专利名称：用于产生肿瘤细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于通过基于小气道上皮细胞的基因转移来产生肿瘤细胞的方法、通过这种方法产生的肿瘤细胞以及一种用于使用这类肿瘤细胞筛选抗肿瘤药物的方法。
背景技术：
每年有超过一百万的人死于肺癌。实际上，肺癌可以被视为男性和女性中均最常见的癌症类型。非小细胞肺癌占伴有相关联的腺癌的所有肺癌类型的80%。在大多数情况下，诊断发生在该疾病的晚期，而尽管在早期检测和治疗的方法上已经取得了进步，但是难于取得良好的预后(非专利文献I和2)。虽然非小细胞肺癌的状态和进展的分子分析有望 使治疗和预防的方法得到改进，但是现在还没有建立有效的治疗和预防方法。对于寻找用于初始检测和治疗性干预的最适合的靶标来说，鉴定与细胞的致瘤性转化相关联的最少和最重要的变化是必不可少的。为了鉴定这些变化，正在开发通过正常人类细胞的基因操作而获得的体外癌症模型系统。由于现有的从肿瘤组织建立的细胞系含有未知的遗传畸变，它们不适合用于通过遗传变化研究致瘤性转化。然而，一些体外癌症模型系统据报道在直接阐明特定的遗传变化对于致瘤性转化的影响中是有用的(参见非专利文献3和4)。许多研究小组正在进行关于人肺上皮细胞的永生化和致癌性转化的研究(非专利文献5至7)。在这些研究中，通过使用逆转录病毒进行基因操作来测试在大多数人类非小细胞肺癌中观察到的三种类型的遗传变化，即端粒酶逆转录酶基因引入和PRB和p53途径的失活。在实质上所有肺癌中观察到端粒酶的高表达(非专利文献8)，在大约50%的非小细胞肺癌中观察到P53功能缺失，并且在大约70%的非小细胞肺癌中观察到由于启动子区甲基化或纯合性缺失弓I起的表达P16蛋白的无能(非专利文献9)。然而，尽管在这类研究中取得了进展，迄今为止的文献实质上缺乏关于成功的人工产生肺癌细胞的报告，这些人工产生的肺癌细胞与从实际肺癌患者分离的肺癌组织在病理上非常相似。目前，源自癌症患者的癌细胞系被用于癌细胞研究中和抗癌药物的开发中。然而，由于实质上源自患者的大多数癌细胞系具有未详细说明的遗传损害，在细胞系之间在遗传畸变的状态方面存在一些变异性。因此，当这些细胞被用于研究关于特定分子或信号途径时，所获得的实验结果不能应用于不同的细胞系。而且，由于这些细胞具有未详细说明的遗传损害，它们不适合在实验中用来评估个体基因对致癌性转化的贡献。非专利文献I :Meuwissen, R.等人，基因研发(Genes Dev. ) 19，643-664 (2005)非专利文献2 :Herbst, R. S.等人，“肺癌”(“Lung cancer”)，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med. ) 359，1367-1380 (2008)非专利文献3 Akagi, T.，分子医学进展(Trends Mol. Med. ) 10，542-548 (2004)非专利文献4 :Zhao, J. J.等人，分子医学进展(Trends Mol. Med.)10，344-350(2004)
非专利文献5 Lundberg, A. S.等人，致癌基因(Oncogen) 21，4577-4586 (2002)非专利文献6Ramirez, R. D.等人，癌症研究(Cancer Res. )64, 9027-9034(2004)非专利文献7 :Sato，M.等人，癌症研究(Cancer Res. ) 66，2116-2128 (2006)非专利文献8 =Sekido, Y.等人，医学年评(Annu. Rev. Med. ) 54，73-87(2003)非专利文献2 :Herbst, R. S.等人，“肺癌”(“Lung cancer”)，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med. ) 359，1367-1380 (2008)发明的披露鉴于上述，对于具有确定的遗传状态的癌症模型细胞的研发期待已久。
诸位发明人通过基因操作已成功实现小气道上皮细胞的完全致瘤性转化。由于因此获得的致瘤性转化的细胞已通过正常细胞的基因操作而发生转化，已经鉴定了该遗传状态。诸位发明人在密切观察这些细胞时发现这些细胞表现出分化的或未分化的人类肺癌细胞的组织学特征，取决于已经引入的遗传成分的组合。另外，诸位发明人已经成功地产生具有未分化和分化的人类肺癌的癌干细胞的性质的细胞。因此，本发明涉及以下各项。[I] 一种用于通过将一种或多种癌相关基因转移至一种永生化小气道上皮细胞内来产生一种肿瘤细胞的方法，其中该永生化小气道上皮细胞是通过使一种正常小气道上皮细胞经受以下处理(I)至⑶而产生(I)强制表达一种端粒逆转录酶基因；(2)强制表达一种细胞周期蛋白依赖性激酶4基因；以及(3)诱导p53功能缺失，并且其中该一种或多种癌相关基因是选自以下基因中的一种或多种基因C-MyC基因、v-Src基因、KRAS突变基因、BCL2基因、PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白Dl基因、LKBl突变基因、TP63基因以及EGFR突变基因。[2]根据[I]所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因与v-Src基因的组合。[3]根据[I]所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因、KRAS突变基因以及BCL2基因的组合。[4]根据[2]或[3]所述的方法，其中该肿瘤细胞是未分化癌细胞。[5]根据[4]所述的方法，其中该肿瘤细胞是癌干细胞。[6]根据[I]所述的方法，其中这些癌相关基因是c-Myc基因和v-Src基因，其中该c-Myc基因在该永生化小气道上皮细胞中被诱导表达。[7]根据[6]所述的方法，其中该肿瘤细胞是低分化肺癌细胞。[8]根据[I]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与选自PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白Dl基因以及LKBl突变基因中的一种基因的组合。[9]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与细胞周期蛋白Dl基因的组合。[10]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因、细胞周期蛋白Dl基因以及TP63基因的组合。[11]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与PIK3CA突变基因的组合。[12]根据[8]所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与LKBl突变基因的组合。[13]根据[I]所述的方法，其中该癌相关基因是EGFR突变基因与细胞周期蛋白Dl基因的组合。[14]根据[8]至[13]所述的方法，其中该肿瘤细胞是分化的肺癌细胞。[15]根据[9]所述的方法，其中该肿瘤细胞是分化的肺癌的一种癌干细胞。[16]根据[8]至[15]所述的方法，其中该永生化小气道上皮细胞是一种哺乳动物或灵长类动物细胞。[17]根据[8]至[15]所述的方法，其中该永生化小气道上皮细胞是一种人类细·胞。[18] 一种通过根据[I]至[17]的任一项所述的方法产生的肿瘤细胞。[19] 一种被植入有根据[15]所述的肿瘤细胞的携带肿瘤的动物模型。[20] 一种用于筛选一种抗癌药物的方法，该方法包括(a)使衍生自[18]所述的肿瘤细胞的一种样品与一种候选物接触；以及(b)检测肿瘤细胞生长抑制效应。由于通过本发明的方法产生的这些肿瘤细胞是通过正常细胞的基因操作而被致瘤性转化的细胞，已经鉴定了它们的遗传状态。因此，本发明提供了对于评估个体基因在肺癌的发展中的贡献高度有用的一种模型系统。在通过本发明的方法产生的这些肿瘤细胞中，通过只转移癌相关基因而产生的那些细胞是精确表达癌细胞的特性的细胞，并且因此被预期在如抗癌药物的开发的这类应用中是高度有效的。附图简要说明图IA是展示通过将c-Myc和v_Src基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞(在下文称为“4T53MS细胞”)的致瘤性的一个简图，图IB是显示4T53MS细胞的肿瘤生长潜力的一个曲线图，并且图IC显示了 4T53MS细胞衍生的肿瘤组织用苏木精-伊红(H&E)染色的结果和该肿瘤组织的免疫染色的结果的图像。图2A是显示根据在体内4T53MS细胞的致瘤性研究中植入的细胞的数量获得的结果的一个表格，并且图2B是显示在将十个4T53MS细胞植入一个NOD-SCID小鼠体内七周之后的肿瘤形成的一个简图。图3A是显示在体外实验系统中，通过多西环素(DOX)处理在细胞(下文指示为“4T53mS细胞”，其中‘m’是小写字母)中诱导c-Myc表达的一个简图，这些细胞是通过将诱导型c-Myc基因和v-Src基因转移至HSAE/4T53细胞内而产生的，图3B是描绘一种产生低分化肺癌模型的方法的一个示意图。将4T53mS细胞植入裸小鼠体内并且这些小鼠被继续给予多西环素(D0X)。一旦观察到肿瘤形成，就停止多西环素给药。图3C是显示4T53mS细胞衍生的肿瘤组织的免疫染色(细胞角蛋白染色)的结果一个简图。图4 是显示通过将各种癌相关基因(M c-Myc ；R =KRASv12 ；B BCL2 ；P PIK3CAH1047E ；D :细胞周期蛋白Dl ；L LKBId194a ；E :EGFRT79_58K)中的一种或多种转移到HSAE/4T53细胞中而建立的细胞系的致瘤性的一个表格。图5呈现了显示了在以下情况时所获得的结果的简图将所指示的基因(M:c-Myc ；R KRASV12 ；B :BCL2)转移至 HSAE/4T53 细胞中来产生 4T53RM细胞(用 KRASv12 和 c_Myc转导)和4T53RMB细胞(用KRASvi2^c-Myc和BCL2转导)，将这些因此产生的细胞移植至裸小鼠体内，然后经受H&E染色(顶排)、抗细胞角蛋白染色(AE1/AE3:中排)以及抗波形蛋白染色(底排)。图6呈现出显示了从衍生自4T53RP细胞(左栏)、4T53RD细胞(中间栏)以及4T53RL细胞(右栏)的异种移植物的切片的H&E染色(顶排)、抗细胞角蛋白染色(AE1/AE3 :中排)以及抗波形蛋白染色(底排)获得的结果的简图。“ 4T53RP细胞”是通过将KRASv12基因和PIK3CA突变基因转移至HSAE/4T53细胞中产 生的细胞。“4T53RD细胞”是通过将KRASv12和细胞周期蛋白Dl基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞。“4T53RL细胞”是通过将KRASv12基因和LKBl突变基因转移至HSAE/4T53细胞中产生的细胞。图7是显示能够根据转移至4T53细胞中的基因的组合而产生的各种类型的肺癌模型的示意图。图8A显示了通过皮下植入来自单个4T53RD细胞的细胞克隆所获得的异种移植物的切片的抗P63染色(左图)、抗TTFl染色(中图)以及阿新蓝染色(右图)的结果，并且图SB是小鼠中气道上皮的一个示意图。图9是显示根据植入的细胞的数量，来自单个4T53RD细胞的细胞克隆的体内致瘤性研究的结果的一个表格。图IOA和图IOB分别显示了衍生自4T53RD细胞和4T53RDANp63细胞的异种移植物的切片的H&E染色的结果。

图11A、图IlB以及图IlC分别显示了衍生自4T53ED细胞的异种移植物的切片的H&E染色、阿新蓝染色以及抗细胞角蛋白染色(AE1/AE3)的结果。实施本发明的最佳模式下文详细描述了本发明。给出以下实施方案来展示本发明，并且以下实施方案不应当被解释为限制本发明。在不脱离本发明要旨的情况下可以按各种形式来实践本发明。本说明书中所引用的所有参考文献和日本专利申请特许公开、日本专利公布以及其他专利文献的全部内容是通过引用结合在此。于2010年5月31日提交并且充当本申请的优先权要求的基础的日本专利申请号2010-125256的说明书和图表的全部内容也通过引用结合在此。I.用于产牛肿瘤细胞的方法本发明提供了一种用于通过将癌相关基因转移至一种永生化小气道上皮细胞中来产生肿瘤细胞的方法。优选地，本发明的方法的特征在于该永生化小气道上皮细胞是通过使一种正常小气道上皮细胞经受以下处理(I)至(3)而产生(I)强制表达一种端粒逆转录酶基因；(2)强制表达一种细胞周期蛋白依赖性激酶4基因；以及(3)诱导p53功能缺失，其中该癌相关基因是选自以下基因的一种或多种基因一种c-Myc基因、一种v-Src基因、一种KRAS突变基因、一种BCL2基因、一种PIK3CA突变基因、一种细胞周期蛋白Dl基因、一种LKBl突变基因、一种TP63基因以及一种EGFR突变基因。
癌相关基因在本发明的方法中使用的“癌相关基因”是指一种基因，当在一个正常细胞中表达时，该基因具有致瘤地或致癌地转化该细胞的能力；或是指与控制基因的表达相关的一种基因，当在一个正常细胞中表达时，该基因具有致瘤地或致癌地转化该细胞的能力。癌相关基因的实例包括骨髓细胞瘤病癌基因(c-Myc)、v-Src基因、RAS基因、B细胞白血病/淋巴瘤2 (BCL2)基因、磷脂酰肌醇3激酶催化亚单位(PIK3CA)基因、细胞周期蛋白Dl基因、肝激酶BI (LKBl)基因、c-Abl基因、c-Sis基因、表皮生长因子受体(EGFR)基因、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)基因、血管内皮生长因子受体(VEGFR)基因、HER2/neu基因、Raf激酶基因、细胞周期蛋白依赖性激酶基因、肿瘤蛋白P63 (TP63)基因以及它们的突变基因。
在本发明中，可以优选使用c-Myc基因、v_Src基因、RAS基因、BCL2基因、PIK3CA基因、细胞周期蛋白Dl基因、LKBl基因、EGFR基因、TP63基因以及它们的突变基因和剪接同种型。在本发明中，不是特别关注所使用的癌相关基因的类型，虽然优选的是一种哺乳动物癌相关基因，更优选的是一种灵长类动物癌相关基因并且甚至更加优选的是一种人类癌相关基因。“c-Myc基因”是编码与调节各种基因的表达和DNA复制相关联的一种DNA结合因子(例如，一种转录因子)的一种基因。已经表明在受损的c-Myc基因表达与各种癌症之间存在着某种关联性(Dominguez-Sola, D.等人，自然(Nature) 448，445-451 (2007))。“v-Src基因”是来自作为一种类型的逆转录病毒的劳氏肉瘤病毒的一种癌相关基因。Mayer B. J.等人，病毒学杂志(J. Virol. )60 (3)，858-67 (1986)已经对此基因的序列进行了描述。“ RAS基因”是编码传输参与细胞分化和生长的信号的小GTP酶的一种基因。已知的是，细胞因这种信号传输的异常而变得具有癌性(Goodsell，D.S，肿瘤学家(Oncologist) 4(3)，263-264(1999))。在 20% 至 30% 的非小细胞肺癌中，已经报道了 RAS基因突变(Aviel-Ronenv, S 等人，临床肺癌(Clin. Lung Cancer) 1，30-38 (2006))。在本发明中，RAS基因优选地是一种KRAS突变基因。在此，KRAS突变基因是由一种野生型KRAS基因突变产生的一种KRAS基因。一个实例是编码其中12位的甘氨酸残基被一个缬氨酸残基置换的突变KRASv12 (SEQ ID N0:6)的基因。Sato, M等人，癌症研究(Cancer Res.)66(4),2116-2128(2006)中给出了关于编码KRASv12的基因的详情。“BCL2基因”是具有凋亡抑制活性的一种癌相关基因，并且被暗示与黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌以及肺癌相关联(Chao, D. T.，Korsmeyer, S. J.，免疫学年鉴(Annu. Rev.Immunol. ) 16，395-419(1998))。“PIK3CA基因”是编码第I类PI3-激酶催化亚单位的一种基因，并且据报道是与乳腺癌、结肠直肠癌以及肺癌相关联的(自然-癌症评论(Nature Reviews Cancer)
5,921-929(2005);科学-转化医学(Sci. Transl. Med. ) 2，26-25 (2010))。另外，已经提出PIK3CA基因在子宫子宫颈癌(uterocervical cancer)的发展中作为一种癌相关基因起作用(Ma, Y. Y.，等人，癌基因(0ncogene)19 (23)，2739-2744 (2000))。在本发明中，PIK3CA 基因优选地是一种PIK3CA突变基因。PIK3CA突变基因是已经相对于它的野生型基因发生突变的一种PIK3CA基因，说明性的实例是编码其中1047位的组氨酸残基被精氨酸置换的一种PIK3CAH1047R突变蛋白(SEQ ID N0:10)的一种基因。“细胞周期蛋白Dl基因”是编码细胞周期调节因子的一种基因。细胞周期蛋白Dl基因的过度表达在甲状旁腺腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、黑色素瘤以及肺癌的发展中起作用(Morgan, D. O.，细胞(Cell) 135, 764-794 (2008);肺癌(Lung Cancer)55，1-14(2007))。“LKB1基因”是编码肝激酶BI的一种基因，并且该基因的过度表达涉及肺癌、子宫子宫颈癌、乳腺癌、睾丸癌、胰腺癌以及皮肤癌的发展(Katajisto，P.等人，生物化学与生物物理学学报(Biochem. Biophys. Acta) 1775 (I), 63-75 (2007))中。在本发明中，LKBl 基因优选地是一种LKBl突变基因。LKBl突变基因是具有相对于它的野生型基因的突变的一种LKBl基因。例如，可以优选使用编码LKBl的一种显性阴性型突变体(LKBl-D N)的一种基因。显性阴性型LKBl突变体的一个实例是其中194位的天冬氨酸被丙氨酸置换的LKBId194a(SEQ ID NO:16)。“EGFR基因”是编码一种上皮生长因子受体的一种基因。在包括乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌以及脑瘤的许多类型的癌症中已经观察到EGFR基因的表达的提高。已知的是，在肺腺癌中发现高发生率的EGFR基因突变(Sharma，S.V.等人，自然-癌症评论(Nat. Rev.Cancer)7 (3)，169-81(2007))。在本发明中，EGFR基因优选地是一种EGFR突变基因。EGFR突变基因是已经相对于它的野生型基因发生突变的一种EGFR基因，一个说明性的实例是编码其中790位的苏氨酸残基被一个甲硫氨酸残基置换并且858位的亮氨酸残基被一个精氨酸残基置换的EGFRt79cim "―突变蛋白(SEQ ID NO: 18)的基因。“TP63基因”是TP53抑癌基因的一种同系物，该基因抑制癌症的情况和该基因促进癌症的情况都是已知的。已经报道在头部和颈部以及包括肺和食管的各种器官的鳞状细胞癌中TP63基因的表达的提高(Deyoung，M.P.等人，癌基因(Oncogene)26，5169-5183(2007))。本发明中的TP63基因优选地是编码TP63的剪接同种型的一种基因。编码TP63的剪接同种型的基因的实例是编码缺少一个N末端反式激活结构域的TP63剪接同种型的ΤΡ63ΔΝ基因(SEQ ID NO: 20)。在NCBI数据库中根据下文所指示的登录号可获得人类c-Myc、BCL2以及细胞周期蛋白Dl基因的对应的核苷酸序列。可以通过参考在NCBI数据库中根据下文所指示的登录号可获得的野生型基因序列连同McCoy，M.S.等人，分子细胞生物学(Mol. Cell. Biol.)4，1577-1582(1984)、Samuels, Y.，等人，科学(Science) 304，554 (2004)以及 Scott, K.D.等人，癌症研究(Cancer Res. ) 67，5622-5627(2007)来获得 KRASv12, PIK3CAH1047E 以及LKBId194a基因的对应的核苷酸序列的详情。表I
权利要求
1.一种用于通过将一种或多种癌相关基因转移至永生化小气道上皮细胞内来产生肿瘤细胞的方法，其中 该永生化小气道上皮细胞是通过使正常小气道上皮细胞经受以下(I)至(3)处理而产生的 (1)强制表达端粒逆转录酶基因； (2)强制表达细胞周期蛋白依赖性激酶4基因；以及 (3)诱导p53功能缺失，并且其中 该一种或多种癌相关基因是选自以下基因的一种或多种基因c-Myc基因、ν-Src基因、KRAS突变基因、BCL2基因、PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白Dl基因、LKBl突变基因、TP63基因以及EGFR突变基因。
2.根据权利要求I所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因与v-Src基因的组合。
3.根据权利要求I所述的方法，其中该癌相关基因是c-Myc基因、KRAS突变基因以及BCL2基因的组合。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中这些肿瘤细胞是未分化癌细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中这些肿瘤细胞是癌干细胞。
6.根据权利要求I所述的方法，其中这些癌相关基因是c-Myc基因和v-Src基因，其中该c-Myc基因在这些永生化人类小气道上皮细胞中被诱导表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其中这些肿瘤细胞是低分化肺癌细胞。
8.根据权利要求I所述的方法，其中该癌相关基因是KRAS突变基因与选自PIK3CA突变基因、细胞周期蛋白Dl基因以及LKBl突变基因中的一种基因的组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因与细胞周期蛋白Dl基因的组合。
10.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因、细胞周期蛋白Dl基因以及TP63基因的组合。
11.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因与PIK3CA突变基因的组合。
12.根据权利要求8所述的方法，其中这些癌相关基因是KRAS突变基因与LKBl突变基因的组合。
13.根据权利要求I所述的方法，其中这些癌相关基因是EGFR突变基因与细胞周期蛋白Dl基因的组合。
14.根据权利要求8至13所述的方法，其中这些肿瘤细胞是分化肺癌细胞。
15.根据权利要求9所述的方法，其中这些肿瘤细胞是分化肺癌的癌干细胞。
16.根据权利要求8至15所述的方法，其中这些永生化小气道上皮细胞是哺乳动物或灵长类动物细胞。
17.通过根据权利要求I至16的任一项所述的方法产生的肿瘤细胞。
18.—种植入有根据权利要求17所述的肿瘤细胞的荷瘤动物模型。
19.一种用于筛选一种抗癌药物的方法， 该方法包括 (a)将衍生自权利要求17所述的肿瘤细胞的一种样品与一种候选物质接触；以及(b)检测 肿瘤细胞生长抑制效应。
全文摘要
本发明的目的是提供一种用于通过进行基因转移到源自正常细胞的细胞中来产生肿瘤细胞的方法。本发明提供了一种用于通过将癌相关基因转移到永生化小气道上皮细胞中来产生肿瘤细胞的方法。
文档编号G01N33/15GK102918146SQ20118002656
公开日2013年2月6日 申请日期2011年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者赤城刚, 笹井研 申请人:卫材R&D管理有限公司