专利名称：：一种灭多威残留快速检测elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，主要适用于大批量水和土壤等样品中灭多威残留的快速测定。属于酶免疫分析
技术领域：
中所创立的一种新的快速测定方法。二
背景技术：
：灭多威(methomyl)为氨基甲酸酯类内吸性广谱杀虫剂，具有强烈的触杀和胃毒作用。主要用于棉花、烟草、果树、蔬菜防治蚜虫、蛾、地老虎等同翅目、鳞翅目、鞘翅目及其他害虫。对雌、雄大鼠急性经口LDso分别为23.5mg/kg和17.0mg/kg，兔急性经皮LD5o〉5000mg/kg,属高毒性N—甲基氨基甲酸酯类杀虫剂。我国只允许在特定的作物上使用。由于此杀虫剂近年来较广泛地使用，其所引起的食物中毒、误服以及投毒事件时有发生。我国强制性国家标准规定甘蓝和柑橘中灭多威的最高残留限量分别为2mg/kg和5mg/kg。灭多威的检测方法有液相色谱、气相色谱、及比色法等，这些方法前处理相对复杂耗时，对样本净化要求高，因样本基质成分复杂而需要建立不同的分析方法，很难满足现场批量样品快速检测的需要，因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留快速分析技术。酶联免疫吸附分析方法(ELISA)特异性强、灵敏度高而且简便快速，可以弥补色谱分析方法的缺陷，本发明对解决大批量样品的灭多威残留现场监控技术具有重要的现实意义。三
发明内容为了解决目前灭多威残留仪器分析方法成本高、操作复杂、特异性差、灵敏度低和检测结果不稳定等缺点，本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精密度、操作方法简便，并能用于大批量样品快速检测的灭多威残留的ELISA试剂盒。灭多威残留的ELISA试剂盒包括盒体、设在盒体内的96孔酶标板、海绵支架和包含有浓縮洗涤液(PBST)、不同浓度的灭多威标准液、抗灭多威多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、A液、B液和反应终止液。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是首先将灭多威改造成适用于与载体蛋白(BSA和OVA)偶联的半抗原灭多威琥珀酸单酯(MOSE),利用水溶性碳化二亚胺(EDC)法将半抗原(MOSE)与牛血清白蛋白偶联后制备人工免疫原，用该免疫原免疫新西兰大白兔制备出灭多威多克隆抗体。再用混合酸酐法将半抗原(MOSE)与卵清蛋白偶联，它们的复合物作为包被抗原固定于酶标板孔壁上。预先将待测灭多威样品和多克隆抗体混合反应30分钟，再将反应后的抗原抗体加入到酶标板孔中，固定包被抗原和待测灭多威相互竞争与抗体反应，由于各孔中的固相抗原含量和加入的抗体含量均一致，所以当待测的灭多威浓度高时，被结合在固相抗原上的抗体(一抗)量就少，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(二抗)后，二抗与一抗的结合量就少，最后加入底物液(A液)和显色液(B液)，显色反应浅(0D值低)，表明抑制率高；反之，当待测灭多威浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。用已知的灭多威浓度检测并绘制标准曲线，可以推算出待测灭多威的浓度。本发明的优点是能准确灵敏地检测水和土壌中灭多威残留，样品地前处理过程简便，耗时少，能同时检测大量地样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。试剂盒的保存期大于6个月。四附图为灭多威的标准抑制曲线，曲线的回归方程为y=12.55x—3.2714(R2=0.9984，150=500.0ng/mL，120=100.0ng/mL)。五具体实施例方式试剂盒操作及结果计算待测样品经前处理后，用PBST定容备用。拆开真空包装袋并取出酶标板，置室温(20~25°C)平衡30min以上。将相同浓度的抗体分别与不同浓度(0.0，10.0，50.0,100.0，250.0，500.0,1000.0，2000.0，5000.0，10000.0ng/mL)的灭多威标准液或待测灭多威液混合，37'C孵育30分钟；然后将lOOpL此反应混合液移入酶标板中，37'C孵育30分钟；取出后洗涤3次，拍干；每孔加入100pL经PBS稀释2000倍的羊抗兔IgG-HRP液，封板后放入37r孵育lh，洗涤，拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加lOO^L,在暗处显色1015分钟，每孔加入50pL2moL/L的硫酸终止反应，静置2min，在终止液30min内用酶标仪测定各孔的00492值。将含0.0ng/mL标准品孔的0D值减去含最大浓度标准品孔的0D值定为B。，其余孔经同样方法校正后的0D值定为B:以标准品溶液浓度对数为横坐标，抑制率I(IKBo-ByBo)为纵坐标，绘制出灭多威标准抑制曲线。根据曲线的回归方程可以推算出相应样品的浓度，也可以推算出I50(B/Bo=50.0%)及最小检测限I2o(B/Bo=80.0%)。其中15()为抑制50.0%抗原抗体反应所需灭多威浓度，120为抑制20.0%抗原抗体反应所需灭多威浓度。实施例1灭多威半抗原合成首先将灭多威原药提纯后水解为灭多威肟，然后用丁二酸酐将其酯化为灭多威琥珀酸单酉旨(MOSE)。(1)灭多威原药加入1.53倍体积的甲醇，振荡提取6h，过滤后滤液浓縮至原滤液体积的0.5~1.0倍，再加入浓縮滤液0.71.7倍体积的水，静置后得到提纯后的白色灭多威晶体；(2)取制得的灭多威纯品0.03mol溶解于70mL0.67mol/L的NaOH溶液中，溶剂为甲醇水4:3(v/v)。25。C振荡36h，混合液用盐酸调节pH-7后用80mL异丙醚萃取，将有机相提取物减压浓縮，得到灭多威肟；(3)在灭多威肟中加入丁二酸酐，灭多威肟与丁二酸酐的摩尔比为l:11.2，再加入4mL三乙胺和20mL无水的四氢呋喃中。回流反应24h;(4)蒸去四氢呋喃和三乙胺，剩余物溶解在30mL乙酸乙酯中，在4'C搅拌下用盐酸调节pH=3~4，分液后再用乙酸乙酯萃取，有机相在无7jCNa2S04上干燥并过滤后，蒸去乙酸乙酯，粗品中加10mL冰冷的乙醚，过滤除去白色的沉淀，滤液蒸去乙醚，得到的固体真空干燥，得到灭多威半抗原一灭多威琥珀酸单酯(MOSE)。实施例2灭多威与载体蛋白偶联(1)水溶性碳化二亚胺(EDC)法制备免疫原(MOSE—BSA)称取合成的MOSE100mg溶于10mL无水二氧六环中，然后加NaOH几滴，振荡使之充分溶解，称取载体蛋白BSA100mg溶于10mLO.lmoL/LpH9.0的硼酸缓冲液中，EDC50mg溶于10mL蒸馏水中。将灭多威与载体蛋白的混合液在室温振荡18h,然后4000rpm离心10min,取上清液逐滴加入振荡的EDC溶液中，加入后继续振荡5h,4000rpm离心10min，将反应液装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用透析液为0.01moL/LpH7.4的PBS透析3d，每天换液四次，最后以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定合成结果，并以紫外分光光度计测定计算结合比。分装保存于4'C的冰箱中备用。(2)混合酸酐法偶联制备包被原(MOSE—OVA)称取450mgMOSE溶于3mL无水二甲基酰胺(DMF)中，开启搅拌，然后加入6化L三正丁胺，冰浴下缓慢滴加由lmL无水二甲基酰胺溶解的氯甲酸异丁酯35^L，加毕，4'C混合反应lh，得混合酸酐。称取450mgOVA溶于2mL0.05moL/LpH9.5的碳酸盐缓冲液，逐滴加入100pL上述混合酸酐反应液，边加边搅拌，室温搅拌反应过夜。次日，将反应液装入透析袋，4'C下先用蒸馏水透析3次，然后用透析液为0.01moL/LpH7.4的PBS透析3d，每天换液4次，直到测不出半抗原得紫外吸收为止。精确计算透析后得偶联物溶液得体积，以紫外分光光度计测定计算结合比，分装保存于4'C的冰箱中备用。实施例3灭多威多克隆抗体制备以M0SE-BSA偶联物作为免疫原，先进行基础免疫，免疫剂量0.5mg/kg(以载体蛋白计)兔子体重，与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射，采用耳缘静脉注射与颈、背部皮下多点注射相结合；每隔2周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂与免疫原混合，从第三次加强免疫开始，每次免疫后7天从兔耳边缘静脉取血0.20.5mL，用间接ELISA法测定抗血清质量，加强免疫5次后从兔心脏采拿血，先用35%的饱和硫酸铵盐析法粗提兔抗血清，再用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获得较纯的灭多威多克隆抗体。实施例4保存期实验将试剂盒放入37'C恒温培养箱做储藏保存实验，4'C冰箱冷藏作对照。以最佳抗原抗体工作浓度为测定浓度，每24h用37'C所储藏的试剂盒与冰箱中保存的试剂盒分别检测高、中、低含量的3个样品，每个样品做3次重复，连续测试7d。通过试剂盒在37'C，7d保存下进行测定，在保存7d后检测效果依然良好，根据惯例，37'C保存7d，相当于4'C保存6个月以上。实际应用中要注意维持条件的稳定，延长保存期。实施例5试剂盒特异性实验选择灭多威的结构类似物作为待测物，测得各物质的抑制中浓度(Iso)，再用下式计算抗体对这些物质的交叉反应性交叉反应率越小，则抗体对灭多威的特异性越强，反之则抗体的特异性差。交叉反应(CR%)=15。(灭多威)/15。(供试物)乂100%。试验测定结果见表l，采用间接ELISA法，所测的农药对灭多威抗体的交叉反应率均低于5%，可以说明试验得到的抗体有较好的特异性。表1抗体交叉反应测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例6添加回收实验取适量灭多威标样添加到样品中，设置0.5、5、50pg/mL3个添加水平，每个水平重复3次，进行测定，计算回收率。ELISA检测样品的前处理-甘蓝和油菜取样品5.0g,粉碎制成匀浆，添加不同浓度的灭多威后加20mL丙酮，振荡过滤，浓縮至干。加20mL饱和NaCL水溶液，5mL0.5mol/L硫酸溶液，用正己垸30mL萃取3次，弃去己烷相，水相继续用二氯甲烷50mL萃取，弃去水相，二氯甲垸层转入250mL圆底烧瓶中浓縮吹干，用PBS定容到2mL备用。水样过滤去除机械杂质，一添加不同浓度的灭多威后离心，直接用于ELISA检测。土样称取50g土样，加入不同浓度灭多威标样的水溶液，风干，加入50mL蒸馏水和lOOmL丙酮，机械振荡后抽滤。用丙酮洗涤残渣并过滤，减压蒸去丙酮，然后用PBS定容到lmL，'取样进行ELISA分析。试剂盒的检测结果见表2，甘蓝的回收率为77%~8536%，变异系数5.23%~7.36%;油菜的回收率为79.6°/。~85.4°/0，变异系数4.28%~6.12%;地下水的回收率为86.32%~89%，变异系数3.61%~4.82%;土壤的回收率为65.6%~70.8%，变异系数6.92%~8.34%。试剂盒的回收率在允许范围内，符合农药残留分析的要求。表2试剂盒添加回收测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于由盒体、可拆卸96孔酶标板、海绵支架和支架内包含有浓缩洗涤液(PBST)、不同浓度的灭多威标准液、抗灭多威多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、A液、B液和反应终止液的试剂瓶组成。2.根据权利要求1所述的一种灭多威残留快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的海绵支架上有装有试剂瓶的孔槽。3.根据权利要求1所述的一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的可拆卸96孔酶标板用铝箔袋真空包装，酶标板的板条可拆卸下来，每个孔内均吸附有相同量的包被抗原。4.根据权利要求3所述的包被抗原，其特征在于为灭多威与卵清蛋白(0VA)的偶联复合物。5.根据权利要求1所述的一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的抗灭多威多克隆抗体制备方法如下将灭多威加入到NaOH溶液中，溶剂为甲醇水=1:3(v/v),25'C反应36小时后调p^7。之后用异丙醚萃取，得到灭多威后。产物和丁二酸酐及三乙胺溶解在无水的四氢呋喃中，回流反应24h，剩余物溶解在乙酸乙酯中，在无水硫酸钠上干燥并减压浓縮，粗品用lOmL冰乙醚溶解、过滤蒸馏滤出液，得到半抗原灭多威琥珀酸肟酯(M0SE)。将半抗原(M0SE)与牛血清白蛋白(BSA)偶联的复合物作为免疫原，免疫新西兰大白兔，获得灭多威的多克隆抗体。6.根据权利要求1所述的一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的不同浓度的灭多威标准液用甲醇和蒸馏水配制，溶液中甲醇的含量小于1.0%，浓度分别为0.0，10.0，50.0，100.0，250.0，500.0，1000.0，2000.0，5000.0,10000.0ng/mL。7.根据权利要求1所述的一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的浓縮洗涤液(PBST)内含有氯化钠79g、磷酸二氢钾O.10.3g、磷酸氢二钠24g、氯化钾36g、吐温一201mL、双蒸水50mL。8.根据权利要求1所述的一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的A液30%过氧化氢5"1，96mg柠檬酸，358mgNa2HP04,吐温—201u1，双蒸水10mL，pH5.0;B液邻苯二胺(OPD)4mg，双蒸水IOmL。9.根据权利要求1所述的一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，其特征在于所述的反应终止液为2mol/L的硫酸液。全文摘要本发明公布了一种灭多威残留的快速检测ELISA试剂盒，属于酶免疫分析
技术领域：
中所创立的一种新的快速测定方法。本发明克服了灭多威理化分析方法操作复杂、检测成本高及速度慢等缺点，能够准确快速地检测水和土壤等样品中地灭多威残留。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测灭多威相互竞争与溶液中的抗体反应，竞争结果通过酶催化反应显色现实出来。通过检测已知浓度的灭多威并绘制标准曲线，可以推算出待测灭多威的浓度。试剂盒的保存期超过6个月。文档编号G01N33/543GK101504409SQ200810246959公开日2009年8月12日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者曹远银,菡王,王玉坤申请人:沈阳农业大学