专利名称：一种检测人鼻粘膜调节性t淋巴细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及细胞免疫学，更具体地，本发明涉及一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法。
背景技术：
鼻粘膜是上呼吸道粘膜的一部分，是吸入性抗原、毒素和微生物等与机体免疫系统相互作用的第一战场。鼻粘膜的防御机制受体液和细胞免疫应答调控，涉及包括T、B淋巴细胞在内的免疫活性细胞。变应性鼻炎(AR)正是由环境抗原如尘螨、植物花粉和动物蛋白等刺激导致的ー组以鼻腔局部Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)优势表达、嗜酸性粒细胞选择性浸润、黏膜高反应和IgE过度合成为特征的疾病。其中调节性T淋巴细胞(Tregulatory cell, Treg)的减少促进了 Th2型免疫应答。Treg细胞是ー种自然发生的、胸腺来源的CD4+CD25+Treg细胞，能够表达高水平的叉头状/螺旋状转录因子Foxp3 (forkhead·transcription factor p3, Foxp3),其对⑶4+Q)25+Treg细胞的发育和功能至关重要。AR患者外周血单个核细胞中⑶4+⑶25+Foxp3+细胞的比率低于正常人，同时鼻粘膜Foxp3的表达降低，表明Treg细胞功能减弱。对鼻粘膜淋巴细胞的认识十分有限，主要是由于组织来源困难和细胞数量有限，目前鼻粘膜组织的标本来自于经下鼻甲切除术获取的组织，研究的方法有三种
I.将组织制备成石蜡或冰冻切片，再经免疫组织化学染色法或免疫荧光法观察并计数⑶4+⑶25+Foxp3+Treg细胞。但由于Treg细胞数量极少，通常在ー个200倍显微镜观察视野下仅能计数ο-i个。2.将组织匀浆后提取RNA，用RT-PCR的方法检测Foxp3的表达。此仅为间接检测法，不能直接反应Treg细胞的数量及Foxp3蛋白的表达。3.组织经胶原蛋白酶消化后获取单个细胞，再采用流式细胞术检测Treg细胞的表达，可以通过检测大量的细胞对Treg细胞进行分析，但技术步骤繁琐，需要先将组织切成2mm3大小,预消化液37°C消化30min,离心后再经胶原蛋白酶消化60min后过滤细胞等步骤。现有技术中存在以下缺陷
I.由于获得的是下鼻甲组织块，除鼻粘膜组织外还含有较多的鼻粘膜下结缔组织，需要对其进行多次消化，才能获得单细胞悬液，并且消化过程对细胞表面和胞内抗原的数量和功能的影响不可预知。2.上述方法通过下鼻甲切除术获取鼻粘膜组织，需要全身或局部麻酔后施行手术，
局部有出血、创伤、术后鼻腔填塞，并且无法取到正常人的鼻粘膜标本。3.现有技术采用免疫组织化学染色法或免疫荧光法观察的细胞数量非常有限，通
常
在ー个200倍显微镜观察视野下仅能计数0-1个。现有技术采用RT-PCR的方法检测Foxp3基因的表达，仅为间接检测法，不能直接反应Treg细胞的数量及Foxp3蛋白的表达。

发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其采用对受试者无创的方法得到足够的鼻粘膜细胞，快速分析T淋巴细胞。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其包括如下步骤
1)鼻粘膜细胞的获取将鼻粘膜刮匙的勺状末端伸入鼻腔至下鼻甲的中下端，将所 述刮匙轻轻按压在粘膜表面，然后向外移动4-5mm，重复此动作2_3次，取出刮匙，可见
勺状末端内有白色粘性物，获得鼻粘I吴标本；
2)单细胞悬液的制备将所述鼻粘膜标本置于生理盐水中，轻轻吹打，使细胞分散混匀 得到单细胞悬液；
3)调节性T淋巴细胞检测采用流式细胞术分析所述单细胞悬液的T淋巴细胞。本发明的另一方面，所述鼻粘膜细胞的获取步骤包括所述鼻粘膜细胞的获取步骤包括将所述刮匙在粘膜表面向外移动5mm，重复此动作2次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物。本发明的另一方面，所述鼻粘膜细胞的获取步骤中所述下鼻甲的中下端为下鼻甲前部中下端Icm2范围。本发明的另一方面，所述鼻粘膜细胞的获取步骤中轻轻按压为使鼻粘膜下陷1_-2_，以此得到鼻粘膜细胞，而又不会导致鼻粘膜出血。本发明的另一方面，所述单细胞悬液的制备步骤包括将所述鼻粘膜标本置于Iml生理盐水中，用移液器轻轻吹打，使细胞均匀分散，5000rpm离心10分钟，弃上清后，沉淀用200ul PBS重悬，得到单细胞悬液。本发明的另ー实施方式，所述调节性T淋巴细胞检测步骤包括
1)表面染色加IOOul所述细胞于12X75mm流式管中，并加入细胞表面染色抗体； 同型对照管CD3-PerCP 5ul + CD4-APC 2ul + IgGl-FITC，
试验管CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC，涡旋两管，室温避光；
2)洗细胞加PBS，离心，250gX10分钟，弃上清；
3)固定细胞用残液轻轻重悬细胞，加2mlIX人Foxp3反应缓冲液A，涡旋，室温避光，10分钟；
4)洗细胞加PBS,离心，500gX5分钟，弃上清；
5)破膜用残液轻轻重悬细胞，加O.5ml IX人Foxp3反应缓冲液C的工作液，涡旋，
室温避光；
6)洗细胞加PBS，离心，500gX5分钟，弃上清；
7)Foxp3染色同型对照管加入IgGl-PE 5ul ;试验管加入Foxp3_ PE 5ul，轻摇或涡旋，室温避光，30-60分钟，重复洗涤步骤7 ；
8)加300ulPBS，立即上机检测。本发明的另一方面，所述调节性T淋巴细胞检测步骤包括
I)表面染色加IOOul细胞于12X75 mm流式管中，并加入细胞表面染色抗体；同型对照管CD3-PerCP 5ul + CD4-APC 2ul + IgGl-FITC 5ul
试验管CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC 5ul，涡旋两管，室温避光，20 分
钟；
2)洗细胞加2mlPBS,离心，250gX 10分钟，弃上清；
3)固定细胞用残液轻轻重悬细胞,加2mlI X Human Foxp3 Buffer A,润旋,室温避光，10分钟；
4)洗细胞离心，500gX5分钟，弃上清；
5)破膜用残液轻轻重悬细胞,加O. 5ml IX Working Solution Human Foxp3 BufferC，涡旋，室温避光，30分钟；
6)洗细胞加2mlPBS,离心，500gX5分钟，弃上清，重复洗涤步骤I次；
7)Foxp3染色同型对照管加入IgGl-PE 5ul ;试验管加入Foxp3_ PE 5ul，轻摇或涡旋，室温避光，30分钟，重复洗涤步骤7 ；
8)加300ulPBS，立即上机检测。本发明首次用鼻粘膜刮匙刮取患者下鼻甲中下端少许鼻粘膜来測定淋巴细胞表面标志，分析调节性T细胞数量，其选定的过程中，本发明通过控制部位的范围，以及刮取的力度较好的得到鼻粘膜细胞。本发明的刮取过程包括向外移动4_5mm，重复此动作2_3次，这样不仅能防止损伤鼻粘膜，而且能得到更多的鼻粘膜细胞。所述鼻粘膜细胞的获取步骤中轻轻按压为使鼻粘膜下陷1_-2_，刮取鼻粘膜细胞的力度对结果有显著影响，力量太轻，无法得到鼻粘膜细胞，仅为粘膜表面的粘液，力量过大，会导致鼻粘膜出血。本发明的測定方法简单易操作。因为本发明的鼻粘膜细胞的获取非常简单，可直接得到鼻粘膜细胞的单细胞悬液，并立即用于流式细胞測定，无需繁杂的组织消化、使细胞单个化的实验步骤，后续测定步骤也很容易进行，不需要经过复杂的步骤过程，就能比较好的測定其指标。本发明的g是RCF (Relative Centrifugal Force):相对离心力，用重力加速度(g)的倍数表示。本发明的有益效果为
O标本采集无创本发明采用刮匙采集鼻粘膜标本，局部无出血和损伤，受试者无不适。2)标本处理简单快速且为单细胞悬液本专利获取的是鼻粘膜细胞，无需任何消化处理步骤，标本经反复吹打后即为单细胞悬液，可直接用于流式细胞分析，获取鼻粘膜细胞数量约为3X105，足够用于流式细胞分析。3)可在细胞水平高通量地分析Treg细胞的数量及其Foxp3蛋白的表达流式细胞术可以明确分析20000个总的鼻粘膜细胞中数千个⑶3+T淋巴细胞中Treg细胞及其Foxp3蛋白的表达。


图I.正常人的鼻粘膜T淋巴细胞。图2.本发明方法获得的变应性鼻炎患者调节性T淋巴细胞。
图3.本发明方法获得的另ー变应性鼻炎患者调节性T淋巴细胞。其中A:显示⑶3+T淋巴细胞；B:显示⑶3+⑶4+T淋巴细胞；C:显示CD3+CD4+CD25+Foxp3+T 淋巴细胞。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进ー步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明的详细实验步骤如下
(I)鼻粘膜细胞的获取鼻镜撑开前鼻孔，在直视下将鼻粘膜刮匙(ASI Rhino-Pro O R Nasal Mucosal Curette, Arlington Scientific, Inc.)的勺状末端申入鼻腔至下鼻甲前部的中下端，将刮匙轻轻按压在粘膜表面，向外移动4-5mm，重复此动作2_3次。拿出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物。(2)单细胞悬液的制备将鼻粘膜放入Iml生理盐水中，用移液器轻轻吹打，使细胞均匀分散。5000rpm离心10分钟，弃上清后，沉淀用200ul PBS重悬、计数。(3)调节性 T 细胞(Foxp3)检测(BD Pharmingen, CA, USA)
试剂准备Buffer A和Buffer C使用前新鲜配制
I X Human Foxp3 Buffer A :用去离子水稀释 IOXHuman Foxp3 Buffer A 至 IX 工作浓度。Working Solution Human Foxp3 Buffer C 的配制Foxp3 Buffer B 与 I XHumanFoxp3 Buffer A按I :50的比例混合。I)表面染色加IOOul细胞(约I X 105个细胞)于12X75 mm流式管中，并加入
细胞表面染色抗体。同型对照管CD3-PerCP5ul + CD4-APC 2ul + IgGl-FITC 5ul
试验管CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC 5ul ;涡旋两管，室温避光，20 分钟。2)洗细胞加2ml PBS,离心，250gX 10分钟，弃上清。3)固定细胞用残液轻轻重悬细胞,加2ml I X Human Foxp3 Buffer A,润旋,室温避光，10分钟。4)洗细胞离心，500gX5分钟，弃上清。注意，此时的细胞沉淀较松散。加2mlPBS，离心，500gX 5分钟，弃上清。5)破膜用残液轻轻重悬细胞,加 0. 5ml IX Working Solution Human Foxp3Buffer C，涡旋，室温避光，30分钟。6)洗细胞加2ml PBS，离心，500gX 5分钟，弃上清。重复洗涤步骤I次。7) Foxp3染色同型对照管加入IgGl-PE 5ul ;试验管加入Foxp3_ PE 5ul，轻摇或涡旋，室温避光，30分钟。重复洗涤步骤7。8)加300ul PBS，立即上机检测。实施例检测变应性鼻炎患者和正常人的鼻粘膜Treg细胞。(I)变应性鼻炎患者的诊断与来源
变应性鼻炎患者来自我院门诊患者，诊断符合中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会制定的《变应性鼻炎诊断标准和治疗指南》。排除对象包括患有慢性鼻-鼻窦炎及鼻息肉，重度鼻中隔偏曲，以及其它慢性心、肺、内分泌功能失调的病人。正常人来自我院体检人员。
(2) Treg细胞的检测
用鼻粘膜刮匙刮取下鼻甲下中端鼻粘膜，置于生理盐水中吹打混匀，离心后弃上清，获取细胞沉淀，计数。标记细胞表面⑶3、⑶4、⑶25，洗涤并固定细胞后破膜，标记胞内Foxp3。采用流式细胞术检测。(3)结果
I)刮取鼻粘膜细胞时，所有变应性鼻炎患者和正常人均无不适，局部无出血。2)刮取的鼻粘膜细胞置于生理盐水中吹打混匀后，立即获得了鼻粘膜单细胞悬液，数量约3 X IO5个。3)采用流式细胞术获取了 20000个总细胞，其中如图3所示中A的⑶3+T淋巴细胞 4887 个；B 的 CD3+CD4+T 淋巴细胞 517 个；C 的 CD3+CD4+CD25+Foxp3+T 淋巴细胞 43 个。从大量的细胞中精确分析得到了调节性T细胞。如图2所示A的CD3+T淋巴细胞6244个；B的CD3+CD4+T淋巴细胞491个；C的CD3+CD4+CD25+Foxp3+T 淋巴细胞 93 个。如上述图所示，通过本发明方法能得到较多的T淋巴细胞，这样就能比较好的测定检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞，以此来了解和研究鼻腔局部的免疫细胞及其功能，进一步阐明局部免疫应答可能的机制。本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员參照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
权利要求
1.一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤 鼻粘膜细胞的获取将鼻粘膜刮匙的勺状末端伸入鼻腔至下鼻甲的中下端，将所 述刮匙轻轻按压在粘膜表面，然后向外移动4-5mm，重复此动作2_3次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物，获得鼻粘I吴标本； 2)单细胞悬液的制备将所述鼻粘膜标本置于生理盐水中，轻轻吹打，使细胞分散混匀得到单细胞悬液； 3)调节性T淋巴细胞检测采用流式细胞术分析所述单细胞悬液的T淋巴细胞。
2.如权利要求I所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述 鼻粘膜细胞的获取步骤包括将所述刮匙在粘膜表面向外移动5mm，重复此动作2次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物。
3.如权利要求I所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述 鼻粘膜细胞的获取步骤中所述下鼻甲的中下端为下鼻甲前部中下端Icm2范围。
4.如权利要求I所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述 鼻粘膜细胞的获取步骤中轻轻按压为使鼻粘膜下陷lmm-2mm，以此得到鼻粘膜细胞，而又不会导致鼻粘膜出血。
5.如权利要求I所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述单细胞悬液的制备步骤包括将所述鼻粘膜标本置于Iml生理盐水中，用移液器轻轻吹打，使细胞均匀分散，5000rpm离心10分钟，弃上清后，沉淀用200ul PBS重悬后得到单细胞悬液。
6.如权利要求I所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述 调节性T淋巴细胞检测步骤包括 O表面染色加IOOul所述细胞于12 X 75mm流式管中，并加入细胞表面染色抗体； 同型对照管CD3-PerCP 5ul + CD4-APC 2ul + IgGl-FITC， 试验管CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC，涡旋两管，室温避光； 2)洗细胞加PBS,离心，250gX10分钟，弃上清； 3)固定细胞用残液轻轻重悬细胞，加2mlIX人Foxp3反应缓冲液A，涡旋，室温避光，10分钟； 4)洗细胞加PBS，离心，500gX5分钟，弃上清； 5)破膜用残液轻轻重悬细胞，加O.5ml I X人Foxp3反应缓冲液C的工作液，涡旋，室温避光； 6)洗细胞加PBS，离心，500gX5分钟，弃上清； 7)Foxp3染色同型对照管加入IgGl-PE 5ul ;试验管加入Foxp3_ PE 5ul，轻摇或涡旋，室温避光，30-60分钟，重复洗涤步骤7 ； 8)加300ulPBS，立即上机检测。
7.如权利要求6所述的检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述 调节性T淋巴细胞检测步骤包括 O表面染色加IOOul所述细胞于12 X 75mm流式管中，并加入细胞表面染色抗体； 同型对照管CD3-PerCP 5ul + CD4-APC 2ul + IgGl-FITC 5ul 试验管CD3-PerCP 5ul +CD4-APC 2ul +CD25-FITC 5ul，涡旋两管，室温避光，20 分钟； 2)洗细胞:加2mlPBS，离心，250gX10分钟，弃上清; 3)固定细胞用残液轻轻重悬细胞,加2mlI XHuman Foxp3 Buffer A,润旋,室温避光，10分钟； 4)洗细胞离心，500gX5分钟，弃上清； 5)破膜用残液轻轻重悬细胞，加0. 5ml I Xfforking Solution Human Foxp3 BufferC，涡旋，室温避光，30分钟； 6)洗细胞加2mlPBS，离心，500gX5分钟，弃上清，重复洗涤步骤I次； 7)Foxp3染色同型对照管加入IgGl-PE 5ul ;试验管加入Foxp3_ PE 5ul，轻摇或涡 旋，室温避光，30分钟，重复洗涤步骤7 ； 8)加300ulPBS，立即上机检测。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种检测人鼻粘膜调节性T淋巴细胞(Treg)的方法，其包括如下步骤1)鼻粘膜细胞的获取将鼻粘膜刮匙的勺状末端伸入鼻腔至下鼻甲的中下端，将所述刮匙轻轻按压在粘膜表面，然后向外移动4-5mm，重复此动作2-3次，取出刮匙，可见勺状末端内有白色粘性物，获得鼻粘膜标本；2)单细胞悬液的制备将所述鼻粘膜标本置于生理盐水中，轻轻吹打，使细胞分散混匀得到单细胞悬液；3)调节性T淋巴细胞检测采用流式细胞术分析所述单细胞悬液的T淋巴细胞。
文档编号G01N15/14GK102706789SQ20121021964
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者庞权, 李文秀, 白素娟, 金姝, 闫佩毅 申请人:上海市普陀区人民医院