查是否可明确地区分LA阳性待测样品和阴性待测样品。制备基于活化部分促凝血酶原激酶时间測定的測定原理的LA检测用试剂(2试剂系统)。在该LA检测用试剂中，将含碱金属盐及磷脂的试剂称为“LA-H”，将以相比LA-H更低浓度的含磷脂的试剂称为“LA-L”。LA-H包括第I部分试剂及第2部分试剂，LA-L包括第3部分试剂及第4部分试剂。第I部分试剂含50mM HEPES (岸田化学股份公司)、0· ImM鞣花酸(岸田化学股 份公司)、25mM Tris (岸田化学股份公司)、60 μ g/ml PE (Nacalai tesque股份公司)、120 μ g/ml PC (Nacalai tesque 股份公司)、20 μ g/ml PS (Nacalai tesque 股份公司)，及作为碱金属盐含氯化钠(终浓度O. 5wt%及I. Owt % Nacalai tesque股份公司)。另外，制备作为碱金属盐，分别含硫酸钠(终浓度O. 5wt%及I. Owt% Nacalai tesque股份公司)及氯化钾(终浓度O. 5wt%及I. Owt% :岸田化学股份公司)的第I部分试剂。再有，在各第I部分试剂中，也含与金属盐形成鳌合物的鞣花酸。另外，作为第I部分试剂的对照，也制备不含氯化碱金属盐的试剂。将这些的试剂的pH调节到7. 35。第3部分试剂含50mM HEPES(岸田化学股份公司)、0. ImM鞣花酸(岸田化学股份公司)、25mM Tris(岸田化学股份公司)、15μ g/ml PE (Nacalai tesque 股份公司)、30 μ g/ml PC (Nacalai tesque 股份公司)及 5 μ g/ml PS (Nacalai tesque 股份公司)。再有，在第3部分试剂中，也含与金属盐形成鳌合物的鞣花酸。另外，将第3部分试剂的pH调节到7. 35。第2部分试剂及第4部分试剂是氯化钙(分子量111. O、岸田化学股份公司)的终浓度达到25mM的用纯化水制备的溶液。2·测定样品作为LA阴性待测样品，使用作为正常样品的コアグ卜ロールN(SysmeX股份公司)、健康者的血浆(SUNFC0公司)11例、肝素添加血浆(向コアグ卜ロールN添加未分级分离肝素(持田制药股份公司)而终浓度达到O. 5U/ml的血浆)1例、凝固因子缺损血楽· (George King Bio-Medical, Inc公司)3例、及华法林施用患者血衆(George KingBio-Medical, Inc 公司)2 例。作为LA阳性待测样品，使用LA阳性血浆(SUNFC0公司)11例。3.凝固时间的測定准备2组各50μ I上述的各待测样品，将一方的组的各待测样品和第I部分试剂50 μ I混合,将另一方的组的各待测样品和第3部分试剂50 μ I混合,于37°C加温3分钟。其后，将这些和第2部分试剂(或者第4部分试剂)50μ I混合来測定凝固时间。凝固时间使用全自动血液凝固分析装置コアグレツクス800 (岛津制作所股份公司)来測定。4.狼疮比率的算出从对于各待测样品測定的凝固时间，根据以下的式算出狼疮比率。式(狼疮比率)=(b/a)/(d/c)= bc/ad
(式中，a、b、c及d各自表示以下的測定值。a:从待测样品和LA-H得到的凝固时间、b :从待测样品和LA-L得到的凝固时间、c :从正常样品和LA-H得到的凝固时间、d :从正常样品和LA-L得到的凝固时间。)将从LA阴性待测样品及LA阳性待测样品算出的，对于各LA检测用试剂的狼疮比率的分布示于图I 3。从图I 3知，在使用含碱金 属盐的试剂的测定系统中LA阳性待测样品的狼疮比率増大。从而确认，本发明的LA检测用试剂盒比不含碱金属盐的以往的试剂盒，可更明确地区分LA阳性待测样品和LA阴性待测样品。
权利要求
1.狼疮抗凝物检测用试剂盒，其包括 第I凝固时间测定试剂 '及 第2凝固时间測定试剂； 其中第I凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂之中至少一方含碱金属盐。
2.权利要求I所述的检测用试剂盒，其中 上述第I凝固时间测定试剂含碱金属盐， 上述第2凝固时间测定试剂含相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度的碱金属盐，或者，不含碱金属盐。
3.权利要求I或2所述的检测用试剂盒，其中 上述第I凝固时间测定试剂含磷脂，上述第2凝固时间測定试剂以相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度含磷脂。
4.权利要求I或2所述的检测用试剂盒，其中 上述碱金属盐是无机酸的碱金属盐。
5.权利要求I或2所述的检测用试剂盒，其中 上述碱金属盐是钠盐或钾盐。
6.权利要求I或2所述的检测用试剂盒，其中 上述第I凝固时间测定试剂及上述第2凝固时间测定试剂含活化剂。
7.权利要求6所述的检测用试剂盒，其中 上述活化剂选自鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅。
8.权利要求3所述的检测用试剂盒，其中 上述磷脂是选自下列的至少I种的磷脂磷脂酰こ醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸。
9.权利要求I或2所述的检测用试剂盒，其还包括 含钙盐的第3凝固时间測定试剂。
10.判断狼疮抗凝物的存在与否的方法，其包括 将从受试者采集的待测样品和含碱金属盐的第I凝固时间测定试剂混合，測定第I凝固时间； 将上述待测样品和含相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度的碱金属盐，或者不含碱金属盐的第2凝固时间测定试剂混合，測定第2凝固时间 '及 基于测定的第I凝固时间及第2凝固时间，判断上述待测样品中是否含狼疮抗凝物。
11.权利要求10所述的判断方法，其中 在上述判断步骤中，通过比较基于上述第I凝固时间及第2凝固时间得到的值和指定的阈值，判断上述待测样品中是否含狼疮抗凝物。
12.权利要求10或11所述的判断方法，其中 上述第I凝固时间测定试剂含磷脂，上述第2凝固时间測定试剂以相比上述第I凝固时间测定试剂更低浓度含磷脂。
13.权利要求10或11所述的判断方法，其中 上述碱金属盐是无机酸的碱金属盐。
14.权利要求10或11所述的判断方法，其中 上述碱金属盐是钠盐或钾盐。
15.权利要求10或11所述的判断方法，其中上述第I凝固时间测定试剂及上述第2凝固时间测定试剂含活化剂。
16.权利要求15所述的判断方法，其中上述活化剂选自鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅。
17.权利要求12所述的判断方法，其中上述磷脂是选自下列的至少I种的磷脂磷脂酰こ醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸。
全文摘要
本发明狼疮抗凝物检测用试剂盒及狼疮抗凝物存在与否判断方法旨在提供正确地区分狼疮抗凝物(LA)阳性的待测样品组和阴性的待测样品组的LA检测用试剂盒，所述LA检测用试剂盒含第1凝固时间测定试剂和第2凝固时间测定试剂，所述第1凝固时间测定试剂及第2凝固时间测定试剂之中至少一方含碱金属盐。使用该试剂盒可判断LA的存在与否。
文档编号G01N33/86GK102650643SQ20121004780
公开日2012年8月29日 申请日期2012年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者吉田和代, 奥田昌宏, 熊野穣 申请人:希森美康株式会社