专利名称：一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法
技术领域：
本发明涉及一种凝胶电泳方法，具体涉及一种用于甲型副伤寒沙门菌的脉冲场凝胶电泳方法。
背景技术：
甲型副伤寒沙门菌(S. paratyphi Α)的潜伏期长，一般为8-10天。当发生一起甲型副伤寒沙门菌的暴发时，追踪溯源是很困难的。如果脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法的区分能力不强，就加大了追踪溯源的难度。因此发展适用性强的甲型副伤寒沙门菌的PFGE 方法是非常必要的。以前有研究已经证明许多因素可以影响PFGE的结果，如胶块的制备，细胞的裂解，胶块的水洗时间，限制性内切酶和电泳参数等，但其中最重要的因素是酶和参数的选择。菌株之间的亲缘关系的判断是根据比较酶切片段带型的能力。一种合适的酶应当有最合适的片段数目和足够的流行病学相关区分能力。电泳参数(包括脉冲时间和总电泳时间)直接影响酶切片段在电泳胶中的分布。当一株甲型副伤寒沙门菌染色体DNA用同一种酶酶切后，其所得的限制性片段是固定的，不同菌株之间限制性片段的差异就是固定的，但不同的电泳参数对他们这种固有差异的表现能力不同。因此当电泳参数发生改变时，原位置相似的条带在新的胶中的相对位置差别可能会加大，从而显示出差异，因而不同的电泳参数会显示出不同的菌株区分能力。目前，国际上的甲型副伤寒沙门菌的PFGE实验方案是根据PulseNet的标准化方案，但它是针对沙门菌属的非伤寒沙门菌血清型，而不是针对甲型副伤寒沙门菌的。该非伤寒沙门菌PFGE标准化方案中将)(ba I作为了首选酶，Bin I次选酶，Spe I第三种酶；用 Xba I和SpeI酶切的电泳参数都是脉冲时间为2. 2-63. 8s，18-19h。以往有研究者应用这种标准化方案分析甲型副伤寒沙门菌时面临严峻挑战，只能将甲型副伤寒分离株分出有限的型别S. Paratyphi A isolates had limited genetic diversity (Goh, Puthucheary et al.2002 ；Li, Cui et al. 2006)。因此提示有可能是这种标准化方案不适合甲型副伤寒沙门菌。这种标准化方案在分析甲型副伤寒沙门菌时分型能力不够强，不能有效将流行株和非流行株区分开，当甲型副伤寒暴发时很难开展病原的分子溯源工作。因此这种标准化方案不适合甲型副伤寒沙门菌。本发明在上述背景下，提出一种适合于甲型副伤寒沙门菌的PFGE方案，使其对甲型副伤寒沙门菌具有更强的分型区分能力。

发明内容
本发明的目的在于提供一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，对于甲型副伤寒沙门菌具有更强的分型区分能力。本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的提供一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，以经分离并培养得到的甲型副伤寒沙门菌为分析样品，依次进行以下各步骤胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳；所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块和加样步骤都按照常规脉冲场凝胶电泳方法进行；其特征在于所述的胶块内DNA的酶切是以Spe I作为首选酶，Xba I作为次选酶，》ιοΙ作为第三种酶；所述的电泳参数中，Spe I酶对应的脉冲时间为l-20s，总电泳时间为19-20h ；Xba I酶对应的脉冲时间为1. 549s，总电泳时间为19_20h ；Xho I酶对应的脉冲时间为2. 249s，总电泳时间为19-20h。所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法可以按照以下几种方式进行方法一包括1-3次单独的脉冲场凝胶电泳过程，即将分离并培养得到的甲型副伤寒沙门菌样品依次采用所述的首选酶及其相应的电泳参数、所述的次选酶及其相应电泳参数和/或第三种酶及其相应电泳参数，按照所述各步骤(胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳)分别处理1-3遍。即，以分离和培养得到的相同批次的菌株为分析样品，先用所述首选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；如果得到的带型数目足够多，能将流行株和非流行株很好的区分开，分辨率较高，能获得理想的分子分型，即结束电泳；如果得到的带型数目较少，同一带型包含的菌株数目较多，分辨率较低，不能很好的区分流行株和非流行株时，则启用所述的次选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品再做脉冲场凝胶电泳处理一遍；如果次选酶及其相应的电泳参数得到的分子型别分辨率较高时，即结束电泳；如果依然不能满足分子溯源的需要，就再启用所述的第三种酶及其相应电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理。通常情况下，启用次选酶及其相应电泳参数处理后，得到的带型数目就足够多了。方法二由2-3个连续的脉冲场凝胶电泳过程组成，即以分离并培养得到的甲型副伤寒沙门菌为样品，依次采用所述的首选酶及其相应的电泳参数、所述的次选酶及其相应电泳参数和/或所述的第三种酶及其相应电泳参数中的两种或三种，按照上述各步骤 (胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳)进行连续处理。具体包括以下步骤1)用所述的首选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；2)用所述的次选酶及其相应的电泳参数，将经过步骤1)处理后得到的胶块进行所述的洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳处理；禾口/ 或3)采用所述的第三种酶及其相应电泳参数将经过步骤2)处理后得到的胶块进行所述的洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳处理。本发明还提供所述甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法在甲型副伤寒沙门菌分型或基因组变异检测中的应用。将上述首选酶、次选酶和/或第三种酶及其相应的参数电泳后的结果组合应用， 用BioNumerics软件分析，以UPGMA方法聚类，按100%相似性系数可以分成的亚带型明显增多，分辨率比单一酶的要高，这将有助于为流行病学调查提供更可靠的实验室证据。本发明中，作为分析样品的甲型副伤寒沙门菌可以按照常规方法从疑似病例的血、骨髓、粪便样本或污染的水、食品中分离得到。所述的分离方法在诸多公开出版物上都有记载，例如人民卫生出版社2006年出版的《伤寒、副伤寒防治手册》(第二版)45-55页。 将分离得到的甲型副伤寒沙门菌按照常规的细菌培养方法培养后，即可作为本发明脉冲场凝胶电泳方法的分析样品。本发明从酶的选择和电泳参数两方面优化了现有技术中的标准化的非伤寒沙门菌PFGE标准化方案，使其成为一种适用于甲型副伤寒沙门菌的PFGE的最佳方案。与现有技术中的非伤寒沙门菌PFGE标准化方案相比，本发明方法对甲型副伤寒沙门菌的区分能力显著提高。这对于甲型副伤寒疫情暴发时病原的追踪溯源，以及指导后续的防控来说无疑是具有重大意义的进步。


图1是实施例1中，通用分子量标准株H9812与表4中的S. paratyphi AGXS04-1876和GZ9A06198以本发明的电泳方法的首选酶为内切酶，分别用本发明和 PulseNet标准化方案的电泳参数处理得到的电泳图。图2是实施例2的第二次PFGE中，通用分子量标准株H9812与表4中的 S. paratyphi A GXS04-1876和GZ9A06198以本发明的电泳方法的次选酶为内切酶，分别用本发明和PulseNet标准化方案的电泳参数处理得到的电泳图。图3是实施例3的第三次PFGE中，通用分子量标准株H9812与表4中的 S. paratyphi A GXS04-1876和GZ9A06198以本发明的电泳方法的第三种酶为内切酶，分别用本发明和PulseNet标准化方案的电泳参数处理得到的电泳图。图4是实施例5中，表7中的甲型副伤寒沙门菌应用实施例2的方法进行第一次 PFGE得到的聚类图。图5是实施例5中，表7中的甲型副伤寒沙门菌应用实施例2的方法进行第二次 PFGE得到的聚类图。图6是实施例5中的表7中的甲型副伤寒沙门菌应用PulseNet标准化方案的首选酶OCba I)及其电泳参数(2.2-63.8s，19h)处理得到的聚类图。
具体实施例方式以下通过具体的实施例对本发明的内容进行详细说明。其中所使用的普通化学试剂和仪器均为现有的市售产品，或按照公知的PFGE标准操作规程配制；所用到的通用分子量标准株H9812可购自军事医学科学院微生物流行病研究所或中国疾病预防控制中心传染病控制所PulseNet网络中心实验室；所用的限制性内切酶及其配套缓冲液均购自宝生物工程(大连)有限公司；所用的甲型副伤寒沙门菌样品是按照人民卫生出版社2006年出版的《伤寒、副伤寒防治手册》(第二版)45-55页记载的方法分离得到并经血清型确认的，基本信息如下表 4 表4实施例所用样品菌株的相关信息
权利要求
1.一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，以经分离并培养得到的甲型副伤寒沙门菌为分析样品，依次进行以下各步骤胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、 加样和电泳；所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块和加样步骤都按照常规脉冲场凝胶电泳方法进行；其特征在于所述的胶块内DNA的酶切是以Spe I作为首选酶，)(ba I作为次选酶， XhoI作为第三种酶；所述的电泳参数中，Spe I酶对应的脉冲时间为l-20s，总电泳时间为 19-20h ；Xba I酶对应的脉冲时间为1. 5-29s,总电泳时间为19_20h ；Xho I酶对应的脉冲时间为2. 249s，总电泳时间为19-20h。
2.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于所述的方法包括1-3次单独的脉冲场凝胶电泳过程，即将分离并培养得到的甲型副伤寒沙门菌样品依次采用所述的首选酶及其相应的电泳参数、所述的次选酶及其相应电泳参数和/或第三种酶及其相应电泳参数，按照所述各步骤分别处理1-3遍。
3.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于，以分离和培养得到的相同批次的菌株为分析样品，包括以下步骤1)用所述的首选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；2)用所述的次选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理。
4.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于，以分离和培养得到的相同批次的菌株为分析样品，包括以下步骤1)用所述的首选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；2)用所述的次选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；3)用所述的第三种酶及其相应电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理。
5.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于所述的方法是由2-3个连续的脉冲场凝胶电泳过程组成，即以分离并培养得到的甲型副伤寒沙门菌为样品，依次采用所述的首选酶及其相应的电泳参数、所述的次选酶及其相应电泳参数和/ 或所述的第三种酶及其相应电泳参数中的两种或三种，按照所述各步骤进行连续处理。
6.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于，包括以下步骤1)用所述的首选酶及其相应的电泳参数，按照所述的各步骤将分析样品做脉冲场凝胶电泳处理；2)用所述的次选酶及其相应的电泳参数，将经过步骤1)处理后得到的胶块进行所述的洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳处理。
7.权利要求6所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于进一步采用所述的第三种酶及其相应电泳参数将经过步骤幻处理后得到的胶块进行所述的洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳处理。
8.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于，具体包括以下步骤[1].胶块的制备[1.1]在试管内加入aiil CSB，用CSB湿润接种环，将事先分离和培养好的甲型副伤寒沙门菌样品均勻悬浊于CSB中，测其OD值，并调整至3. 6 4. 5 ；[1. 2]取400 μ 1步骤[1. 1]得到的细菌悬浊液于1. 5ml试管中，置于37°C水浴中孵育 5分钟；[1. 3]从水浴中取出步骤[1. 2]得到的试管，加入20μ 1储存液浓度为20mg/ml的蛋白酶K混勻，使其终浓度为0. 5mg/ml ；[1.4]在由TE和10%十二烷基硫酸钠按9 1的体积比配制成的溶液中加入凝胶强度> 1800g/cm2的琼脂糖，配制成的凝胶溶液，琼脂糖加入比例为每IOOml溶液中加入 Ig琼脂糖；将配制好的凝胶溶液放于56°C水浴箱中；[1. 5]在步骤[1. 3]得到的试管中加入400 μ 1步骤[1. 4]制备的的凝胶溶液，混勻； [1.6]将步骤[1.5]得到的混合物加入成胶模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15 分钟，得到胶块；[2],细胞的裂解[2. 1]配制CLB 每5ml细胞裂解液加入25 μ 1的20mg/ml的蛋白酶K，使其终浓度为 0. lmg/ml，然后颠倒混勻；蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上备用； [2. 2]将5ml步骤[2. 1]配制的蛋白酶K/CLB混合液加入50ml的螺旋盖试管中； [2. 3]将步骤[1. 6]得到的胶块放入步骤[2. 2]得到的试管中，用刀片削去模具表面多余的胶，保证胶块在液面下而不在管壁上，做好标记；[2. 4]将步骤[2. 3]得到的试管放在水浴摇床中孵育2小时，转速170转/分钟； [2. 5]将纯水和TE放在50°C水浴摇床中预热；[3],洗胶块[3. 1]从步骤[2. 4]的水浴摇床中拿出螺旋盖试管，盖上滤筛盖，倒掉CLB ；每管中加入 15ml步骤[2. 5]预热的纯水，确保胶块在液面下，放回水浴摇床中，摇10分钟；水浴结束后将试管中的水倒掉，用步骤[2. 5]预热的纯水将胶再洗一次；[3. 2]将步骤[3. 1]得到的试管中的水倒掉，加入15ml步骤[2. 5]预热到50°C的TE, 在的水浴摇床中摇15分钟；倒掉TE，再用步骤[2. 5]预热的TE重复洗三次，每次10 15分钟；倒掉TE，加入IOml TE，放在4°C冰箱保存备用；[4],胶块内DNA的酶切[4. 1]按照表1中的比例配制分别与所述的首选酶、次选酶和/或第三种酶配套的缓冲液的稀释液，混勻置于冰上表1.缓冲液的稀释液的配制比例试剂μ 1/胶块μ 1/10胶块纯水180 μ 11800 μ 1配套缓冲液20 μ 1200 μ 1总体积200 μ 12000 μ 13[4. 2]在1. 5ml试管中加入200 μ 1步骤[4. 1]配制的缓冲液的稀释液； [4. 3]将步骤[3. 2]得到的样品胶块放在干净的培养皿上，分别用刀片切成2mm宽的胶块，放入步骤[4. 2]中加入了稀释液的相应试管中，确保胶块在液面下面，将试管放在37°C 水浴中孵育10-15分钟，得到待酶切胶块；[4. 4]将所述的首选酶、次选酶和/或第三种酶按照表2的比例配制酶切缓冲液，混勻置于冰上备用表2.酶切缓冲液的配制比例
9.权利要求8所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，其特征在于，进一步包括A)按照所述步骤[1.1]至步骤[4. 3]的方法得到待酶切胶块，在每个放胶块的试管中加入200 μ 1步骤[4. 4]配制的次选酶的酶混合液，确保胶块在液面的下面；在37°C水浴中孵育2 4小时，然后按照步骤[5]至步骤W]的方法处理；或者B)将步骤[6.3]处理后得到的胶块洗去所述的首选酶的酶混合液，放入加有200 μ 1 步骤[4. 1]配制的与次选酶相配套的缓冲液的稀释液的1. 5ml试管中，确保胶块在液面下面，将试管放在37°C水浴中孵育10-15分钟，得到待酶切胶块，在每个放胶块的试管中加入 200 μ 1步骤[4. 4]配制的次选酶的酶混合液，确保胶块在液面的下面；在37°C水浴中孵育 2 4小时，然后按照步骤[5]至步骤W]的方法处理。
10.权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法在甲型副伤寒沙门菌分型或基因组变异检测中的应用。
全文摘要
本发明提供一种甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳方法，以经分离得到的甲型副伤寒沙门菌为分析样品，依次进行以下各步骤胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样和电泳；其中，所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块和加样步骤都按照常规脉冲场凝胶电泳方法进行；所述的胶块内DNA的酶切是以Spe I作为首选酶，Xba I作为次选酶，Xho I作为第三种酶；所述的电泳参数中，Spe I酶对应的脉冲时间为1-20s，19-20h；Xba I酶对应的脉冲时间为1.5-29s，19-20h；Xho I酶对应的脉冲时间为2.2-29s，19-20h。本发明的方法对甲型副伤寒沙门菌的分辨率相对现有技术显著提高，能够有效的应用于甲型副伤寒沙门菌的分子分型或基因组变异的检测。
文档编号G01N27/447GK102305823SQ201110137040
公开日2012年1月4日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者姚李四, 张晓龙, 徐宝梁, 李新, 李海山, 杨宇, 王艳, 胡群, 陈春霞, 韩辉 申请人:中国检验检疫科学研究院