专利名称：河西绒山羊流产病抗性等位基因检测试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明涉及动物生物技术领域中的山羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到河西绒山羊流产病抗性等位基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
羊流产病是由衣原体、弓形虫、布鲁氏杆菌感染等因素引起以羊大量流产为特征的地方性亚急性传染病，羊只患病后表现为流产、产弱羔、死羔等。河西绒山羊流产病发病率较高，平均流产率为25. 41%，最高可达83. 33%。动物主要组织相容性(基因)复合体(majorhistocompatibility complex，MHC) 与多种疾病有密切关系，是目前开展抗病育种的首选基因座或候选基因。山羊的MHC基因的结构和功能与绵羊、牛的非常相似，并具有高度的序列同源性，分为class I、classll和 class III区。GOLA classll基因区域与人的结构相似，其多态性集中在II类区域的DR和 DQ基因家族，DR基因家族有A、B两类基因座，包括1个DRAl功能基因和9个DRB基因，其中DRB1、B3、B5是功能基因，其余是假基因。DRBl是II类区域中多态性最丰富的基因，这些多态性的产生主要由第二个外显子编码的氨基酸序列差异性所决定的。据颜卫华(2002 年)报道，HLA与人的不明习惯性流产相关。但动物的传染性流产病与MHC的关系还未见报道。目前国内对山羊流产病主要采用药物防治措施，较难控制病情且有药物残留风险。在国外MHC基因已经作为多种动物疾病的遗传标记加以应用，并且多种检测技术检测已商业化并用来开展抗病选育。河西绒山羊流产病抗性分子选种技术主要利用PCR-SSCP 技术对待测山羊的DRBl基因第2外显子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的羊只对流产病的抗性强弱，从而判断是否可以留作种用。

发明内容
本发明的目的是避免现有检测技术的不足提供一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低用于抗河西绒山羊流产病性分子选种技术。通过PCR-SSCP对表型正常和流产个体G0LA-DRB1基因第2外显子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合表型观测资料，确定易感等位基因和抗性较强的等位基因，为河西绒山羊没有感染时的抗病选育进行指导。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点是包括有第一 PCR反应液，第二 PCR反应液， G0LA-DRB1*03和G0LA_DRB1*11的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED, 12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37. 5:1 ；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0. 025%溴酚蓝，0. 025% 二甲苯青， IOmmol/L EDTA pH 8. 0 ；
所述的第一 PCR反应液的反应液总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为 100 μ Μ，引物DRB1. 1和GIo各0. 1 μ M，Taq聚合酶 0. 5U，模板 DNA50ng, ddH20 补充体积至 20 μ L ；
所述的第二 PCR反应液的反应液总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L， Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ Μ，引物DRB1. 1和DRB1. 2各0. 1 μ M，Taq聚合酶0. 5U，稀释10倍后的第一轮PCR产物l.OyL, ddH20补充体积至20 μ L ； 引物序列为
DRB1. 1，5，-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’， GIo, 5' -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’， DRB1. 2,5' -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3，。所述的G0LA_DRB1*03的DNA标准样的核苷酸序列为
ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg60
gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc120
cgggcggtgg ccgagctggg gcggcagacc gccaagtact ggaacagcca gaaggagctc 180 ctggagcgga ggcggaccga ggtggacacg ttctgcagac acaactacgt ggtcttt240
所述的G0LA-DRB1*11的DNA标准样的核苷酸序列为
ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggt gtggtacctg60
gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttcg acaacgactg gggcgagtac 120 cgggcggtgg ccgagctggg gcggccggac gccaagtact ggaacagcca gaaggagatc 180 ctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtaggt240
所述的河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为
(1)待检基因组DNAlμ L/50ng与试剂盒中第一PCR扩增液混合，按上述第一组引物PCR 反应条件进行扩增；
(2)试剂盒中第二PCR扩增液与步骤(1)的PCR扩增产物混合，按上述第二组引物PCR 反应条件进行扩增；
(3)用步骤(2)中扩增的PCR产物和G0LA-DRB1*03或G0LA_DRB1*11的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；(4)步骤(3)中检测到的带型与G0LA-DRB1*03或G0LA-DRB1*11标准样带型一致的样品为携带河西绒山羊流产病抗性等位基因的个体。一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于，具体的检测步骤如下
(1)样品采集采集表型正常和流产病的河西绒山羊，颈静脉采血10ml，A⑶抗凝，-20 °C冻存；
(2)基因组DNA的提取用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
(3)聚合酶链式反应
第一轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中10 Xbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ M，引物DRB1. 1和GIo各0. 1 μ M，Taq聚合酶0. 5U,模板 DNA为50ng，ddH20补充体积至20 μ L ；反应条件预变性94°C 5 min,变性94°C lmin,退火 600C 2min，延伸72°C 2min，共30个循环，最后延伸72°C 5 min ；
第二轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ M，引物々他7. 1私DRB1. 2各1 μ M，Taq聚合酶0. 5U，稀释 10倍后的第一轮PCR产物LOyI^ddH2O补充体积至20μ L ；反应条件预变性94°C 5 min, 变性94°C lmin，退火60°C 30s，延伸72°C 30s，共25个循环，最后延伸72°C 5 min ； 利用引物序列为
DRB1. 1，5，-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’， GIo, 5' -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’， DRB1. 2,5' -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3，。(4 ) PCR 产物的 SSCP 检测
取2 μ 1的PCR产物加入8 μ 1的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、0. 025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA pH 8. 0 ,98 °C变性 IOmin，立即冰浴 IOmin ;12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，8 °C电泳20h，银染法显色后拍照； (5)结果判断
在河西绒山羊GOLA-DRB1基因第2外显子的PCR-SSCP检测，有沈个等位基因，河西绒山羊流产病抗性等位基因为G0LA_DRB1*03的核苷酸序列为ctggagtatcataagagcgagtgtc atttcttcaacgggaccgagcgggcgcggttcctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgac aacgactggggcgagttccgggcggtggccgagctggggcggcagaccgccaagtactggaacagccagaaggagct cctggagcggaggcggaccgaggtggacacgttctgcagacacaactacgtggtcttt ；
GOLA-DRB 1*11 丰亥 1 ]^歹0 :ctggagtatcataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccgagcgg gtgtggtacctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagtaccgggc ggtggccgagctggggcggccggacgccaagtactggaacagccagaaggagatcctggagcagaggcggaccgagg tggacacggtgtgcagacacacatacggggtcggt ；
易感等位基因为 G0LA_DRB1*18 的核苷酸序列为ctggagtattacaagagagagtgtcatttct tcaatgggaccgagcgggtgcggttcctggacagatacttccataatggagaagagttcgtgcgcttcgacagcgac tggggcgagttccgggcagtgaccgagctggggcggccggacgccgagtactggaacagccagaaggacttcctgga
gBgCBggBggBCCgCggtggBCBCgtBCtgCBgatBCBBCtBCggggtCBgg。本发明的有益效果反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型河西绒山羊养殖企业的抗流产病的选种。本发明利用PCR-SSCP对表型正常和患流产病河西绒山羊G0LA-DRB1基因第2外显子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因，结合表型观测资料，确定易感等位基因和抗性等位基因，为河西绒山羊没有感染时的抗病选育进行指导。本发明通过对试验羊只GOLA-DRB1基因第2外显子的PCR-SSCP检测，检测出了 洸个等位基因，其中 23 个等位基因(G0LA-DRB1*01、GOLA-DRB 1*02, GOLA-DRB 1*04, G0LA-DRB1*05、 GOLA-DRB1*06、 GOLA-DRB1*07、 G0LA_DRB1*08、 G0LA_DRB1*09、 G0LA-DRB1*12、 G0LA_DRB1*13、 G0LA_DRB1*14、 G0LA_DRB1*15、 G0LA_DRB1*16、 G0LA-DRB1*17、 G0LA_DRB1*19、 G0LA_DRB1*20、 G0LA_DRB1*21、 G0LA_DRB1*22、 GOLA-DRB 1*23,GOLA-DRB 1*24,GOLA-DRB 1*25,GOLA-DRB 1*26)在正常和患病群体中都存在， 2个等位基因(G0LA-DRB1*03和G0LA_DRB1*11)只在正常群体中存在，另有1个等位基因 (G0LA-DRB1*18)只在患病群体中存在。将等位基因G0LA_DRB1*03和G0LA_DRB1*11作为河西绒山羊流产病抗病相关MHC基因标记，建立了抗病相关基因标记辅助选种技术。
本发明对河西绒山羊流产病的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。


图1是河西绒山羊DRBl基因第2外显子的PCR-SSCP检测凝胶图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。下面以河西绒山羊流产病抗性分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。实施例1 一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒，其包括有第一 PCR反应液，第二 PCR反应液，G0LA-DRB1*11和G0LA_DRB1*03的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，变性上样缓冲液，TEMED (四甲基乙二胺)，12%非变性聚丙烯酰胺(Acr Bis = 37. 5:1)。所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0. 025%溴酚蓝，0. 025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH 8. 0。所述的第一 PCR反应液的反应液总体积20yL，其中IOXbuffer缓冲液为 2. OyL，Mg2 + 浓度为 2. 5mM，dNTPs 的终浓度为 100 μ M，引物 DRB1. 1 禾口 GIo 各 0. IyMjTaq 聚合酶0. 5U，模板DNA50ng，ddH20补充体积至20 μ L。所述的第二 PCR反应液的反应液总体积20yL，其中IOXbuffer缓冲液为 2. 0 μ L ,Mg2 + 浓度为 2. 5mM, dNTPs 的终浓度为 100 μ Μ，引物 DRB1. 1 和 DRB1. 2 各 0. 1 μ Μ， Taq聚合酶0. 5U，稀释10倍后的第一轮PCR产物1. 0 μ L，ddH20补充体积至20 μ L。河西绒山羊流产病抗性等位基因G0LA_DRB1*11的DNA标准样的核苷酸序列为 ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggt gtggtacctg60 gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttcg acaacgactg gggcgagtac 120 cgggcggtgg ccgagctggg gcggccggac gccaagtact ggaacagcca gaaggagatc 180 ctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtaggt 240
河西绒山羊流产病抗性等位基因G0LA-DRB1*03的DNA标准样的核苷酸序列为 ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg60
gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc120
cgggcggtgg ccgagctggg gcggcagacc gccaagtact ggaacagcca gaaggagctc 180 ctggagcgga ggcggaccga ggtggacacg ttctgcagac acaactacgt ggtcttt240
实施例2 —种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为
(1)待检基因组DNA(1 μ L/50ng)与试剂盒中第一 PCR扩增液混合，按上述第一组引物 PCR反应条件进行扩增；
(2)试剂盒中第二PCR扩增液与步骤(1)的PCR扩增产物混合，按上述第二组引物PCR 反应条件进行扩增；
(3)用步骤(2)中扩增的PCR产物和G0LA-DRB1*03或G0LA_DRB1*11的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
(4)步骤(3)中检测到的带型与G0LA-DRB1*03或G0LA_DRB1*11标准样带型一致的样品为携带河西绒山羊流产病抗性等位基因的个体。实施例3 —种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试方法，其特征是步骤为(1)样品采集采集表型正常和流产病的河西绒山羊，颈静脉采血10ml，A⑶抗凝， -20 °C冻存；
(2)基因组DNA的提取用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
(3)聚合酶链式反应
第一轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中10 Xbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ Μ,引物々他7. 1和GIo各0. 1 μ M，Taq聚合酶0. 5U,模板DNA50ng，ddH20补充体积至20 μ L ；反应条件预变性94°C 5 min,变性94°C lmin,退火 600C 2min，延伸72°C 2min，共30个循环，最后延伸72°C 5 min。第二轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L ,Mg2 +浓度为2. 5mM，dNIPs的终浓度为100 μ M，引物々他7. 1琳DRB1. 2各1 μ M，Taq聚合酶0. 5U， 稀释10倍后的第一轮PCR产物1. 0 μ L，ddH20补充体积至20 μ L ；反应条件预变性94°C 5 min，变性94°C lmin，退火60°C 30s，延伸72°C 30s，共25个循环，最后延伸72°C 5 min。引物序列为
DRB1. 1，5，-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’， GIo, 5' -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’， DRB1. 2,5' -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3，。(4 ) PCR 产物的 SSCP 检测
取2 μ 1的PCR产物加入8 μ 1的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、0. 025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA pH 8. 0 ,98 °C变性 IOmin，立即冰浴 IOmin ;12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，8 °C电泳20h，银染法显色后拍照； (5)结果判断
在河西绒山羊GOLA-DRB1基因第2外显子的PCR-SSCP检测，发现了沈个等位基因，河西绒山羊流产病抗性等位基因为
G0LA-DRB1*03 和 G0LA-DRB 1*11G0LA- DRB1*03 核苷酸序列为ctggagtatcataagagcga gtgtcatttcttcaacgggaccgagcgggcgcggttcctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgct tcgacaacgactggggcgagttccgggcggtggccgagctggggcggcagaccgccaagtactggaacagccagaag gagctcctggagcggaggcggaccgaggtggacacgttctgcagacacaactacgtggtcttt ；
GOLA-DRB 1*11 丰亥 ^f歹丨」为:ctggagtatcataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccgagcg ggtgtggtacctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagtaccggg cggtggccgagctggggcggccggacgccaagtactggaacagccagaaggagatcctggagcagaggcggaccgag gtggacacggtgtgcagacacacatacggggtcggt,
易感等位基因为 GOLA-DRB 1*18,GOLA-DRB 1*18 的核苷酸序列为ctggagtattacaagaga gagtgtcatttcttcaatgggaccgagcgggtgcggttcctggacagatacttccataatggagaagagttcgtgcg cttcgacagcgactggggcgagttccgggcagtgaccgagctggggcggccggacgccgagtactggaacagccaga
BggBCttCCtggBgBgCBggBggBCCgCggtggBCBCgtBCtgCBgBtBCBBCtBCggggtCBggo实验例1
试验材料河西绒山羊基因组DNA采自甘肃省酒泉市肃北县石宝城乡牧民羊群，其中正常个体 720份，流产个体330份。羊只颈静脉采血10ml，加入A⑶抗凝，置于_20°C。试验方法
1.引物设计和PCR扩增
应用巢氏PCR方法，即三个引物经两轮PCR扩增G0LA-DRB1第2外显子，第一轮用引物 DRB1. 1和GIo，DRB1. 1位于第一内含子和第二外显子的交界处，包含第一内含子的18个碱基，GIo位于第二个外显子的下游约0. 2 kb处，第二轮用引物DRB1. 1和DRB1. 2，DRB1. 2包含了整个第二外显子，目的片段大小为^^P。引物序列如下 DRB1. 1，5，-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’， GIo, 5' -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’， DRB1. 2,5' -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3，。最佳反应体系及条件
第一轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为2. 5mM，dNTPs的终浓度为100 μ M，引物DRB1. 1和GIo各0. 1 μ M，Taq聚合酶0. 5U，模板 DNAO. 850ng，ddH20补充体积至20μ L ；反应条件预变性94°C 5 min，变性94°C lmin，退火 60°C 2min，延伸72°C 2min，共30个循环，最后延伸72°C 5 min。第二轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L ,Mg2 +浓度为 2. 5mM, dNTPs 的终浓度为 100 μ M，引物 DRB1. 1 和 DRB1. 2 各 0. 1“]\^&9聚合酶0. 5U, 稀释10倍后的第一轮PCR产物1. 0 μ L，ddH20补充体积至20 μ L ；反应条件预变性94°C 5 min，变性94°C lmin，退火60°C 30s，延伸72°C 30s，共25个循环，最后延伸72°C 5 min。引物序列为
DRB1. 1，5，-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’， GIo, 5' -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’， DRB1. 2,5' -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3，。DRB1. 1和GIo的扩增产物大小为485bp，DRBl. 1和DRB1. 2以DRB1. 1和GIo的扩增产物为模板的扩增产物大小为^^3P。得到^a3p的特异性扩增产物，可直接进行SSCP检测。2. SSCP 检测
取步骤1中2 μ 1的PCR产物加入8 μ 1的上样变性缓冲液[包括98%去离子甲酰胺、 0. 025% 溴酚蓝、0. 025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA (pH 8. 0) ]，98 °C变性 IOmin，立即冰浴lOmin。12 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶(Arc Bis = 37. 5 1) 250V电压条件下，8 V 电泳20h，银染法显色后拍照。其中，对PCR扩增产物进行SSCP检测，结果在所检测的1050只河西绒山羊中共有
洸个等位基因，分别命名为GOLA-DRB 1*01、GOLA-DRB 1*02......GOLA-DRB 1拉6，各等位基因的
电泳条带从1条到3条不等。河西绒山羊流产病抗性等位基因G0LA_DRB1*11的DNA标准样的核苷酸序列为 ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggt gtggtacctg60 gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttcg acaacgactg gggcgagtac 120 cgggcggtgg ccgagctggg gcggccggac gccaagtact ggaacagcca gaaggagatc 180ctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtaggt240
河西绒山羊流产病抗性等位基因G0LA-DRB1*03的DNA标准样的核苷酸序列为 ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg60
gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc120
cgggcggtgg ccgagctggg gcggcagacc gccaagtact ggaacagcca gaaggagctc 180 ctggagcgga ggcggaccga ggtggacacg ttctgcagac acaactacgt ggtcttt240
3.不同等位基因的克隆测序
经SSCP检测后，利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收不同等位基因的PCR产物。回收后的片段用载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5 α菌株，菌落PCR鉴定后送上海桑尼生物工程有限公司进行测序。 4.河西绒山羊DRBl基因第2外显子等位基因频率表1 G0LA-DRB1基因第2外显子等位基因频率
权利要求
1.一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有第一 PCR 反应液，第二 PCR 反应液，G0LA-DRB1*03 和 G0LA_DRB1*11 的 DNA 标准样；SSCP 检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶 Arc:Bis=37. 5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0. 025%溴酚蓝，0. 025% 二甲苯青， IOmmol/L EDTA pH 8. 0 ；所述的第一 PCR反应液的反应液总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L， Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ Μ，引物DRB1. 1和GIo各0. 1 μ M，Taq聚合酶 0. 5U，模板 DNA50ng, ddH20 补充体积至 20 μ L ；所述的第二 PCR反应液的反应液总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L， Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ Μ，引物DRB1. 1和DRB1. 2各0. 1 μ M，Taq聚合酶0. 5U，稀释10倍后的第一轮PCR产物l.OyL, ddH20补充体积至20 μ L ； 所述的G0LA-DRB1*03的DNA标准样的核苷酸序列为ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg 60 gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc 120 cgggcggtgg ccgagctggg gcggcagacc gccaagtact ggaacagcca gaaggagctc 180 ctggagcgga ggcggaccga ggtggacacg ttctgcagac acaactacgt ggtcttt240所述的G0LA-DRB1*11的DNA标准样的核苷酸序列为ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggt gtggtacctg 60 gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttcg acaacgactg gggcgagtac 120 cgggcggtgg ccgagctggg gcggccggac gccaagtact ggaacagcca gaaggagatc 180 ctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtaggt 2400
2.如权利要求1所述的河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为(1)待检基因组DNAlμ L/50ng与试剂盒中第一PCR扩增液混合，按上述第一组引物PCR 反应条件进行扩增；(2)试剂盒中第二PCR扩增液与步骤(1)的PCR扩增产物混合，按上述第二组引物PCR 反应条件进行扩增；(3)用步骤(2)中扩增的PCR产物和G0LA-DRB1*03或G0LA_DRB1*11的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；(4)步骤(3)中检测到的带型与G0LA-DRB1*03或G0LA_DRB1*11标准样带型一致的样品为携带河西绒山羊流产病抗性等位基因的个体。
3.一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测方法，其特征在于，具体的检测步骤如下(1)样品采集采集表型正常和流产病的河西绒山羊，颈静脉采血10ml，A⑶抗凝，-20 °C冻存；(2)基因组DNA的提取用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；(3)聚合酶链式反应第一轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ M,引物DRB1. 1和GIo各0. 1 μ M, Taq聚合酶0. 5U，模板DNA50ng，ddH20补充体积至20 μ L ；反应条件预变性94°C 5 min,变性94°C lmin,退火 600C 2min，延伸72°C 2min，共30个循环，最后延伸72°C 5 min ；第二轮PCR反应体系总体积20 μ L，其中IOXbuffer缓冲液为2. 0 μ L，Mg2 +浓度为 2. 5mM, dNTPs的终浓度为100 μ M，引物々他7. 1琳DRB1. 2各1 μ M，Taq聚合酶0. 5U，稀释 10倍后的第一轮PCR产物LOyI^ddH2O补充体积至20μ L ；反应条件预变性94°C 5 min, 变性94°C lmin，退火60°C 30s，延伸72°C 30s，共25个循环，最后延伸72°C 5 min ； 引物序列为DRB1. 1，5，-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’， GIo, 5' -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’， DRB1. 2,5' -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3‘；(4)PCR产物的SSCP检测取2 μ 1的PCR产物加入8 μ 1的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、0. 025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA pH 8. 0 ,98 °C变性 IOmin，立即冰浴 IOmin ;12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，8 °C电泳20h，银染法显色后拍照；(5)结果判断在河西绒山羊GOLA-DRB1基因第2外显子的PCR-SSCP检测，有沈个等位基因，河西绒山羊流产病抗性等位基因为G0LA_DRB1*03的核苷酸序列为ctggagtatcataagagcgagtgtc atttcttcaacgggaccgagcgggcgcggttcctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgac aacgactggggcgagttccgggcggtggccgagctggggcggcagaccgccaagtactggaacagccagaaggagct cctggagcggaggcggaccgaggtggacacgttctgcagacacaactacgtggtcttt ；GOLA-DRB 1*11 丰亥 ^f 歹丨」为:ctggagtatcataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccgagcg ggtgtggtacctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagtaccggg cggtggccgagctggggcggccggacgccaagtactggaacagccagaaggagatcctggagcagaggcggaccgag gtggacacggtgtgcagacacacatacggggtcggt ；易感等位基因为 G0LA_DRB1*18 的核苷酸序列为ctggagtattacaagagagagtgtcatttct tcaatgggaccgagcgggtgcggttcctggacagatacttccataatggagaagagttcgtgcgcttcgacagcgac tggggcgagttccgggcagtgaccgagctggggcggccggacgccgagtactggaacagccagaaggacttcctggagBgCBggBggBCCgCggtggBCBCgtBCtgCBgatBCBBCtBCggggtCBgg。
全文摘要
本发明涉及动物生物技术领域中的山羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到河西绒山羊流产病抗性等位基因检测试剂盒。一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有第一PCR反应液，第二PCR反应液，GOLA-DRB1*03和GOLA-DRB1*11的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/LEDTApH8.0。本发明的优点是本发明对河西绒山羊流产病的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
文档编号G01N27/447GK102533971SQ20111038142
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月27日 优先权日2011年11月27日
发明者刘秀, 李少斌, 王佳泰, 王继卿, 罗玉柱, 胡江, 马小军 申请人:甘肃农业大学