专利名称：检测硝基呋喃类药物残留的胶体金试纸卡的制作方法
技术领域：
本实用新型属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体涉及一种检测试纸卡。
背景技术：
硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基 呋喃基本结构的广谱抗菌药物，主要是指呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因，硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，并作为禽类、水产和猪的促生长添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，因此此类药物禁止在治疗和饲料中使用。用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是HPLC，LC-MS和LC-MS/MS，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。

实用新型内容本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种敏感度高、成本低、操作简单、检测时间短的试纸卡。本实用新型的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，与常规试纸卡不同的是，其中的结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。所述反应膜上分别包被有硝基呋喃类药物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠IgG构成的质控线印迹“ I ”。从而可以用于硝基呋喃类药物残留的检测。本实用新型试纸卡的底板为可PVC板或者是其它硬质而不吸水的材料；反应膜可为硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜；样品吸收垫可由玻璃棉或聚酯材料制成；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放垫层包被有抗体-胶体金结合物。在样品吸收垫与结合物释放垫及吸水层上覆盖有保护膜，在玻璃棉和纤维层一侧约O. 4cm处喷制样品标记线。偶联硝基呋喃类药物载体蛋白可用卵血清蛋白、或人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线印迹和质控线的对照印迹组合排列可为“ 11 ”本实用新型试纸卡具有如下有益效果I.特异性强，敏感度高。硝基呋喃类药物快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸卡具有较高的特异性和敏感性。对饲料中呋喃唑酮检测灵敏度为5μ g/kg ;对饲料中呋喃它酮检测灵敏度为3 μ g/kg ;对饲料中呋喃西林检测灵敏度为
2μ g/kg ;对饲料中呋喃妥因检测灵敏度为2 μ g/kg。2.操作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只要将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴(约100微升)，加后计时，5 8min内观察结果。3.显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线色“ I ”及“ I I ”印迹作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样品液中含有硝基呋喃类药物，两条红线“ 11 ”印迹表示在被检测样品中不含硝基呋喃类药物，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现阴性和假阳性误判。4.成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。 5.易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，人人都操作，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、动物产品加工、集化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

图I为硝基呋喃类药物快速检测试纸卡结构示意图，其中，I、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；图2为硝基呋喃类药物快速检测试纸卡俯视结构不意图，其中8_1和8_2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线；图3为硝基呋喃类药物快速检测试纸卡阴性(图3. a)、阳性(图3. b)、无效(图
3.c)显色示意图，其中T质控区，C为检测区。
具体实施方式
实施例I试纸卡的组装参见图I、图2 :样品吸收垫I用玻璃棉制成，结合物释放垫层2为吸附有硝基呋喃类药物单克隆抗体-胶体金标记物的纤维层，反应膜层3，采用硝酸纤维素膜，吸水垫4为吸水材料层制成，5为检测区包被有硝基呋喃类药物-载体蛋白偶联物，6为质控区包被有羊抗鼠IgG构成质控线，底板7为PVC背衬，用塑料薄片条制成，在PVC背衬上按顺序粘附硝酸纤维素膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，将样本垫覆盖在结合物释放垫三分之一处，8-1为白色保护膜，覆盖在样品吸收垫和结合物释放垫上，在样品吸收垫和结合物释放垫交界处对应保护膜8-1位置偏向于样品吸收垫一方O. 5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4即为吸水层(手柄端)上覆盖有浅蓝色保护膜8-2。要制成硝基呋喃类药物快速检测试纸卡首先需制备偶联硝基呋喃类药物载体蛋白，制备检测线，制备胶体金，用于制备金标抗体纤维，其次须制备羊抗鼠IgG抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方法I.硝基呋喃类药物半抗原的合成取1.41g 2-醛基-5-硝基呋喃与2. 0-3. Og氨基丁酸溶入150ml甲醇中，加入
5-10ml三乙胺，室温下反应10-20小时，稀盐酸酸化，乙酸乙酯萃取，蒸除溶剂后柱层析得到硝基呋喃类药物半抗原。2.包被原的制备-硝基呋喃类药物半抗原与卵清蛋白偶联物的合成取步骤I)制备的到半抗原18mg,溶解于I. 5mL DMF中；取36mg EDC用O. 2ml水充分溶解后于加入上述DMF中，室温下搅拌24h，得到A液；称取0VA60mg，使之充分溶解在
5.3mLPBS (PH7. 2)中，得到B液；将上述得到的A液逐滴缓慢滴加到B液中，并于室温下搅拌24h ;用O. 01mol/LPBS,4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，分装，于-20°C保存备用。3、免疫原的制备取步骤I)制备的半抗原25mg，溶解于I. 5mL DMF中，取50mg EDC用O. 2ml水充分溶解后于加入上述DMF中，室温下搅拌24h，即可得到反应液C ;称取BSA60mg，使之充分溶解在4. 3mL PBS (PH 7. 2)中，得到D液；将反应液C逐滴缓慢滴加到D液中，并于室温下搅拌24h,用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，分装，于-20°C保存备用。4.硝基呋喃类药物-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、硝基呋喃类药物半抗原、硝基呋喃类药物-载体蛋白偶联物用PH7. 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O. Olmol/L pH7. 4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、硝基呋喃类药物半抗原、硝基呋喃类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明硝基呋喃类药物与载体蛋白偶联成功。5.抗硝基呋喃类药物单克隆抗体的制备5. I动物免疫将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80 μ g/只，使其产生多克隆抗体。细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5 I比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直接到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。5. 2细胞冻存和复苏将硝基呋喃类药物单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成I X IO8个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。5. 3单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油O. 4ml/只，7天后腹腔注射硝基呋喃类药物单克隆杂交瘤细胞株5X IO5个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入_20°C环境保存。6.硝基呋喃类药物单克隆抗体和胶体金标记物的制备胶体金的制备用双蒸去离子水将I %氯金酸稀释成O. 01%，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入21111 I %柠檬酸三钠，继续煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。[0040]硝基呋喃类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用O. lmol/L碳酸钾调胶体金的pH值至8. 2，按每毫升胶体金溶液加入50-100 μ g抗体加入硝基呋喃类药物抗体，继续搅拌混匀30min，加入10% BSA至终浓度为I %，静置30min。12000rpm、4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用，保存60天。复溶缓冲液用含牛血清白蛋白(BSA)O. 02 O. I %，吐温-200. 05 0.2%，PVP-300吡咯烷酮O. 3%,O. 02mol/L pH9. O的硼酸复溶缓冲液。7.羊抗鼠IgG抗体的制备羊抗鼠抗抗体的制备以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。8.硝基呋喃类药物快速检测试纸卡实施检测原理当硝基呋喃类药物检测试纸卡样品垫端滴加待测样品溶液后，待检溶液通过金标抗体棉中的金标抗体一起向反应膜扩散，并最终渗入滤纸中，扩散过程中检测硝基呋喃类药物可与金标抗体相结合，进而封闭金抗体上硝基呋喃类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上偶联硝基呋喃类药物半抗原-载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹“ I ”，呈一条印迹为阳性，相反样本溶液中无硝基呋喃类药物则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联硝基呋喃类药物的载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹“ I ”，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹“ I ”，形成两条红线“ 11 ”阴性标记，如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效。9.硝基呋喃类药物快速检测试纸卡检测实施列操作方法9. I样本前处理称取I. 0±0· 05g饲料样品至聚苯乙烯离心管中，加入5_15ml 50%的甲醇水溶液(量取50ml甲醇和50ml去离子水混匀备用)涡动，静置，取上清液用于检测。9. 2用试纸卡检测将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴，加后计时，5 8min内观察结果。超过IOmin样品检测判读无效。9. 3检测结果分析硝基呋喃类药物在样品中浓度高于试纸的样本最低检测限时，胶体金抗体与硝基呋喃类药物结合，从而在检测区内因为竞争反应不会与硝基呋喃类药物半抗原-偶联物结合而不出现红色条带，呈阳性。阴性样品在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在检测区与质控区内出现红色条带。阳性；当质控区显示一条红色条带，而检测区不显色，快速检测试纸卡以显示红线色“ I ”，判为阳性，如图3中间图所示。阴性当质控区显示一条红色条带，检测区同时也显示出一条红色条带，且检测区颜色接近或浅于质控区时，快速检测试纸卡以显示红线色为“ 11 ”，判为阴性，如图3左图所
/Jn ο无效当质控区不显示出红色条带，则无论检测区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效，如图3右图所示。
权利要求1.一种检测硝基呋喃类药物残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
2.如权利要求I所述的试纸卡，其特征在于，结合物释放垫的三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
3.如权利要求I或2所述的试纸卡，其特征在于，在试纸卡的两端分别覆盖有保护膜。
4.如权利要求I或2所述的试纸卡，其特征在于，所述底板为PVC板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
5.如权利要求I或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的样品吸收垫由玻璃棉或聚酯材料制成。
6.如权利要求I或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合物释垫层由纤维制成。
专利摘要本实用新型提供了一种检测试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜层上具备包被有硝基呋喃类药物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成质控线；结合物释放垫包被有硝基呋喃类药物单克隆抗体的胶体金标记物。采用本实用新型试纸卡是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
文档编号G01N33/558GK202720228SQ20122013829
公开日2013年2月6日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者何方洋, 万宇平, 陶光灿, 孙震, 崔海峰, 冯静, 余厚美, 何丽霞, 田甜, 汤庆彩 申请人:北京勤邦生物技术有限公司