专利名称：一种细胞染色试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞染色试剂盒及其使用方法，尤其是指一种用于宫颈癌早期诊断和鉴别的细胞染色试剂盒及其使用方法。
背景技术：
宫颈癌是影响妇女健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌而居女性肿瘤的第二位。全世界每年约有50万新发宫颈癌病例，亚洲约38万，中国约15万例，全世界每年约23万妇女死于宫颈癌，亚洲约19万，中国约8万。这个数据显示宫颈癌已成为中国妇女健康的巨大威胁(Ng E 等，CMAL，2004，170(10) :1545-1549 ;乔友林，2006，26 (12)1293-1295)。宫颈癌中 95%是鳞状细胞癌(Squmous Cells Carcinoma, SCC)，临床一期的治愈率可达到80 90%，二期时是60 70%，进入三期是40 50%，但发展到四期只有 10%的治愈率。因此对宫颈癌前病变包括宫颈上皮内瘤变(Cervical IntraepitheliumNeoplasia, CIN)的防治和早期诊断宫颈癌是控制其发生、发展和预后的关键(Huth WK, JNatl ComprCanc Netw, 2010,8 :1329-1330),进一步探索针对宫颈癌早期诊断的特异性检测方法就显得尤为重要。由于宫颈癌常继发感染伴有明显的炎症反应，在H&E染色中癌细胞常淹没在炎症细胞中难以辨认,或H&E染色中癌细胞质为红色,核为蓝色，而红细胞常为红色，炎症细胞为蓝色，使寻找癌细胞较为困难，容易漏诊。

发明内容
本发明的目的是提供一种细胞染色试剂盒及其使用方法，以增强细胞对染色试剂的亲和性，提高染色效率和细胞的辨别率，提高宫颈癌诊断的准确率。为了达到上述目的，本发明提供了一种细胞染色试剂盒，其特征在于，包含无花果叶提取液、碱性染料、酸性染料和细胞核染色试剂。优选地，所述的碱性染料为新品红染色液。优选地，所述的酸性染料为亮绿染色液。优选地，所述的细胞核染色试剂为Harris苏木素染色剂。本发明还提供了上述细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，依次包括如下步骤第一歩将细胞样本用固定剂固定后，用去离子水洗涤；第二步用细胞核染色试剂对第一歩所得的细胞样本的细胞核进行染色，用自来水冲洗后，再用去离子水洗涤；第三步用无花果叶提取液孵育第二步所得的细胞样本，用去离子水洗涤；第四步用碱性染料孵育第三步所得的细胞样本，用去离子水洗涤；第五步用酸性染料孵育第四步所得的细胞样本，用去离子水洗涤；第六步将第五步所得的细胞样本干燥后，封片观察。
优选地，所述的第一歩的具体步骤为将细胞样本于质量浓度为10%的三氯こ酸溶液中固定60min，用去离子水洗涤IOsec。更优选地，所述的细胞样本是细胞涂片或组织切片。其中细胞涂片可以是细胞手エ涂片或液基膜式薄层细胞学涂片，组织切片可以是冰冻切片或石蜡切片。优选地，所述的第二步的具体步骤为用Harris苏木素对第一歩所得的细胞样本的细胞核进行染色9min，用自来水冲洗Imin后，用去离子水洗30sec，再浸入去离子水IOsec0优选地，所述的第三步的具体步骤为用无花果叶提取液孵育第二步所得的细胞样本3min,用去离子水洗Imin,再浸入去离子水lOsec。优选地，所述的第四步的具体步骤为用新品红染色液孵育第三步所得的细胞样本Imin,用去离子水洗Imin,再浸入去离子水lOsec。 优选地，所述的第五步的具体步骤为用亮绿染色液孵育第四步所得的细胞样本Imin,用去离子水洗30sec,再浸入去离子水lOsec。优选地，所述的第六步的具体步骤为将第五步所得的细胞样本晾干，用中性树胶封片。本发明首次使用无花果叶提取物用于宫颈癌早期诊断，以增强细胞对染色试剂的亲和性，提高染色效率和细胞的辨别率，提高宫颈癌诊断的准确率。本发明可以对细胞在保持形态的基础上增加了不同顔色鉴别，该项技术具有顔色区别和细胞形态分析的双重功能。本发明染色的反应速度快，操作步骤简单，耗时短，同时能满足筛选非典型细胞所需的技术要求，为宫颈癌早期诊断和鉴别诊断提供了有效的工具。


图I是本发明方法染色的正常/萎缩或化生的上皮细胞和子宫颈管上皮细胞显微照片。图IA为正常鳞状上皮细胞、萎缩或化生的鳞状上皮胞质染色绝大多数为蓝色/緑色，核染色蓝色/緑色或淡紅色/粉色，其中萎缩鳞状细胞自溶可导致裸核与化生的鳞状上皮核大多数呈红粉色。少数细胞胞质染色为淡红色/粉色，此时按形态学标准而确定为正常的表面鳞状上皮细胞)(a为手工涂片，b为TCT涂片)；图IB为成团宫颈鳞状上皮细胞(多于5个细胞)多数外周细胞胞质和胞核为绿色或蓝色，细胞团中心细胞胞质和胞核为粉红色或红色(a为手工涂片，b为TCT涂片)；图IC为子宫颈管上皮细胞、胞核和胞质染色红色(a为手工涂片，b为TCT涂片)。图2为不典型细胞(CIN和SCC)染色显微照片。图2A为CIN1-2细胞核増大，核染色质分布均匀呈粗颗粒状，或密集深染。胞核染色呈红色，胞质染色呈红色(a为手工涂片，b为TCT涂片)；图2B为CIN3不典型细胞和癌细胞。CIN3细胞或SCC细胞形态不规则，表现为核染色质细腻或粗糙(颗粒状)核呈显著的核裂或凹槽。SCC细胞比CIN3细胞小，细胞核呈粗糙块状，染色质显著不规则分布，核异型性明显，常出现大核仁或裸核。CIN3细胞或SCC细胞胞核和胞质染色呈红色。细胞背景中常伴有较多的红细胞(红细胞染色呈绿色)显示出血(a为手工涂片，b为TCT涂片)。
图3是炎症细胞和红细胞染色显微照片。图3A为炎症细胞核为红色，胞质染色为绿色/蓝色；图3B为红细胞胞质均呈绿色(a为手工涂片，b为TCT涂片)。图4手工涂片经不同固定后本发明方法染色显微照片。图4A正常鳞状上皮为蓝色/绿色(a =Spray CYTOFIX 喷雾固定;bこ醇固定)；图4B ;不典型细胞为红色(a Spray CYTOFIX 喷雾固定;bこ醇固定)；图4C ;癌细胞呈红色(a =Spray CYTOFIX 喷雾固定;bこ醇固定)。图5是CIN和SCC组织切片经本发明方法染色和H&E染色的结果显微照片(其中A1-A4为H&E染色的四张切片，B1-B4为本发明方法染色的四张切片)。
具体实施例方式为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。实施例一、试剂盒及试剂的制备方法一种细胞染色试剂盒，其盒体内装有无花果叶提取液、碱性染料、酸性染料和细胞核染色试剂。所述的无花果叶提取液通过将无花果叶提取物(10 I)(购自西安斯诺特生物技术有限公司)溶解在体积浓度为70%的こ醇溶液中配制得到，其中无花果叶提取物的终浓度为 30% (w/v) 所述的碱性染料为新品红染色液(New Fuchsin solution),通过将新品红粉末(购自美国Sigma公司)溶解在体积浓度为20%的酒精溶液中配制得到，其中新品红的终浓度为0. 5% (w/v)，使用前静置避光24h。所述的酸性染料为亮绿染色液(Light Green solution),通过将亮绿粉末(购自美国Merck公司)溶解在体积浓度为20%的酒精溶液中配制得到，亮绿的终浓度为0. 4%(w/v)，使用前静置避光24h。所述的细胞核染色试剂为Harris苏木素染色剂，采用常规方法配制。其它试剂包含10%三氯こ酸溶液(Trichloroacetic acid, TCA)和こ醇溶液，皆采用常规方法配制。ニ、病例来源病例600例阴道细胞涂片分别来自南通大学附属肿瘤医院、昆山市第一人民医院、如东县人民医院、南通市八仙花苑社区杏林妇科病诊所，其中手エ涂片440例，TCT涂片160例。分别对手工涂片和TCT涂片用本发明试剂盒染色和H&E染色，对涂片诊断的宫颈SCC和高级别上皮内瘤变CIN3病例进ー步手术活检确诊。三、染色步骤I、涂片准备(I)手工涂片440例，每例涂4片，其中2片采用喷雾细胞固定(SprayCFT0FIX )，分别用步骤2中本发明方法染色和步骤3中H&E染色，另外2片采用体积浓度为95 %的こ醇溶液固定，分别用步骤2中本发明方法染色和步骤3中H&E染色。喷雾细胞固定(SurgipathMedical Industries, INC. P. 0. BOX 528/5205Rte. 12 Richmond, IL60071)在手工涂片完成2-5sec内，距离涂片30cm从左至右均匀喷至整个细胞区，重复3次，喷雾固定IOmin自然晾干。こ醇固定手工涂片完成后将玻片浸入体积浓度为95%的こ醇溶液IOmin以上，自然晾干。⑵TCT涂片160例，宫颈刷刷到细胞后浸入体积浓度为95%的こ醇溶液IOmin以上，待细胞离心后经TCT仪(ZP-b膜式，湖北孝感宏翔生物医械技术有限公司)每例制备2张TCT涂片，分别用步骤2中本发明方法染色和步骤3中H&E染色。步骤2、本发明方法染色如下(手工涂片和TCT涂片步骤相同):(I)将细胞涂片于质量浓度为10%的三氯こ酸溶液中固定60min，用去离子水洗漆 IOsec0
(2)用Harris苏木素对细胞核进行染色9min，用自来水冲洗Imin后，用去离子水洗30sec,再浸入去离子水lOsec。(3)用无花果叶提取液孵育3min，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(4)用新品红染色液孵育lmin，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(5)用亮绿染色液孵育lmin，用去离子水洗30sec，再浸入去离子水lOsec。(6)晾干，用中性树胶封片，染色完成后4°C存放、尔后观察。步骤3、H&E染色手工涂片按常规操作方法分别用Harris苏木素染色剂染色细胞核，用伊红染色剂染色细胞质。TCT涂片按液基仪器预先设计的程序自动化控制染色。步骤4、组织切片染色对涂片诊断的宫颈SCC和高级别上皮内瘤变CIN3病例进一歩手术活检，标本经质量浓度为4%的甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片4 y m厚，采用于与步骤2和步骤3相同的方法分别进行本发明方法染色和H&E染色，进行病理诊断。四、观察在10倍镜下仔细观察本发明方法染色涂片，平均每个视野至少有8个细胞。20倍和40倍镜下观察任何可疑或成簇细胞，特别关注红染或紫染细胞。对于几项检查进行95%可信区间(Confidence Intervals, Cl)估价,采用公式敏感性=真阳性病例/(真阳性病例+假阴性病例)X100%;特异性=真阴性病例/(真阴性病例+假阳性病例)X 100%。五、結果I、本发明方法染色阴道细胞的形态和颜色表现在手工涂片和TCT涂片中本发明方法染色阴道细胞较好的显示了细胞的形态学特征，细胞轮廓清晰，细胞膜完整(有时可出现< 20%的细胞丧失了膜的完整性，但未见胞质溢出)。同时各类细胞显示的顔色和形态密切相关。在手工涂片440例中诊断为宫颈SCC14例、CIN58例(CIN3 21例，CIN1-2 37例)、炎症改变(包括霉菌、滴虫感染等)328例和相对正常细胞40例。TCT涂片160例中宫颈SCC 18例、CIN 58例(CIN3 23例，CIN1-2 35例)、炎症改变(包括霉菌、滴虫感染)75例和相对正常细胞9例。(I)正常上皮细胞浅表鳞状上皮细胞包括基底细胞、中间细胞和成熟细胞。从基底细胞到成熟细胞的细胞形状是从椭圆形到多边形，细胞单核从大到小，细胞质从少到多。本发明方法染色后正常单个鳞状细胞(非成团细胞)胞质为蓝色或緑色。萎缩鳞状细胞通常是中间细胞的5倍。自溶可能导致裸核。本发明方法染色后细胞核呈红粉色，细胞质绝大多数是蓝色或者緑色。化生的鳞状细胞椭圆形，本发明方法染色后细胞核大多数呈红粉色，细胞质呈蓝色/緑色或者红粉色。在成团宫颈鱗状细胞(多于5个细胞)中，多数外周细胞胞质和胞核为緑色或蓝色，细胞团中心细胞为粉红色或红色。子宫颈管上皮细胞立方形，核圆较小，胞质少，细胞成团排列。本发明方法染色后胞质和核呈鲜红色(如图I所示)。(2)不典型细胞与癌细胞不典型细胞往往出现在重度炎症或CIN的病灶中，后者进ー步分为低级别CIN1-2和高级别CIN3。炎症中不典型细胞的主要特点为核増大，约为中间细胞核的2. 5 3倍，但核染色质或核形态规则。CIN1-2细胞核增大至中间细胞核的3倍以上，核染色质分布均匀呈粗颗粒状，或密集深染，常无核仁或不显著。CIN3细胞大小不一、核异形，常见显著的核裂或凹槽，核染色质可细腻或粗糙(颗粒状)，核仁缺如或偶见。SCC细胞与CIN3特征相似，但核异型更明显，常出现大核仁或裸核，细胞核染色质分布不均、粗糙块状。癌细胞的背景中常伴有较多的红细胞，提示由癌细胞侵袭所致的出血。经本发明方法染色后不典型细胞 与癌细胞胞质和胞核均呈红色(如图2所示)(3)炎症细胞和红细胞炎症细胞核较小分叶状,细胞质少或缺失,胞核呈红色(有时可呈蓝色或绿色< 20%)，炎症细胞胞质为蓝色或緑色。红细胞胞质均呈绿色(如图3所示)。2本发明方法染色与H&E染色的比较(I)在手工涂片和TCT涂片中分别比较本发明方法染色和H&E染色的诊断结果(表I)表I本发明方法染色和H&E染色比较
Wm手工涂片(440例)^TCT涂片(160例)
本发明方法HWJ染色本发明方法H&E染色
炎症/正常 3683858484
CIN1-2 37403535
CIN3 21222222
SCC 14131919本发明方法检查中有2例SCC在H&E染色的涂片中诊断为CIN3，有I例CIN3在H&E染色的涂片中诊断为CIN2。本发明方法检查结果和TCT涂片检查结果相同。3手工涂片经不同固定后本发明方法染色结果无论是喷雾细胞固定还是95%こ醇固定，涂片经本发明方法染色均较好的显示细胞的形态学特征，正常鳞状上皮胞质染色绝大多数为蓝色/绿色，核染色为蓝色/绿色或淡红色/粉色，子宫颈管上皮细胞胞质和核染色为鲜红色，不典型细胞与癌细胞胞核和质染色呈红色。炎症细胞核为红色，胞质染色大多数为绿色/藍色，红细胞均呈绿色。细胞显示的顔色和形态密切相关。不同固定中本发明方染色的结果完全一致(图4，表2)。表2不同固定中本发明方法染色的结果
权利要求
1.一种细胞染色试剂盒，其特征在于，包含无花果叶提取液、碱性染料、酸性染料和细胞核染色试剂。
2.如权利要求I所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的碱性染料为新品红染色液。
3.如权利要求I所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的酸性染料为亮绿染色液。
4.如权利要求I所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的细胞核染色试剂为Harris苏木素染色剂。
5.权利要求1-4中任一项所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，依次包括如下步骤 第一步将细胞样本用固定剂固定后，用去离子水洗涤； 第二步用细胞核染色试剂对第一步所得的细胞样本的细胞核进行染色，用自来水冲洗后，再用去离子水洗涤； 第三步用无花果叶提取液孵育第二步所得的细胞样本，用去离子水洗涤； 第四步用碱性染料孵育第三步所得的细胞样本，用去离子水洗涤； 第五步用酸性染料孵育第四步所得的细胞样本，用去离子水洗涤； 第六步将第五步所得的细胞样本干燥后，封片观察。
6.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的第一步的具体步骤为将细胞样本于质量浓度为10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去离子水洗涤IOsec0
7.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的细胞样本是细胞涂片或组织切片。
8.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的第二步的具体步骤为用Harris苏木素对第一步所得的细胞样本的细胞核进行染色9min,用自来水冲洗Imin后,用去离子水洗30sec,再浸入去离子水lOsec。
9.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的第三步的具体步骤为用无花果叶提取液孵育第二步所得的细胞样本3min，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。
10.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的第四步的具体步骤为用新品红染色液孵育第三步所得的细胞样本lmin，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。
11.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的第五步的具体步骤为用亮绿染色液孵育第四步所得的细胞样本lmin，用去离子水洗30seC，再浸入去离子水lOsec。
12.如权利要求5所述的细胞染色试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的第六步的具体步骤为将第五步所得的细胞样本晾干，用中性树胶封片。
全文摘要
本发明提供了一种细胞染色试剂盒及其使用方法。所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，包含无花果叶提取液、碱性染料、酸性染料和细胞核染色试剂。本发明首次使用无花果叶提取物用于宫颈癌早期诊断，以增强细胞对染色试剂的亲和性，提高染色效率和细胞的辨别率，提高宫颈癌诊断的准确率。
文档编号G01N1/30GK102866052SQ20121039269
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者朱远源, 陈莉, 李铁军, 吴美华 申请人:百奥迈科生物技术有限公司