专利名称：凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法
技术领域：
本发明涉及在通过凝胶化反应使测定对象的试样中的内毒素和/或β-D-葡聚糖等目标物质凝胶粒子化后所使用的凝胶粒子测定试剂，特别是涉及试图早期(快速地)测定凝胶粒子开始出现的时间点的凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法。
背景技术：
所谓的内毒素，主要是不被革兰氏染色法染色的(革兰氏阴性)菌的菌体膜成分的一部分，其成分是被称为脂多糖的脂质多糖类。具体地，是由被称作脂质A (Lipid A)的脂质和多糖链通过2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)结合而成的脂多糖(LPS)，其中含有的被称为脂质A (Lipid A)的脂质结构部分通过感染进入人体时,与细胞的受体结合而引起炎症,在大多数情况下会引起各种各样的重度的临床症状。这样，内毒素是成为人类败血症或菌血症等致死率非常高的临床症状的原因的物质，因此，对进入到体内的内毒素进行评估在临床上的要求很高。另外，药品(注射剂等)和血液制剂.医疗用具(血管导管等)或人工透析中的大量精制水等不被内毒素污染(无热原)是非常重要的，在使用细菌制备的药品(在重组蛋白质、基因治疗中使用的DNA等)或食品添加剂、化妆品等中，适当除去或控制内毒素是不可缺少的。这种内毒素的除去确认或者急救医学中的计测，不仅要求测定的试样数多，而且还要求以救命治疗为目的的迅速性。为了治疗败血症等，测量内毒素值的研究很早就开始了，人们发现鲎(Limulus)的阿米巴样血细胞成分中所含的基因组与内毒素发生特异性反应而成为凝集块堵塞伤口的现象，并据此尝试使用该當的阿米巴样血细胞水解物(Limulus Amebocyte Lysate ;LAL试剂或鲎试剂)对内毒素 进行定量测定。最初的使用鲎试剂的测定方法，仅仅是将其与作为试样的患者血浆混合后静置，在一定时间后倒转过来，通过溶液的凝固来确认混合溶液是否凝胶化，根据引起凝胶化的最大稀释率来推算内毒素的量，这就是被称为所谓凝胶化法的半定量的测定方法。随后，人们着眼于在凝胶化反应过程中浊度的增加，用采用光学测量方法的浊度计，根据伴随静置后的混合溶液的凝胶化反应的浊度变化来定量测定内毒素浓度，这是已知的比浊时间分析法。而且，还已知有显色合成底物法，该方法是将鲎试剂反应过程的最终阶段的凝固蛋白原(Coagulogen)转换为凝固素(Coagulin)的凝胶化反应替换为合成底物的显色反应。该方法是通过加入显色合成底物(Boc-Leu-Gly-Arg-对硝基苯胺)来代替凝固过程中的凝固前体物质(凝固蛋白原=Coagulogen),通过其水解使对硝基苯胺游离，利用其黄色显色的比色来测定凝固蛋白原的分解能力，测定内毒素的浓度。进而，作为以往的内毒素的测定方法，已经采用了例如专利文献I 5所记载的方法。
专利文献I是为了长时间精确度良好地测定水溶液中的内毒素浓度，在含有内毒素的水溶液中使对内毒素具有亲和性、且具有不会阻碍或促进内毒素与鲎的血细胞成分液体之间的反应的性质的水溶液的蛋白质共存，从而稳定化水溶液中的内毒素的方法。专利文献2是为了抑制内毒素的活性,在含有内毒素的试样中使与内毒素相结合且具有抑制内毒素活性的性质的肽衍生物(或蛋白质)和表面活性剂共存的方法。专利文献3是为了利用比浊时间分析法高灵敏度地检测内毒素等，在规定的水溶性聚合物的共存下使鲎的血细胞成分与含有内毒素和/或β -D-葡聚糖的试样混合，测定直至光学变化程度到达规定值的时间，根据所得时间与内毒素等的量的相互关系，求出试样中的内毒素等的量的方法。专利文献4是为了在短时间内正确地测定内毒素和β-D-葡聚糖等利用凝胶化反应测定的物质的浓度，在通过凝胶化反应测定试样中的目标物质的测定装置中，对收纳有含有目标测定物质的检品和含有引起凝胶化的试剂的溶液的试样池照射发光二极管的照明光，利用搅拌棒搅拌试样中的溶液，产生微小而均匀的凝胶粒子，使它们通过照明光；进而，利用二极管检测在试样池中生成的凝胶粒子的透射光，基于该透射光检测输出，测定所产生的凝胶粒子的大小和量的变化，由此测定溶液中的上述物质的浓度的技术。专利文献5为具备试样池、预先收纳在该试样池内且与试样中的目标物质反应而发生凝胶化的试剂、为了抑制预先被收纳并注入到试样池内的含有试样和试剂的混合溶液全体发生凝胶化而对混合溶液进行搅拌的搅拌部件、以及，在上述试剂及搅拌部件收纳在试样池内的状态下密封试样池的开口且在密封后可向试样池内注入试样的密封部件，在将试样注入到试样池内的时间点，开始搅拌部件的搅拌操作，在抑制混合溶液全体发生凝胶化的状态下生成凝胶粒子的技术。进而，利用凝胶化反应的测定技术不仅可用于上述内毒素的测定，而且可用于β -D-葡聚糖(β -D-glucan)等的测定。

β-D-葡聚糖为构成具有真菌特征的细胞膜的多糖(多糖体)。通过测定该β -D-葡聚糖，不仅是对诸如念珠菌、曲霉或隐球菌等一般在临床上常见的真菌，而且对包括稀有真菌在内的大范围内的真菌感染症的筛分等均有效。在该β-D-葡聚糖的测定中，利用β-D-葡聚糖来使鲎的血细胞提取成分凝胶化，然后采用上述的凝胶化法和/或比浊时间分析法、显色合成底物法来进行测定。内毒素和β-D-葡聚糖的测定方法具有共同点，例如，采用大致相同的测定硬件，通过从鲎的血细胞提取成分中除去与β-D-葡聚糖发生特异性反应的G因子(Factor G)成分，能够测定内毒素的选择性凝胶化反应和/或显色反应，并且通过预处理使试样中的内毒素失活，能够测定β -D-葡聚糖的选择性凝胶化反应和/或显色反应。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利第2817606号公报(发明内容部分)专利文献2:日本专利第3106839公报(发明内容部分)专利文献3:日本专利第3327076号公报(发明内容部分)专利文献4:W02008-139544号公报(具体实施方式
部分，图1)专利文献5:日本特开2010-085276号公报(具体实施方式
，图1)

发明内容
发明要解决的课题但是，在以往的凝胶化法、比浊时间分析法及显色合成底物法中，存在以下缺点。凝胶化法及比浊时间分析法虽然均生成凝胶，但是在低浓度下，需要约90分钟以上的长时间。即，虽然反应溶液的凝胶化时间与作为测定对象的试样中的目标物质的浓度呈正比，但凝胶化法及比浊时间分析法均由于灵敏度的问题而不能检测出准确的凝胶化开始时间等，因而只能依据进行至某种程度的凝胶化的时间来计算反应量，以此作为凝胶化时间的基准。例如以比浊时间分析法为例进行说明，比浊时间分析法是这样一种定量法，虽然通过在同一条件下制备试剂，变化开始时的最初浓度水平的浊度和变化达到目的时的浓度水平的浊度是知道的，但各种以S形曲线变化的浊度变化开始时间和结束时间却很难知道，通过测定最初和最终水平之间的一定水平的变化到达(浊度的增加)，转变为对凝胶化全体的变化观察，以此进行定量。但是，如果变成低浓度的内毒素，则体系全体的凝胶化就会推迟，由此，所观测到的浊度变化也随之变慢，以致于难以测定至一定水平的变化到达，在此情况下，灵敏度必然变得迟钝。因此，很难说凝胶化法和比浊时间分析法都是适合于需要急救的情况或者可测定许多检品的方法。此外，在比浊时间分析法中往往产生与内毒素无关的非特异性的混浊，因此，有可能欠缺测定精度。另外，凝胶化法的测定界限浓度为3pg/ml，比浊时间分析法的测定界限浓度为lpg/ml左右。予以说明，作为适用于凝胶化反应测定装置的比浊时间分析法，即使假定适合采用专利文献I所示的散射测光法，但作为替换为溶液全体的凝胶化的变化观察的定量法，仍然不能解决上述问题。另一方面，虽然显色合成底物法与凝胶化法和比浊时间分析法相比，测定时间缩短至约30分钟左右，但是在临床试样等天然物的测定中，有时发生由作为使用人工底物的弊端而混在的非特异性蛋白分解酶所引起的伪阳性反应，难以对临床试样等进行特异度较高的测定，引发丧失测定的可靠性的问题。另外，测定准备工作繁琐，测定界限浓度也为3p g/ml,劣于比池时间分析法。另外，在专利文献1、2中，均是以对内毒素的长时间测定为前提，只不过是提供了稳定水溶液中的内毒素或者抑制内毒素的活化的方法。另外，专利文献3、4由于是以比浊时间分析法为前提，为了求得内毒素的量，必须引起溶液全体的凝胶化、通过浊度估算其凝胶化速度、由此演算内毒素的浓度。在该方面，专利文献5是本申请人之前申请的方式，例如，在含有内毒素的试样中混合试剂，一边抑制混合溶液全体的凝胶化、一边使凝胶粒子出现，通过光学检测装置检测该凝胶粒子的出现时间点。相对于例如专利文献3、4的方式那样的以混合溶液全体的凝胶化状态为检测对象，该方式由于以相当于混合溶液从溶胶相相变至凝胶相的时间点的凝胶粒子生成开始时间点作为检测对象，因此与专利文献3、4的方式相比，能够在短时间内以高灵敏度捕捉混合溶液向凝胶化的转移现象，在此方面优异。
本申请人为了更为便捷地使用该方式，发现了对溶胶相向凝胶相的稳定相转变进行控制的新型凝胶粒子测定试剂，至此完成了本发明。本发明提供在早期(快速地)测定凝胶粒子的生成开始时间点方面有效的凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法。解决课题的手段第I项发明为一种凝胶粒子测定试剂，其混合在含有作为测定对象的目标物质的试样中，在使所述目标物质发生凝胶粒子化后使用，其特征在于，包含:与所述目标物质之间发生凝胶化反应的试剂基剂；和添加到该试剂基剂中的、对所述试样具有可溶性并以0.002 1%的浓度溶解、且促进集中在规定范围粒径的凝胶粒子生成的、生物学惰性的粒子形成促进因子。第2项发明为第I项发明所述的凝胶粒子测定试剂，其特征在于，上述粒子形成促进因子为可溶性的热变性蛋白质。第3项发明为第I项发明所述的凝胶粒子测定试剂，其特征在于，上述粒子形成促进因子为可溶性的、惰性的、生物来源的高分子或石油高分子化学成分来源的多孔微粒。第4项发明为第I 3任一项发明所述的凝胶粒子测定试剂，其特征在于，作为测定对象的目标物质为内毒素和/或β -D-葡聚糖，试剂基剂为鲎试剂。第5项发明为一种凝胶粒子测定方法，其通过凝胶化反应使试样中的目标物质发生粒子化来进行测定，其特征在于，包括:收纳工序，在至少一部分具有使光入射的入射部和使光射出的出射部的试样池中，收纳含有作为测定对象的目标物质的试样和含有用于使所述目标物质发生凝胶化的第I 4任一项发明所述的凝胶粒子测定试剂的溶液；搅拌工序，为了抑制该试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液全体发生凝胶化，使用搅拌装置搅拌所述混合溶液；光照射工序，由设置在所述试样池的入射部外部的入射光源对所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液照射相干光；检测工序，使用设置在所述试样池的出射部外部的检测装置，检测在所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液中对在所述混合溶液从溶胶相相变至凝胶相的时间点生成的凝胶粒子发生散射或透射的光成分；和凝胶粒子生成判别工序，基于上述检测工序得到的检测输出，判别混合溶液内的所述凝胶粒子的生成开始时间点。发明效果根据第I项发明，可以提供在早期测定凝胶粒子的生成开始时间点方面有效的凝胶粒子测定试剂。根据第2或第3项发明，使用代表性的粒子形成促进因子，可以简单地制造凝胶粒子测定试剂。
根据第4项发明，可适用于作为测定对象的目标物质的内毒素和/或β -D-葡聚糖的定量。根据第5项发明，可以早期(快速地)测定凝胶粒子的生成开始时间点。


[图1](a)是表示本发明采用的凝胶粒子测定试剂的实施方式的概要的说明图、(b)是表示本实施方式所采用的凝胶粒子测定方法的模式图、(C)为表示作为(b)的测定方法的测定原理的凝胶化反应进行工序中的反应时间与散射光强度的关系的说明图。[图2](a)为示意性表示使用本实施方式的凝胶粒子测定试剂时产生的凝胶粒子的生成过程的说明图、(b)为示意性表示使用比较方式的凝胶粒子测定试剂时产生的凝胶粒子的生成过程的说明图。[图3]为示意性表示使用鲎试剂时的内毒素的凝胶化反应过程的说明图。[图4]是表示实施方式I的凝胶粒子测定装置的说明图。[图5]Ca)是表示实施方式I中所用激光光源、后方散射光检测器的构成例的说明图、(b)为(a)的一部分截面平面说明图。[图6](a)是表示实施方式I所用的试样池的分解斜视图、(b)为其截面说明图。[图7](a)是表不对凝胶粒子照射相干光时的散射光的散射方向的说明图、(b)是表示伴随凝胶粒子的粒径变化的散射光的光度分布的说明图。[图8]是表示实施方式I的凝胶粒子测定装置的数据分析处理的一例的流程图。[图9](a)是表示对已知内毒素浓度的试样进行后方散射测光的凝胶粒子的检测例的说明图，(b)是表示使用(a)的结果的标准曲线制作例的说明图。[图10](a)是表示对添加有标准品内毒素的水试样，使用实施方式I的凝胶粒子测定装置进行后方散射测光的实测数据例的说明图，(b)是表示对添加有与(a)相同的标准品内毒素的水试样，使用比较方式I的凝胶粒子测定装置进行前方散射测光的实测数据例的说明图，(C)是表示对添加有与(a)相同的标准品内毒素的水试样，使用比较方式2的凝胶粒子测定装置进行前方透射光的实测数据例的说明图。[图11](a) (b)是表示实施方式I的凝胶粒子测定装置的变形方式的说明图。[图12]Ca)是表示实施方式2的凝胶粒子测定装置的说明图、(b)是从(a)中B方向观察的矢量图。[图13]是表示实施方式2的凝胶粒子测定装置的数据分析处理的一例的流程图。[图14]Ca)是表示对已知内毒素浓度的试样进行透射测光的凝胶粒子的检测例的说明图，(b)是表示使用(a)的结果的标准曲线制作例的说明图。[图15](a) (C)是表示在实施例1中，作为粒子形成促进因子，在利用无内毒素、经热变性的血浆的方式下，改变相对于同一内毒素浓度(10pg/ml)的该血浆浓度时的凝胶粒子的生成过程的说明图(1)，Ca)表示血浆浓度为0.2%的情况、(b)表示血浆浓度为0.1%的情况、(c)表示血浆浓度为0%的情况。[图16](a) (b)是表示在实施例1中，作为粒子形成促进因子，在利用无内毒素、经热变性的血浆的方式下，改变相对于同一内毒素浓度(10pg/ml)的该血浆浓度时的凝胶粒子的生成过程的说明图(2)，Ca)表示血浆浓度为10%的情况、(b)表示血浆浓度为5%的情况。[图17](a) (b)是表示在实施例1中，作为粒子形成促进因子，在利用无内毒素、经热变性的血浆的方式下，改变相对于同一内毒素浓度(10pg/ml)的该血浆浓度时的凝胶粒子的生成过程的说明图(3)，(a)表示血浆浓度为1%的情况、(b)表示血浆浓度为0.5%的情况。[图18]是表不图15 图17的相对于同一内毒素浓度(10pg/ml)的热变性血衆蛋白质浓度与直至凝胶粒子开始生成的反应时间之间的关系的图。[图19]是表示对于在凝胶粒子测定试剂中添加作为粒子形成促进因子的变性蛋白质的实施例2和在凝胶粒子测定试剂中代替实施例2的变性蛋白质添加未变性蛋白质的比较例，使浓度变化时的凝胶粒子的生成过程的说明图。[图20]是表示对于实施例2和比较例，变性蛋白质、未变性蛋白质的浓度与直至生成凝胶粒子的反应时间之间的关系的图。[图21](a) (C)是表示在实施例3中，在对含有一定量的内毒素(10pg/ml)的样品试样作为粒子形成促进因子利用精制后的热变性白蛋白(DA denatured Albumin)的方式下，在改变该DA浓度时所产生的凝胶粒子的生成过程的说明图(1)，Ca)表示DA浓度为1%的情况、(b)表示DA浓度为0.8%的情况、(c)表示DA浓度为0.4%的情况。[图22](a) (C)是表示在实施例3中，在对含有一定量的内毒素(10pg/ml)的样品试样作为粒子形成 促进因子利用精制后的热变性白蛋白(DA denatured Albumin)的方式下，在改变该DA浓度时所产生的凝胶粒子的生成过程的说明图(2)，(a)表示DA浓度为0.2%的情况、(b)表示DA浓度为0.1%的情况、(c)表示DA浓度为0.05%的情况。[图23](a) (d)是表示在实施例3中，在对含有一定量的内毒素(10pg/ml)的样品试样作为粒子形成促进因子利用精制后的热变性白蛋白(DA denatured Albumin)的方式下，在改变该DA浓度时所产生的凝胶粒子的生成过程的说明图(3)，(a)表示DA浓度为0.02%的情况、(b)表示DA浓度为0.01%的情况、(c)表示DA浓度为0.001%的情况、(d)表示DA浓度为0.0001%的情况。[图24]是表示图21 图23的实施例3的DA浓度与直至凝胶粒子开始生成的反应时间的关系的图。[图25]是表示实施例3中利用的作为粒子形成促进因子的变性白蛋白的利用电子显微镜观察所得结构的说明图。[图26]是示意性表示在凝胶粒子生成过程中变性白蛋白发挥的作用的说明图。[图27]是表示在血液凝固反应中本发明的实用例的说明图。[图28](a) (b)是表示在抗原抗体反应中本发明的实用例的说明图。
具体实施例方式◎实施方式的概要图1 (a)是表示本发明所用的实施方式的凝胶粒子测定试剂的概要说明图。该图中，凝胶粒子测定试剂R是混合在含有作为测定对象的目标物质St的试样S(参照图1 (b))中，在使上述目标物质St发生凝胶粒子化后使用的试剂，包含与上述目标物质St之间发生凝胶化反应的试剂基剂I ;以及，添加到该试剂基剂I中的、对上述试样S具有可溶性并以0.002 1%的浓度溶解，且促进集中在规定范围粒径的凝胶粒子G生成的、生物学惰性的粒子形成促进因子2。予以说明，本申请的粒子形成促进因子2的浓度值用体积百分比(V / V)进行标明。该图中，当存在对试样S的目标物质St具有特异反应性的试剂R时，就会以依赖于试样S中的目标物质St的浓度的比例，引起该目标物质St与试剂R发生特异性反应的现象。在该反应过程中，试剂R受到目标物质St的刺激，使规定的因子活化，作为其起因，是在规定的酶发生活化时，例如水溶性蛋白质由于酶的作用而发生分解反应时，转变成不溶性的蛋白质，引致凝胶粒子G的出现。本实施方式中，上述目标物质St只要是能够与测定试剂R之间发生凝胶化反应、生成凝胶粒子G，就可广泛包扩各种物质。例如可举出内毒素或β-D-葡聚糖。另外，试剂基剂I还可包含与目标物质St进行凝胶化反应的因子(酶等)。例如，目标物质St为内毒素或β -D-葡聚糖时，则代表地可举出鲎试剂，但并不限定于鲎试剂，只要是鲎(Limulus)以外的鲎类的阿米巴样血细胞成分中所含的基因组能与内毒素或β-D-葡聚糖发生特异性反应，则当然也可以利用该阿米巴样血细胞水解物来制作试剂基剂St。进而，粒子形成促进因子2需要对试样S是可溶性的。其原因在于，假设为不溶性时，在正确把握凝胶粒子的生成开始时间点方面有存在阻碍的危险。另外，粒子形成促进因子2只要是能作为促进直至凝胶粒子G的产物(例如酶的产物)的凝集的凝集因子发挥作用、起到促进凝胶粒子G形成的作用的物质即可。此时，作为粒子形成促进因子2，推测其起到使导致凝胶粒子G形成的鲎反应最终产物凝固素聚集成一定尺寸的作用。这里， 当添加粒子形成促进因子2时，如图2(a)示意性表示的那样，随着时间的经过不会生成无限制、无定型大小的各种粒径，而是生成成为集中在规定范围粒径(图2中，相对于粒径I 32的水平，偏向更小的S尺寸的范围)的凝胶粒子G的产物，其发生凝集，迅速成为凝胶粒子G。这里所说的“规定范围的粒径”只要是易于凝集的较小尺寸即可，也可包含在某一范围内。予以说明，仅为参考，可以理解在不添加粒子形成促进因子2时的凝胶化反应的凝胶粒子G的生成过程中，如图2 (b)示意性表示的那样，在粒径并未集中至规定范围的状态下生成成为凝胶粒子G的产物，该产物的生成时间也比添加粒子形成促进因子2时延迟。而且，粒子形成促进因子2需要为0.002 1%的浓度。此时，当小于0.002%时，对于促进凝胶粒子G的形成是不充分的，而超过1%时，添加了过剩的粒子形成促进因子2，相反发现抑制凝集反应的倾向。推测这是因为当粒子形成促进因子2过多时，凝固素分子分散、相互的作用反而相互干涉的结果。而且，粒子形成促进因子2需要是生物学惰性的。这是由于，例如采用生物学活性的因子时，则因子的特性随活性发生变化，导致不仅作为因子的作用不稳定、而且还可能会影响到试剂基剂I的反应本身。这里，作为粒子形成促进因子2的代表性方式，例如可举出可溶性的热变性蛋白质。作为该热变性蛋白质，包括血浆蛋白质类、酶类、植物蛋白质类、蛋清白蛋白等。例如血浆蛋白质通过对稀释溶液进行热处理(例如120°C、20分钟高压灭菌处理)可作为可溶性的热变性蛋白质获得。另外，作为粒子形成促进因子2，只要是成为所谓粒子形成的微小的凝胶化核的物质即可，因此未必是热变性蛋白质，作为粒子形成促进因子2的其他代表方式，可举出生物体来源的高分子或石油高分子化学成分来源的多孔微粒。但对于这些物质，也要求可溶性、且生物学惰性。
上述生物体来源的高分子中例如包括纤维素、多糖类、糖蛋白等，另外，来自石油高分子化学成分的多孔微粒例如可举出纳米颗粒树脂等。接着，在本实施方式中，对使用上述凝胶粒子测定试剂R的凝胶粒子测定方法的概要进行说明。本实施方式中，凝胶粒子测定方法如图1 (b)所示，是通过凝胶化反应将试样S中的目标物质St粒子化而进行测定的凝胶粒子测定方法，其包括以下工序:收纳工序，在至少一部分具有使光入射的入射部和使光射出的出射部的试样池3中收纳含有作为测定对象的目标物质St的试样S和含有用于使上述目标物质St发生凝胶化的上述凝胶粒子测定试剂R的溶液；搅拌工序，为了抑制该试样池3内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W全体发生凝胶化、使用搅拌装置4搅拌上述混合溶液W ;光照射工序，由设置在上述试样池3的入射部外部的入射光源5对上述试样池3内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W照射相干光；检测工序，使用设置在上述试样池3的出射部外部的检测装置6，检测在上述试样池3内的含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W中对在上述混合溶液W从溶胶相相变至凝胶相的时间点生成的凝胶粒子G发生散射或透射的光成分；以及，凝胶粒子生成判别工序，基于上述检测工序得到的检测输出，判别混合溶液W内的上述凝胶粒子G的生成开始时间点。在这种凝胶粒子测定方法中，使用试样池3、搅拌装置4、入射光源5、检测装置6、以及未图示的控制装置(例如计算机)。这里，试样池3只要至少一部分具有使光入射的入射部和使光射出的出射部即可，其形状并不限定于具有圆筒状周壁，可以具有多边形周壁。另外，从稳定地保持作为酶反应的鲎反应的测定条件的观点考虑，优选该试样池3设置在未图示的恒温槽内的方式。作为搅拌装置4，只要是能对含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W赋予搅拌作用，就可以广泛地包括各种搅拌装置，当然可以采用内置而直接进行搅拌的方式，也可以适宜地选择利用空气实施搅拌作用、或利用振荡实施搅拌作用等方式。进而，搅拌装置4的搅拌程度要求达到能够抑制试样池3内含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W全体发生凝胶化。特别地，从利用搅拌装置4确实地进行搅拌操作的观点考虑，试样池3优选内置有能够直接搅拌池容器内含有试样S和试剂R溶液的混合溶液W的搅拌装置4。进而，作为入射光源5，只要是能够照射相干光的光源即可，不限定于由激光光源发出的激光，除了可以制成例如能使钠灯的光那样的单色光通过针孔那样的光源之外，还可使用高亮度LED和滤光器来构成。另外，作为检测装置6，只要是设置在与入射光源5不同的位置、且能够检测散射光或透射光、或者设置在与入射光源5同一侧、且能够检测返回至入射光源后方的散射光成分的装置即可。例如在检测装置6设置在与入射光源5不同的位置的方式中，可以对透射光或散射光的任一种进行检测，但例如在检测装置6的配设部位是透射光及散射光混在的方式中，当采用透射光检测方式时，则优选在检测装置6与试样池3之间具备散射光除去装置的方式，该散射光除去装置用于除去被凝胶粒子G散射的相位偏离的散射光中射向检测装置6的那部分光。作为该散射光除去装置，可举出能阻断散射光成分而仅使透射光成分通过的偏振滤光器。予以说明，相反地，在检测散射光的方式中，优选根据相同原理采用透射光除去装置除去透射光的方式。另一方面，例如在用检测装置6检测后方散射光时，既可以是在来自入射光源5的入射光的周围直接检测上述后方散射光成分的方式，或者也可以是聚集来自入射光源5的入射光周围的光、用玻璃纤维等导光部件导入至任意场所来进行检测的方式。另外，为了不被后方散射光检测装置6检出杂散光,优选米用用于除去来自入射光源5入射的光中的杂散光成分的杂散光除去装置(在试样池3的周壁内或外部设置光吸收材料，或使试样漫反射的结构)，所述杂散光成分为在所述混合溶液W中返回到入射光源5侧方向的透射光或散射光成分。进而，作为演算装置只要是能够具体化上述凝胶粒子生成判别工序的装置即可，代表性地可采用根据上述检测装置6的检测结果，计测检测输出的变动成分，并根据该计测结果判别上述混合溶液W内的凝胶粒子G的生成开始时间点的方法。这里，作为检测光的变动成分的计测方法，例如可举出在将检测输出平均化或平稳化的同时进行过滤化的方法。另外，作为演算装置，是判别凝胶粒子G的生成开始时间点的装置即可，但并不限定于此，可以是广泛地判别凝胶粒子G的生成状态。此时的“判别凝胶粒子的生成状态”是指，不仅包括能够直接判别与凝胶粒子的生成状态有关的信息，而且包括判别可基于凝胶粒子的生成状态进行判别的信息(例如目标物质的定量信息)。此处，凝胶粒子G的生成状态是指广泛地包括凝胶粒子的生成开始(出现)时间点、生成过程的变化、生成结束时间点、生成量等，因此，在本实施方式中，只要至少包括上述混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)即可，此外还可以包括其他事项。接着，根据图1 (C)对利用图1 (b)所示的凝胶粒子测定方法(例如采用散射光检测方式)的凝胶粒子G的生成开始时间点的测定原理进行说明。本实施方式中，如图1 (b)所示，在试样S和试剂R溶液的混合溶液W中没有凝胶粒子G的情况(相当于混合溶液W为溶胶相的情况)下，从入射光源5发出的照射光Bm没有被凝胶粒子遮住，因此，该照射光Bm不会被凝胶粒子B散射，没有被检测装置6检出的散射光成分。因此，使用检测装置6检测的散射光强度大致保持为O (参照图1 (C)P1X进而，如图1 (b)所示，在试样S和试剂R溶液的混合溶液W中开始生成凝胶粒子G的情况(相当于混合溶液W开始从溶胶相向凝胶相发生相转变的情况)下，由于凝胶粒子G的存在，由入射光源5发出的照射光Bm被遮住一部分，因此，该照射光Bm发生散射，该散射光成分被检测装置6检测出来。因而，利用检测装置6获得的检测输出从作为稳定区域的O水平上升、发生变化(参照图1 (c)P2)。然后，如图1 (b)所示，在试样S和试剂R溶液的混合溶液W中逐渐生成凝胶粒子G的情况下，由入射光源5发出的透射光Bm由于逐渐生成的大量凝胶粒子G的存在，散射程度逐渐增加，被检测装置6检测到的散射光成分也逐渐增加。因此，利用检测装置6获得的检测输出逐渐增加，使用检测装置6检测到的散射光强度以变化点P2为界逐渐上升、发生变化(参见图1 (c)的P3)。在上述的实施方式中，示出了基于照射于混合溶液W中的照射光Bm的散射光的变动成分，判别与混合溶液W从溶胶相向凝胶相的相转变的时间(时间点)有关的凝胶粒子的生成开始时间点(相当于图1 (C)P2)的方式。接着，以内毒素为例，示意性示出内毒素的凝胶化反应过程，如图3所示。在该图中，一旦(I)所示的内毒素的刺激传递到鲎试剂，首先，如(2)所示，因子C(Factor C)被活化,成为活化因子C(Activated Factor C),接着，由于活化因子C的作用，如(3)所示，因子B (Factor B)被活化,成为活化因子B (Activated Factor B)。然后，由于活化因子B的作用，如(4)所示，凝固酶原变成凝固酶，如(5)所示，该凝固酶将凝固蛋白原(水溶性蛋白质)分解，生成凝固素(不溶性蛋白质)。该凝固素(不溶性蛋白质)一旦在该条件下被搅拌，全体的凝胶化被抑制，就会作为凝胶粒子G出现，一旦静置，则如(6)所示，溶液体系全体发生聚合化/凝胶化。总之，可以理解，其反应过程如下:在试样S的目标物质St为内毒素的情况下，通过向混合溶液W赋予一定的搅拌状态,可以抑制混合溶液W全体的凝胶化，同时在该状态下，当内毒素的刺激传递给鲎试剂R时，就可能在凝固酶的周围产生出凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G，凝固素(不溶性蛋白质)作为凝胶粒子G生成后，凝胶粒子G就逐渐生成。另外还发现，内毒素的刺激传递给鲎试剂R反应流(级联反应)的速度(鲎反应速度)依赖于内毒素浓度，内毒素浓度越高，鲎反应速度越快，含有凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G的出现时间就越早。因此，只要能够在混合溶液内精度良好地检测散射光或透射光变化，就可以把握作为凝胶粒子G的生成开始时间点的含有上述凝固素(不溶性蛋白质)的凝胶粒子G的出现时间，这是本实施方式的凝胶粒子测定方法的基础。这种凝胶粒子测定方法与例如以往的凝胶化法或比浊时间分析法的测定原理(在利用鲎试剂R的反应过程中，在静置的条件下，在被活化的凝固酶的影响下最终达到反应体系的溶液全体发生凝 胶化，利用浊度来定量测定该体系全体均匀地发生凝胶化的过程的方式)完全不同。一般而言，对于临床试样中内毒素的测定的要求，特别是在救命救急的目的下，简便而快速的测定为第一要求。对于在以往方法的比浊时间法中成为问题“灵敏度差导致的测定水平低”和“测定时间长度带来的不便”等事项，通过采用上述的测定方式而被更可靠地消除。S卩，本实施方式的凝胶粒子测定方法从原理上来说，通过均匀地搅拌含有试样和鲎试剂的混合溶液W，由此，在均匀的反应下，不是作为混合溶液体系全体，而是在局部产生微小的凝胶粒子，通过对其照射激光那样的相干的均匀的光引起散射，通过对其进行检测，检测与通过添加内毒素而引起凝胶粒子出现的与溶胶相向凝胶相的相转变有关的相转变点，通过计测直至达到该相转变点的时间，可以推测鲎试剂中的内毒素的量。简要地说，本实施方式的凝胶粒子测定方法是不追求混合溶液体系全体的变化(凝胶化)，而着眼于直至引起相转变的时间(凝胶粒子的生成开始时间点)为依赖于内毒素浓度的反应这一事实，由此，与以往方法的比浊时间法相比，可以更快地检测出内毒素。以下根据附图所示的实施方式更详细地说明本发明。◎实施方式I本实施方式I的凝胶粒子测定装置具有注入含有内毒素的试样的试样池100，用使用鲎试剂的凝胶化反应测定例如作为试样的目标物质的内毒素的浓度。
—凝胶粒子测定装置一在本实施方式中，凝胶粒子测定装置如图4所示构成。在该图中，试样池100设置在预先确定的测定台上，在本实施方式中，将配置在恒温槽115内的含有试样S和试剂R的混合溶液W置于一定的恒温环境(例如37°C )下，使测定条件为恒定。本实施方式中，试样S的对象是含有作为目标物质的内毒素。另一方面，试剂R含有作为试剂基剂的与上述内毒素发生凝胶化反应的鲎试剂、和添加到该鲎试剂中的粒子形成促进因子。这里，作为粒子形成促进因子，使用对试样S为可溶性的热变性蛋白质(例如血浆蛋白质、蛋清白蛋白等)，对试样S的浓度调整为0.002
1%左右。这里，粒子形成促进因子可以与鲎试剂一起提供，或者也可以与鲎试剂分开提供。作为前者的代表性方式，可举出在鲎试剂中预先添加粒子形成促进因子，然后制成例如冻干粉末状的构成，作为后者的代表性方式，可举出为了对用于测定的血液等试样R进行稀释，与例如冻干粉末状的鲎试剂分开制作的、加入有粒子形成促进因子的稀释液的方式。但是，在后者的方式中，为了使粒子形成促进因子在凝胶化反应时与鲎试剂共存，必须在凝胶化反应前与鲎试剂一起进行充分地搅拌。另外，符号120是为了搅拌试样池100内的混合溶液W而驱动试样池100内的磁性搅拌子121的搅拌驱动装置，例如，对混合溶液W赋予一定的搅拌状态，一边均匀地搅拌混合溶液W，一边抑制混合溶液W的全体凝胶化。特别是在本例中，搅拌驱动装置120的构成为:对由内置在试样池100内的底壁的磁性体构成的搅拌子(搅拌棒)121，使磁力引起的搅拌力起作用的搅拌驱动源(磁性搅拌器)。另外，符号130为设置在试样池100的侧周壁的外侧且照射相干光的激光光源。在本例中，如图5 (a) (b)所示，来自激光光源130的相干光Bm沿横切试样池100的大致直径部分的路径照射，其光径d设定为相对于生成的凝胶粒径(例如0.2 2 μ m左右)为充分大的值(例如5 20 μπι左右)。进而，符号140在试样池100的外部设置在与激光光源130同侧，为检测来自激光光源130的照射光Bm由在试样池100内的混合溶液中生成的凝胶粒子散射的光中返回到激光光源130侧方向的后方散射光成分的后方散射光检测器。在本例中，后方散射光检测器140具有在中央部开设有通孔142的筒状的检测器主体141，在该检测器主体141的通孔142中，使从激光光源130照射到试样池100内的照射光通过，同时，与该检测器主体141的试样池100的侧周壁外面对向地设置环状检测面143，进而，在该检测器主体141内的一部分中组装可以感知由环状检测面143检出的散射光的光二极管等受光元件(未图示)。在此，后方散射光检测器140的检测精度设定为:在来自激光光源130的照射光Bm的通过面积内可以根据I个或多个凝胶粒子的有无来检测后方散射光量变化的程度。予以说明，后方散射光检测器140的环状检测面143可以与试样池100的侧周壁外表面接触或非接触式地配置 ，但从良好地保持后方散射光成分的检测性的观点考虑，优选接触配置的方式。
进而，在本实施方式中，在试样池100的外部夹持试样池100，在上述激光光源130的相反侧设置杂散光除去部件150。该杂散光除去部件150与从激光光源130照射到试样池100内的照射光Bm直接透射到达试样池100的相反侧周壁的区域及其周边区域相对应，配置光吸收材料。这样，在试样池100的一部分设有杂散光除去部件150的理由如下所述。S卩，在来自激光光源130的照射光被例如凝胶粒子散射的光中，返回至激光光源130侧的后方散射光成分以外的散射光成分、或者直接透过生成的凝胶粒子周围的透射光成分可以成为被试样池100的内壁等反射而朝向后方散射光检测器140的杂散光成分，其中，尤其是指向性高的杂散光成分为透射光成分及朝向与透射光成分相同的方向的散射光成分，因此，在与它们相对应的位置上可以设置杂散光除去部件150。符号160为读取来自后方散射光检测器140的检测输出、执行例如图8所示的数据分析处理的数据分析装置，170为显示由数据分析装置160分析出的分析结果的显示器。该数据分析装置160由包括CPU、ROM、RAM、I/O接口等的计算机系统构成，例如在ROM内预先贮存图8所示的数据分析处理程序，基于来自后方散射光检测器140的检测输出，在CPU中执行数据分析处理程序。

予以说明，来自后方散射光检测器140的检测输出利用例如未图示的增幅器进行电流电压变换后，利用AD变换器进行AD变换，收集入数据分析装置160中。<试样池的构成例>下面，基于图6 (a) (b)，对本实施方式中使用的试样池100的构成例及向试样池100的搅拌子121、试样S的导入例进行详述。在该图中，试样池100由例如由玻璃材料一体化成型且上部开口的横截面为圆形的有底的筒状容器101构成，在其上部形成凸缘部102，同时，在该凸缘部102的下部形成颈部103，在凸缘部102及颈部103上形成小径孔部104，在内部形成比该小径孔部104的直径大的大径空间部105。然后，在该试样池100内，含有内毒素的试样和产生凝胶化反应的试剂106例如以冻干粉末状预先无菌且无内毒素地(一般称为“无内毒素”或“无热原的”)方式被收纳，同时，预先收纳采用磁性材料的搅拌子121。进而，在该试样池100的小径孔部104上嵌入由橡胶等弹性材料构成的密封栓108。该密封栓108成形为剖面大致T字状，其头部108a载置于试样池100的凸缘部102上，其脚部108b以密接于小径孔部104的状态被插入。另外，在密封栓108的脚部108b的一部分上设有凹槽108c。进一步地，试样池100的凸缘部102及密封栓108的头部108a用例如铝制的盖状的保持盖109覆盖，该保持盖109嵌入于试样池100的凸缘部102的周壁，从外侧包围保持密封栓108。另外，在该保持盖109的例如中央部，面向密封栓108的头部108a形成孔部109ao另外，如图6 (a) (b)所示，试样池100在筒状容器101的小径孔部104开放的状态下收纳试剂106和搅拌子121，在该状态下，用密封栓108密封筒状容器101的小径孔部104，同时，用保持盖109覆盖该密封栓108。这种试样池100作为凝胶粒子测定装置的附属品或测定试剂盒供给用户。
另外，作为向本实施方式的试样池100的筒状容器101中导入试样S的导入法，例如可举出利用保持盖109的孔部109a在密封栓108中用注射针等穿孔具(未图示)穿孔，经由该穿孔用注入器(未图示)注入试样S的方法。进而，为了容易地进行试样S的导入，以使筒状容器101内相对于大气压保持规定负压的水平设定密封栓108的密封方法。下面，对本实施方式的凝胶粒子测定装置的工作情况进行说明。在本实施方式中，如图4所示，在试样池100中注入含有内毒素的试样S后，将未图示的启动开关进行打开操作，开始利用凝胶粒子测定装置的测定顺序。就该测定顺序而言，用搅拌驱动装置120旋转搅拌子121，搅拌试样池100内的含有试样S和鲎试剂的混合溶液W。由此，使得混合溶液W全体被均匀地搅拌，同时，抑制混合溶液W全体发生凝胶化。另外，就测定顺序而言，从激光光源130向试样池100内的混合溶液W照射相干光Bm，用后方散射光检测器140检测在混合溶液W中散射的光中朝向激光光源130侧方向的后方散射光成分，同时，将后方散射光检测器140的检测输出采集入数据分析装置160。另一方面，在试样池100内的混合溶液W中，内毒素的刺激传递到鲎试剂,产生图3所示的鲎反应，在抑制混合溶液W全体凝胶化的状态下，依次生成凝胶粒子G。在本实施方式中，在来自激光光源130的相干光Bm的通过面积内生成例如I个凝胶粒子G时，将其作为与混合溶液W从溶胶相转变为凝胶相的相转变点的时间有关的凝胶粒子G的生成开始时间点。在这种反应过程中，例如如图8所示，数据分析装置160在将来自后方散射光检测器140的检测输出作为散射光量数据(数字数据)读取后，进行平均化、过滤化处理，由此计测散射光量数据的变动成分。接着，基于散射光量数据的变动成分，提取出由后方散射光检测器140检出的散射光量数据的增加变化点(相当于图1 (c) P2),通过参照预先规定的标准曲线，确定试样S的内毒素浓度(ETX浓度)，显示在显示器170上。在本例中，标准曲线表示内毒素浓度(ETX浓度)和至达到散射光量数据的增加变化点为止的时间阈值之间的关系，基于达到散射光量数据的增加变化点的时间和标准曲线的相关性，确定内毒素浓度(ETX浓度)。另外，在显示器170中，除了内毒素浓度(ETX浓度)以外,还切换显示散射光量数据的时序数据、散射光量数据的变动成分的时序计测数据等数据。特别是，在本实施方式中，通过着眼于试剂R，能够进一步促进凝胶粒子G的生成开始时间点。该方面通过后述的实施例阐明。<标准曲线的制作例>在此，对本实施方式中采用的标准曲线的制作例进行说明。使用本实施方式I的凝胶粒子测定装置，例如如下确定预先确定的实验条件，对添加有各种内毒素浓度(例如10、1、0.lpg/ml)的样品试样时的鲎试剂，用凝胶粒子测定装置研究利用后方散射光检测器140的散射光度(散射光量数据)的变化。本例中使用的实验条件如下所述。.激光光源130:红色光或蓝色光
.后方散射光检测器140:光二极管.搅拌子(搅拌棒)121的转速:1000rpm 恒温条件:37°C图9 Ca)是相对于内毒素浓度10pg/ml、lpg/ml、0.lpg/ml的样品试样,对散射光强度追随各自的时间经过而描绘的图。予以说明，图9 (a)的纵轴表示散射光强度(用Uy表示图中的最大散射光强度刻度)，横轴表示反应时间(用tx[例如IOOmin]表示图中的最大反应时间刻度)。在该图中，各条件的散射光强度的变化均显示达到维持大致O的恒定水平的部分的时间并增加的倾向。该散射光强度的增加变化点相当于凝胶粒子的生成开始时间点(含有内毒素的样品试样从溶胶相向凝胶相的相转变的时间)，推测是指由凝胶化开始时产生的增光。为了求出该凝胶化的开始时间，在本实施方式中，在图9 (a)的图中，手动求出近似于恒定散射光度的部分的直线(通常为O)与近似于散射光强度逐渐倾斜增加的变化部分的直线的交点，求出各自的凝胶化开始时间(反应时间)t (10),t (l)、t (0.1)。进而，在本实施方式中，使用由图9 (a)的图求出的凝胶化开始时间t (10)、t (I)、t (0.1)的值制作标准曲线(参照图9 (b))。在图9(b)中，标准曲线是通过将X轴设为作为内毒素浓度的ETX浓度(log变换)、将Y轴设为凝胶化开始时间，描绘各凝胶化开始时间的值并对这些值利用最小二乘法绘制直线而求出的。此时，凝胶化开始时间的值相对于各内毒素浓度的样品试样呈直线关系，表示相关系数高的相关性。即，例示本实施方式中求出的标准曲线的一例时，如下所述。内毒素浓度(pg/ml)凝胶化开始时间(min.)10pg/ml:t (10) = 12 (min.)lpg/ml:t (1) = 20 (min.)0.lpg/ml:t (0.1) = 70 (min.)与此相比，使用采用和光纯药工业株式会社制的比浊时间分析法的内毒素试剂盒
(凝胶化反应测定装置)，研究内毒素浓度和凝胶化时间，结果，可得到如下的结果。
权利要求
1.凝胶粒子测定试剂，其混合在含有作为测定对象的目标物质的试样中，在使所述目标物质发生凝胶粒子化后使用，其特征在于，包含: 与所述目标物质之间发生凝胶化反应的试剂基剂；和 添加到该试剂基剂中的、对所述试样具有可溶性并以0.002 1%的浓度溶解、且促进集中在规定范围粒径的凝胶粒子生成的、生物学惰性的粒子形成促进因子。
2.权利要求1所述的凝胶粒子测定试剂，其特征在于，所述粒子形成促进因子为可溶性的热变性蛋白质。
3.权利要求1所述的凝胶粒子测定试剂，其特征在于，所述粒子形成促进因子为可溶性的、惰性的、生物来源的高分子或石油高分子化学成分来源的多孔微粒。
4.权利要求1 3任一项所述的凝胶粒子测定试剂，其特征在于，作为测定对象的目标物质为内毒素和/或β -D-葡聚糖，试剂基剂为鲎试剂。
5.凝胶粒子测定方法，其通过凝胶化反应使试样中的目标物质发生粒子化来进行测定，其特征在于，包括: 收纳工序，在至少一部 分具有使光入射的入射部和使光射出的出射部的试样池中，收纳含有作为测定对象的目标物质的试样和含有用于使所述目标物质发生凝胶化的权利要求I 4任一项所述的凝胶粒子测定试剂的溶液； 搅拌工序,为了抑制该试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液全体发生凝胶化，使用搅拌装置搅拌所述混合溶液； 光照射工序，由设置在所述试样池的入射部外部的入射光源对所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液照射相干光； 检测工序，使用设置在所述试样池的出射部外部的检测装置，检测在所述试样池内的含有试样和试剂溶液的混合溶液中对在所述混合溶液从溶胶相相变至凝胶相的时间点生成的凝胶粒子发生散射或透射的光成分；和 凝胶粒子生成判别工序，基于上述检测工序得到的检测输出，判别混合溶液内的所述凝胶粒子的生成开始时间点。
全文摘要
本发明提供在早期测定凝胶粒子的生成开始时间点方面有效的凝胶粒子测定试剂。凝胶粒子测定试剂(R)是混合在包含作为测定对象的目标物质(St)的试样(S)中，在使上述目标物质(St)发生凝胶粒子化后使用的凝胶粒子测定试剂，其包含与所述目标物质(St)之间发生凝胶化反应的试剂基剂(1)；以及，添加到该试剂基剂(1)中的、对所述试样(S)具有可溶性并以0.002～1%的浓度溶解的、且促进集中在规定范围粒径的凝胶粒子(G)生成的、生物学惰性的粒子形成促进因子(2)。
文档编号G01N33/483GK103168243SQ20118005003
公开日2013年6月19日 申请日期2011年10月18日 优先权日2010年10月18日
发明者小幡彻, 土谷正和 申请人:小幡彻