专利名称：一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，特别涉及一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变。
背景技术：
20世纪80年代以来，结核病疫情重新上升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。据世界卫生组织统计，目前全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新增 800万病人，死亡200 300万人，是目前死亡率最高的传染性疾病。根据世界卫生组织的评估，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度，居全球第二位。今年召开的第二届全球遏制结核病伙伴论坛大会上，将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的第一位。喹诺酮类药物是一类人工化学合成抗菌药，由于该类药物均具有4-喹诺酮母核的基本结构，故由此命名。氟诺喹酮类在喹诺酮母核的第六6位上引入氟，第7位上引入哌嗪基或吡咯啉基的衍生物，为第3代喹诺酮产品。已用于临床抗分枝杆菌的氟喹诺酮类药物有环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)，氧氟沙星(Ofloxacin，0FL)，左氧氟沙星 (Levof loxacin，LEV)，斯帕沙星(Sparf loxacin，SPX)，加替沙星(Gatif loxacin，GAT)，莫西沙星(Moxifloxacin，Μ0Χ)等。随着喹诺酮类抗菌药物在结核分枝杆菌(MTB)感染中使用的增多，结核分枝杆菌对该类抗菌药物的耐药率逐渐上升。因此，对氟喹诺酮耐药突变的检测已成为必要。目前，临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因检测两类，并以表型检测为主。表型检测中的常规药敏试验方法、BACTEC TB-460液体培养基药敏试验方法以及噬菌体生物扩增法已应用于临床，然而这些方法都有明显的局限性。常规药敏试验方法受结核杆菌生长缓慢影响，需要6 8周甚至更长时间才能得到结果。BACTEC TB-460液体培养基药敏试验方法虽较灵敏，速度较快，但需昂贵设备，且易受杂菌污染，并有放射性危害。噬菌体生物扩增法则受干扰因素多，且操作复杂。由于目前的表型检测难以形成高效准确的检测手段，常常造成病情延误，更难以实现追踪治疗。已有的基因型检测方法 W DNA IlJ^5 (1、Dauendorffer, JN, Guillemin I， Aubry A et al, Identification of mycobacterial species by PCR sequencing of quinolone resistance-determining regions of DNA gyrAse genes. J Clin Microbiol. 2003,41 :1311-1315.)，线性杂交法 (2、Giannoni F, Iona Ε, Sementilli F et al. Evaluation of a new line probe assay for rapid identification of gyrA mutations in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2005,49 :2928-2933.), PCR-SSCP Tj 法(3、 Cheng AF, Yew WW, Chan Eff et al.Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2004,48 :596-601), DHPLC 方法(4、Shi R, Otomo K, Yamada H et al. Temperature-mediated heteroduplexanalysis for the detection of drug-resistant gene mutations in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by denaturing HPLC, SURVEYOR nuclease. Microbes Infect. 2006，8 :128-135)，生物芯片法(5、Antonova 0V, Gryadunov DA, Lapa SA et al. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to fluoroquinolones by hybridization on biological microchips. Bull Exp Biol Med. 2008，145 :108-113)，实时 PCR 方法(6、van Doorn H R，An DD, de Jong MD et al. Fluoroquinolone resistance detection in Mycobacterium tuberculosis with locked nucleic acid probe real-time PCR. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008,12 :736-742) 等，德国HAIN公司已有可检测gyrA基因突变的GenoType MTBDRs 1试剂盒。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术。本发明的另一目的在于提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒。所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法包括以下步骤1)提取结核分枝杆菌样本的DNA ；2)根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区OiRDR)，利用引物设计软件ft~imer 5 设计引物和探针；在步骤2、中，所述设计引物和探针的具体方法如下a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；b，探针的荧光基团可选择FAM、R0X,HEX, CY5、ΤΕΤ、CAL-Fluor等中的任意一种，淬灭基团可选择BHQ或Dabcyl等，探针可以进行各种类型的修饰(如LNA标记)等。所述引物和探针的具体序列为Primer-F 5' -CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3，Primer-R 5’ -GACCAGGGCTGGGCCATG-3’Probe-A 5‘ -FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3‘3)构建单管单色实时PCR体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测， 比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点0 值)的差异，判断样品是否发生突变， 样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过rc)时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照至少2°C时判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。在步骤3)中，所述单管单色实时PCR体系可为含有IXPCR buffer (IOmM Tris-HCl, pH8. 6,50mM KC1，5% 甘油)，2. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM,2U Taq,0. OlU UNG,0. 8 μ M Primer-R,0. 08 μ M Primer-F,0. 08 μ M Probe-A。有经验的人也可选择其它类型的buffer，或者通过优化找到更为合适的buffer 类型。取结核分枝杆菌样本5μ 1 DNA作为模板，并取浓度为IO4Copies/μ 1的阳性质粒作为阳性对照，双蒸水做为阴性对照；
所述PCR的反应程序为第一步50°C2min，95°C IOmin ；第二步95°C10s，65°C 20s (每个循环降低 1°C )，78°C 25s，10 个循环；第三步95°C10s, 55°C 20s, 78°C 25s, 40 个循环，65°C 20s 处收集荧光信号；第四步95°Canin ；第五步40°C2min ；第六步45 85 °C，每1°C收集荧光信号，选用FAM荧光通道。本发明检测了 279个临床样本，包括270份敏感菌株和9份耐药菌株。关于杂合结果的判读，分3种情况①当样本出现双峰时，即为杂合样本；②样本为一个熔合峰，与阳性对照的熔点一致，但峰型跟阳性对照的峰型有较大差异，在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起，即为杂合样本；③样本为一个熔合峰，为突变熔点，但在野生峰的位置出现小峰或突起，即为杂合样本。杂合样本对氟喹诺酮耐药，建议出现杂合样本时将样本重复检测，以确定样本耐药性。所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒设有盒体、扩增试剂、 TB酶混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB DNA提取液；扩增试剂、TB酶混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB DNA提取液放置在盒体内；所述扩增试剂为FQ PCR Mix，其成分为 IXPCR buffer(IOmM Tris-HCl，pH8. 6， 50mM KCl，5 % 甘油)，2. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM，dUTP 0. 4mM,0. 8μΜ Primer-R,0. 08 μ M Primer-F,0. 08 μ M Probe_A。所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG。所述FQ阳性对照为FQ野生型标准质粒，TB阴性对照可选自TB DNA提取液、H2O, Tris或生理盐水等。所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX_100。采用所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒对标本的检验方法包括以下步骤1)试剂准备——配液区①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为取 nX 19. 6 μ LFQ PCR Mix和nX0.4yL TB酶混合液a加入到1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在_20°C并在4h内使用。②PCR反应液的分装，将PCR反应液以每管20 μ L分装于PCR薄壁反应管。③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20°C直至样品提取处理完毕。2)样品提取及加样——提取区①固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250 μ L TB DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取lmL，IOOOOrpm离心15min， 丢弃上清并在250 μ L TB DNA提取液中重悬细菌。②封口膜封口，99°C加热20min。14000rpm离心lOmin，转移上清到新1. 5mL离心
管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20°C，并于1个月内完成试验。注意不要反复冻融样品。)
③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品 5uL0立即盖严管盖。④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。3) PCR扩增-扩增区①仪器的程序设定如下第一步50°C2min，95°C IOmin ；第二步95°C10s，65°C 20s (每个循环降低 1°C )，78°C 25s，10 个循环；第三步95°C10s, 55°C 20s, 78°C 25s, 40 个循环；第四步95°Canin ；第五步40°Canin ；第六步45 85 °C，每1°C收集荧光信号，选用FAM荧光通道。②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。(3)试剂盒的参考值(参考范围)阳性对照，即野生型的Tm值范围反应体系中FAM通道野生型对照峰的Tm值为 71°C 士 1°C。其中Tm值是在特定Bio-Rad CFX96仪器上所得的常见值，作为参考。当使用其它仪器时，Tffl值可能略有变动，以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，请参考阳性对照和阴性对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值。(4)结果判读通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过rc)时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照2°C及以上时(ΔΤω > 2°C )判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。关于杂合样品结果的判读当熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂合样品，分3 种情况①当样品出现双峰时，即为杂合样品；②样品为一个融合峰，与阳性对照的熔点一致，但峰型跟阳性对照的峰型有较大差异，在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起，即为杂合样品；③样品为一个融合峰，为突变熔点，但在野生峰的位置出现小峰或突起，即为杂合样品。杂合样品对氟喹诺酮耐药，建议出现杂合样品时将样品重复检测，以确定样品耐药性。实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。与现有的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药检测方法相比，本发明具有以下突出的优占.
^ \\\ ·1)引物是设计在gyrA基因氟喹诺酮耐药决定区的两端，具有高度的特异性。2)探针的设计，充分考虑了主要突变位点的重点检测和其它突变类型的有效覆盖，从而达到提高突变检出率的目的。另外，探针可选择多种类型的荧光基团和淬灭基团，并可进行各种修饰。3)通过对熔点的分析区分野生型和突变类型。野生型完全与探针序列匹配，因此熔点较高；突变型不能完全与探针序列匹配，因此熔点较野生型低，单碱基导致的突变会导致熔点2 6°C左右的下降。本发明大大提高了结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测的灵敏度、特异性，大大缩短了检测所需要的时间。


图1为探针检测结核分枝杆菌单碱基突变的典型结果图。在图1中，横坐标为反应温度，纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT)。曲线1，2，3，4，5分别表示突变94GAC > GCC,突变94GAC > GGC,突变90GCG > GTG,野生型，阴性对照。图2为本发明所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒实施例结构示意图。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明做进一步说明采用的仪器设备参见表1表权利要求
1.一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，其特征在于包括以下步骤1)提取结核分枝杆菌样本的DNA；2)根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区，利用引物设计软件I^rimer5设计引物和探针；3)构建单管单色实时PCR体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测，比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点的差异，判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照2°C或2°C以上时判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。
2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤幻中，所述设计引物和探针的具体方法如下a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；b，探针的荧光基团可选择FAM、ROX、HEX、CY5、ΤΕΤ、CAL-Fluor任意一种， 淬灭基团可选择BHQ、Dabcyl。
3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤幻中，所述引物和探针的具体序列为Primer-F :5’ -CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3，Primer-R :5’ -GACCAGGGCTGGGCCATG-3’Probe-A 5' -FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3‘。
4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述单管单色实时PCR体系为含有 IXPCR buffer, 2. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 2U Taq, 0. 01UUNG,0. 8μΜ of Primer-R,0. 08 μ M of Primer-F,0. 08 μ M of Probe-A ；取结核分枝杆菌样本5μ 1 DNA作为模板，并取浓度为IO4Copies/μ 1的阳性质粒作为阳性对照，双蒸水做为阴性对照。
5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，其特征在于在步骤幻中，所述PCR的反应程序为第一步50°C 2min，95°C IOmin ；第二步95°C 10s，65°C 20s (每个循环降低 1°C )，78°C 25s，10 个循环； 第三步95°C 10s，55°C 20s, 78°C 25s, 40个循环，65°C 20s处收集荧光信号； 第四步:95°C 30s ； 第五步:40°C 2min ；第六步40 85 °C，每1°C收集荧光信号，选用FAM荧光通道。
6.如权利要求1所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒，其特征在于设有盒体、扩增试剂、TB酶混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB DNA提取液；扩增试剂、TB酶混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB DNA提取液放置在盒体内；所述扩增试剂为 FQ PCR Mix，其成分为 IXPCR buffer (IOmM Tris-HCl，pH8. 6，50mM 1((1，5%甘油)，2.01111 MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM，dUTP 0. 4mM,0. 8μΜ Primer-R, 0· 08 μ M Primer-F,0. 08 μ M Probe-A ；所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG ；所述FQ阳性对照为FQ野生型标准质粒，TB阴性对照选自TB DNA提取液、H20、Tris或生理盐水；所述TB DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。
7.如权利要求6所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒对标本的检验方法，其特征在于包括以下步骤1)试剂准备——配液区①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为取 nX 19. 6 μ LFQ PCR Mix禾PnX0· 4μ L TB酶混合液a加入到1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒，配好的PCR反应液必须贮存在_20°C并在4h内使用；②PCR反应液的分装，将PCR反应液以每管20μ L分装于PCR薄壁反应管；③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20°C直至样品提取处理完毕；2)样品提取及加样——提取区①固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在 250 μ L TB DNA提取液中，液体培养基中生长的结核分枝杆菌取lmL，IOOOOrpm离心15min， 丢弃上清并在250 μ L TB DNA提取液中重悬细菌；②封口膜封口，99°C加热20min，14000rpm离心lOmin，转移上清到新1.5mL离心管，上清即为PCR扩增模板；③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品 5 μ L，立即盖严管盖；④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区；3)PCR扩增-扩增区①仪器的程序设定如下第一步50°C 2min，95°C IOmin ；第二步95°C 10s，65°C 20s，每个循环降低1°C，78°C 25s，10个循环；第三步95°C 10s，55°C 20s, 78°C 25s, 40 个循环；第四步95°C 2min ；第五步:40°C 2min ；第六步45 85 °C，每1°C收集荧光信号，选用FAM荧光通道；②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理；(3)试剂盒的参考值阳性对照，即野生型的Tm值范围反应体系中FAM通道野生型对照峰的Tm值为 71°C 士 1°C ；其中Tm值是在特定Bio-Rad CFX96仪器上所得的常见值，作为参考，当使用其它仪器时，Tffl值可能略有变动，以当次试验阳性对照所得的Tm值为准；Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，参考阳性对照和阴性对照的峰型选择有效1值；当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时，通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值；(4)结果判读通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点Tm值的差异判断样品是否发生突变，样品的熔点与阳性对照的熔点一致，即误差不超过rc时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照至少2°c时，即ΔΤω > 2°C，判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。
全文摘要
一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒。提取结核分枝杆菌样本的DNA；根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区，设计引物和探针；构建单管单色实时PCR体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测，比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线熔点的差异，判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照至少2℃时判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。提高结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测灵敏度、特异性，缩短检测所需时间。
文档编号G01N21/64GK102229990SQ20111013783
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者刘歆, 张轶, 李庆阁, 胡思玉 申请人:厦门大学, 厦门致善生物科技有限公司