专利名称：：一种单克隆抗体的制备及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种单克隆抗体的制备及其用途，具体说涉及一种适用于同时检测苏丹红I和对位红残留的单克隆抗体的制备及其用途，属于免疫化学分析
技术领域：
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背景技术：
：苏丹红(Sudan)为亲脂性偶氮化合物，是一种红色的工业合成染色剂，属于化工染料，主要用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色，也用于鞋、地板、彩色蜡、焰火礼花等的增色增光。由于苏丹红化学结构中含有偶氮基团，人体摄入后，在还原酶的作用下体内会生成相应的胺类物质，从而对人体具有致癌性。虽然我国以及绝大多数国家都早已明令禁止苏丹红作为添加剂用于食品中，但其能够使食物色泽更鲜亮持久，提高食品的价值，而被少数生产厂家违规当作了食用色素，苏丹红引起的食品安全问题在各大媒体报纸上也是时有报道。2004年6月14日，英国食品标准管理局就此前在超市一批新食品中发现含有潜在致癌物的苏丹红I号色素，向消费者和贸易机构发出了警示，禁用产品目录中的苏丹红I号。2005年2月，英国食品标准署下令将亨氏、联合利华等30家企业生产的可能含有苏丹红I号的400余种食品召回，弓l发了全球的"苏丹红"风暴。我国自2005年3月开始，也相继在辣椒调味品、鸡蛋、鸭蛋、番茄酱等食品中发现苏丹红(孙文汇等，苏丹红与食品安全，动物医学进展，2008，29(4):103-105)。不仅是食品，2007年2月6日，国家质检总局对外发布了最新的唇膏、口红产品的质量专项抽査结报告，发现3种苏丹红首现国产唇膏的结果使得苏丹红的阴影蔓延到了化妆品领域。因此，苏丹红已经成为人类健康的一个潜在危险，对它的认识、研究和检测是非常必要，而且刻不容缓的(王继臣和杨继远，苏丹红的毒性及检测，商丘职业技术学院学报，2008,7(2):97-99)。目前，对苏丹红的检测方法主要是高效液相色谱分析法。将含有苏丹红成分的待测物经乙腈提取后，以波长可变的紫外可见光度检测器检测，可以定性定量地对食品中的苏丹红含量进行测定。2005年3月29日，国家质量监督检验检疫总局和国家标准委联合发布《食品中苏丹红染料的检测方法一高效液相色谱法》(国家标准(GB/T19681-2005))，用于我国的各食品用品中苏丹红的检测。另外，还有薄层色谱-紫外可见分光光度法(庞艳玲和王怀友，薄层色谱-紫外可见分光光度法测定食品中的苏丹红I号，分析实验室，2008，27(1):60-62)。色谱分析法确实能准确地定量分析出食品中的苏丹红残留，且灵敏度较高，但是其仪器成本高，实验样品处理步骤繁琐，费时费力，不利于大批量的样品检测。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有样品操作便捷、成本低廉、反应快速、灵敏度高、特异性强等特点，能更好地运用于苏丹红和对位红添加剂量的快速检测。
发明内容本发明的目的在于提供一种可以单独或者同时定性和定量检测苏丹红I和对位红及其含量的单克隆抗体的制备方法。本发明的另一目的在于提供该单克隆抗体在作为检测苏丹红I和对位红残留的用途。本发明利用苏丹红I和对位红在结构上的部分相似性，采用苏丹红衍生物即羧基苏丹红作为半抗原与常规蛋白载体偶联得到相应的免疫抗原和包被抗原，制备出可以同时识别苏丹红I和对位红的单克隆抗体，并建立定性和定量检测苏丹红I和对位红及其含量的酶联免疫间接竞争测定法。首先，本发明提供一种苏丹红衍生物与常规蛋白载体偶联得到的免疫抗原和包被抗原(即检测抗原)免疫抗原由羧基苏丹红分别与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)反应，再与牛血清蛋白(BSA)偶联的复合物。包被抗原(即检测抗原)由羧基苏丹红分别与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)反应，再与卵清白蛋白(OVA)偶联的复合物。蛋白载体除了与BSA、OVA偶联外，还可以与人血清的蛋白(HAS)和钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)等偶联。本发明用到的一株杂交瘤细胞株SU-211-10，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCCNO:C200813，是骨髓瘤细胞SP2/0与产生抗羧基苏丹红抗体的Balb/C小鼠B淋巴细胞融合后筛选获得的细胞株，所述的B淋巴细胞来自于上述羧基苏丹红-BSA免疫的Balb/C小鼠。本发明所述的单克隆抗体是由上述杂交瘤细胞株SU-211-10(CCTCCNO:C200813)产生的，对苏丹红I和对位红具有特异性结合的特点，属于IgGl类抗体，最高抗体效价达到6.4X105。所述的单克隆抗体是将杂交瘤细胞株SU-211-10(CCTCCNO:C200813)接种Balb/C小鼠腹腔后，从产生的腹水中纯化获得的免疫球蛋白。本发明的提供一种基于上述方法制备的抗原及其单克隆抗体特性适用于定性和定量检测苏丹红I和对位红及其含量的酶联免疫测定(ELISA)方法。本发明所述的一种检测苏丹红I和对位红及其含量的方法，优先为间接竞争ELISA方法，样品中的苏丹红I和对位红可以与包被抗原(羧基苏丹红-OVA)对有限量的抗体发生竞争性结合，根据其吸光度的数值可以从标准曲线上推算出样品中苏丹红I和对位红的含量。该方法的灵敏度可以达到苏丹红I的ICso值为0.8ug/L、对位红的IC5o值为4.0ug/L。图1是羧基苏丹红-BSA抗原紫外吸收光谱；图2是羧基苏丹红-OVA抗原紫外吸收光谱；图3是单抗腹水与苏丹红I标准品竞争ELISA曲线，腹水稀释50000倍；图4是单抗腹水与对位红标准品竞争ELISA曲线，腹水稀释100000倍；具体实施例方式本发明人对苏丹红I和对位红的结构进行了分析，拟利用苏丹红衍生物即羧基苏丹红在结构上与苏丹红I和对位红存在的部分相似性，以此作为半抗原与常规蛋白载体BSA偶联得到相应的免疫抗原(羧基苏丹红-BSA)，免疫Balb/C小鼠，将其脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得了能分泌抗羧基苏丹红抗体的杂交瘤细胞株SU-211-10(CCTCCNO:C200813),再将该细胞株接种Balb/C小鼠腹腔后，从产生的腹水中经辛酸-饱和硫酸铵方法纯化获得免疫球蛋白IgGl。用羧基苏丹红偶联蛋白载体OVA获得的羧基苏丹红-OVA作为包被抗原，包被于聚乙烯酶标板，用一定量的上述单克隆抗体与苏丹红I或对位红进行间接竞争ELISA反应。实验结果显示，间接竞争ELISA反应在检测苏丹红I或对位红时其灵敏度分别为间接竞争ELISA反应在检测苏丹红I或对位红时其ICso值分别为苏丹红I号0.8ug/L、对位红4.0ug/L。与苏丹红II、III、IV号的交叉反应率为1.24%~2.12%，与其他同类食品添加剂的交叉反应率均小于0.2%。下面结合具体实施例对本
发明内容作进一歩说明，但不以任何形式限制本发明。材料(1)试剂羧基苏丹红购于广州创伟生物科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、聚乙二醇PEG4000、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购于美国SIGMA公司；HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤、胸腺嘧啶核苷)、新生小牛血清为美国GIBCO公司产品；RPMI-1640干粉剂为美国Invitrogen公司产品；邻苯二胺(OPD，购自上海华美公司)；二甲基亚砜为美国Amersham-Phamacia公司产品；胰蛋白酶为Difco进口分装产品。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二环己基碳二亚胺(DCC)和其他常规试剂均为国产分析纯。(2)实验器材和设备96孔细胞培养板(NUNC，USA)，酶标板(COSTAR，USA),二氧化碳培养箱(SANYO,JAPAN),光学显微镜(OLYMPUSBH-2，JAPAN)、倒置相差显微镜(OLYMPUS,JAPAN)、酶标仪(PowerWaveXS，美国Bio-Tek公司，)-30°。和-80°(:冰箱(SANYO,JAPAN)、高速离心机(日本HITACHI20PR-52D)、恒温振荡器(太仓市医疗械厂，TH2-95型)、台式离心机(上海市离心机械研究所，TL5.0型)、超净工作台(上海上净净化设备有限公司)等。(3)实验动物Balb/C小鼠，46周龄雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。(4)其他细胞培养和ELISA实验和试剂配制按照常规实验方法进行，主要参考材料为《当代免疫学技术与应用》(巴德年，1998，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社)、《现代免疫学实验技术(第2版)》(沈关心、周汝麟主编，2002，湖北科学技术出版社)等。实施例l:抗原的合成羧基苏丹红分子结构式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>100-mL烧杯中加入140mg羧基苏丹红溶于3mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，边搅拌边加入103.2mg二环己基碳二亚胺(DCC)和75mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌过夜。次日离心除去沉淀，取上清液备用。另取100-mL烧杯，加入5mL0.1mol/LPBS(pH7.2)、340mgBSA，置于磁力搅拌器上搅拌，加入0.5mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)至BSA溶解，然后边搅拌边缓慢滴加入上述上清液，将烧杯口密封，4'C下搅拌反应4h。离心后除去沉淀，将上清液装入透析膜于4'C下用生理盐水透析3天，每天换液2次，以去除未反应的DMF、DCC、NHS和羧基苏丹红小分子化合物。最后得到羧基苏丹红-BSA抗原溶液，小瓶分装，冻干后保存于-2(TC冰箱中，供免疫用。将上述牛血清白蛋白(BSA)换成卵清白蛋白(OVA)即得到羧基苏丹红-OVA偶联物。抗原鉴定(1)肉眼观察羧基苏丹红-BSA抗原、羧基苏丹红-OVA抗原外观为红色；(2)利用紫外吸收光谱扫描鉴定抗原为我们所需要的抗原。实施例2:单克隆抗体的制备(1)动物免疫将10只雌性Balb/C小鼠分化2组，免疫组为5只，阴性对照组为5只。羧基苏丹红I-BSA免疫抗原用生理盐水稀释，每次小鼠的免疫剂量为50ug/只。免疫程序采用2次基础免疫以及3次加强免疫，每次免疫间隔时间为15天。第一次基础免疫用福氏完全佐剂乳化抗原进行免疫，采用小鼠颈背部皮下多点注射；第二次基础免疫和以后两次加强免疫用福氏不完全佐剂乳化抗原，采用小鼠颈背部皮下多点注射或腹腔内注射；最后一次加强免疫用不加佐剂的抗原，釆用小鼠尾静脉或腹腔内注射。每次加强免疫后第5天，小鼠尾部静脉采血，分离得血清，采用抗原包被的间接ELISA法检测血清的抗体效价。制备单克隆抗体的小鼠是选择最后一次免疫后，取抗体效价最高的Balb/C小鼠。(2)细胞融合以及杂交瘤细胞的筛选饲养细胞的制备在细胞融合当天，取Balb/C小鼠颈椎脱臼法处死，70%酒精浸泡后，用眼科剪刀剪开小鼠腹部皮肤，在腹腔内注射10ml的1640培养液，反复抽吸数次后，吸回所有的液体，放入离心管内，3000rpm离心10min，细胞沉淀用HAT-1640完全培养液悬浮，混匀后加入96孔培养板100ul/孔。脾脏细胞的获得免疫小鼠以颈椎脱臼法处死，70%酒精浸泡后，将小鼠放于纸上，右侧卧左侧向上，用镊子提取小鼠的腹壁，用眼科剪刀围绕脾脏外面作一个"U"形切口，用镊子提起脾脏，剪断脾血管和结缔组织，分离脾脏放入培养皿中，加少量冷Gey液，用镊子轻轻刮挤脾脏，让脾细胞释放出来(或用组织研磨器研磨成脾细胞悬液)，取上清液于试管中，调整细胞浓度为107/ml(每只脾脏约加35mlGey液)，4'C冰箱备用。融合细胞的制备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0提前复苏，在实验当天细胞处于对数生长期。将SP2/0细胞与上述获得的免疫小鼠脾脏细胞以细胞数1:5的比例在50ml离心管中混匀，1000卬m离心10min，弃上清液，将离心管置于37。C水浴锅中保温，边摇晃边缓慢滴加37'C预热的5(mPEG-1640培养液lml，在lmin内完成，继续摇晃30sec，静置lmin。然后边摇晃边缓慢滴加37。C预热的1640基础培养液10ml，在5min左右加完。轻轻混匀，最后缓慢加入30ml的1640基础培养液，1000卬m离心10min，弃上清液，于37。C水浴锅中保温5min。加入HAT-1640完全培养液悬浮细胞，接种入上述加有饲养细胞的96孔细胞培养板100ul/孔，然后放置37'C、5%0)2培养箱中培养。杂交瘤细胞的筛选按照上述方法制备好饲养细胞，加入96孔培养板100u1/孔。取出融合细胞培养板，将存活下来的杂交瘤细胞从培养孔中轻轻吹打并吸出，计数后用1640完全培养液稀释至5、10、50个细胞/ml，分别接种入上述加有饲养细胞的96孔细胞培养板100ul/孔，使培养孔中的杂交瘤细胞数平均每孔分别为0.5、1、5个细胞/孔，然后放置37。C、5%0)2培养箱中培养。每天观察细胞的生长情况，待细胞长满培养孔的1/2时，取上清液进行间接ELISA方法测定，检测是否产生抗体及其效价和特异性。从抗体阳性的培养孔中，选择抗体效价高、特异性强、且细胞状态良好的细胞孔，继续进行再克隆，获得单克隆抗体分泌细胞株，大量培养后，分装小管冻存于液氮中。(3)腹水诱生和抗体纯化腹水的诱生取Balb/C小鼠数只，在接种杂交瘤细胞前10天左右，每只小鼠腹腔内注射0.5ml灭菌液体石蜡油。同时将单克隆抗体分泌细胞株置于细胞培养瓶中培养至对数期，1000rpm离心10min，取沉淀用1640基础培养基重悬，调整细胞数为1Xl()6个细胞/ml，在上述小鼠腹腔内接种0.5ml的杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显肿大后，用酒精棉球消毒腹部皮肤，用5ml注射器抽取腹水，将腹水4t、1000rpm离心10min，取上清，分装后-3(TC保存备用。抗体的纯化取10ml上述制备的腹水，加入20ml0.06mol/L醋酸缓冲液，用lmol/LNaOH调pH至4.8，室温下边搅拌边逐滴加入330ul辛酸，继续搅拌30min，然后4。C下静置2h。然后溶液4。C下，1000rpm离心30min，弃沉淀，在上清液中加入3ml0.1MPBS(pH7.4)，混匀后，用lmol/LNaOH调pH至7.2。在4'C下，在溶液中边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵27ml，使硫酸铵的最终饱和度为45%，继续搅拌30min，然后4'C静置lh以上。8000rpm离心30min，弃上清，沉淀重悬于3ml0.01M，PBS(pH7.4)中，然后置于0.01MPBS中透析，4。C透析2天，其间换水4次以上。透析过的溶液，8000rpm离心30min，除去不溶性沉渣，分装小管lml/管后-8(TC冻存备用。实施例3:单克隆抗体的鉴定——间接ELISA方法(1)最佳抗原包被浓度和抗体最适稀释倍数(工作浓度)的确定采用间接ELISA检测方法的棋盘滴定试验进行，以吸光度值(OD)约为1.0左右的点为参照点，综合考虑抗原浓度和抗体稀释倍数等因素，最后确定最佳抗原包被浓度和抗体最适稀释倍数(即工作浓度)。间接ELISA检测方法的操作程序取96孔酶标板，每孔加入用包被缓冲液稀释的包被浓度的包被抗原羧基苏丹红-OVA100ul，4'C包被过夜后，用洗涤液0.05y。PBST洗板3次，每孔加入封阻液300ul，37。C封阻lh，取出洗板3次，每孔加入稀释的苏丹红腹水100ul，37'C反应lh，洗板5次后，加入二抗(兔抗鼠酶标抗体，1:5000稀释)，37X:反应lh。洗板5次后，每孔加入底物显色液100ul，37'C避光显色20min。最后加入终止液50ul终止反应，用酶标仪测OD值(490nm)。操作步骤在96孔酶标板上的第一列包被8ug/孔的包被原，第二至第六列依次包被4、2、1、0.5、0.25ug/孔的包被原，4。C过夜。次日，用洗涤液0.05%PBST洗涤3次，5%脱脂乳封闭液37°(:封闭lh，洗涤2次，拍干。在酶标板的第一行至第八行依次加入100u1稀释倍数为1,000、2,000、4,000、8,000、16,000、32,000、64,000、128,000的苏丹红腹水溶液，37'C孵育lh，洗涤5次，拍干。各孔加入100yl兔抗鼠酶标二抗，37'C孵育lh，洗涤5次，拍干。各孔加入100ul底物显色液，避光显色15min，加入50ul终止液，用酶标仪在490nm波长处测定光密度值。结果见表l。表1最佳抗原包被浓度和抗体最适工作浓度的滴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果说明OD值在l.O左右的抗原包被量为4lig/孔、2ug/孔；苏丹红腹水最适稀释倍数范围在32,000128,000倍。(2)HRP标记兔抗鼠酶标二抗最佳稀释倍数(工作浓度)的确定以实施例3的步骤(1)确定的抗原包被浓度和苏丹红腹水浓度为参照，并以商品HRP标记兔抗鼠抗体推荐的工作浓度为参照，设计稀释倍数为2,500、5,000、10,000三个水平进行试验。操作步骤在96孔酶标板上从第1列到第6列包被抗原，包被量依次间隔为4wg/孔、2ug/孔，4'C过夜。次日洗板3次，用5%脱脂乳封闭液37。C封闭lh，洗涤2次，拍干。在酶标板的第一行至第八行依次加入100u1稀释倍数为40，000、60,000、80,000、100，000的苏丹红腹水溶液(每个稀释度设两个复孔)，37'C孵育lh，洗涤5次，拍干。按设计表加入不同稀释倍数的HRP标记兔抗鼠酶标二抗，每孔100yl，37t:孵育lh，洗漆5次，拍干。各孔加入100u1底物显色液，避光显色15min，加入50y1终止液，用酶标仪在490nm波长处测定光密度值。结果见表2。表2HRP标记兔抗鼠羊酶标二抗最佳工作浓度试验测定结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果说明OD值在1.0左右的最佳HRP标记兔抗鼠抗酶标二抗稀释倍数为5000倍；最佳包被浓度为2"g/L，苏丹红腹水最佳稀释倍数为60,000100,000倍。实施例4:苏丹红I和对位红间接竞争ELISA检测方法的建立从酶标二抗的最适工作浓度、包被原的包被浓度、抗体的工作浓度及工作量、竞争反应时间等方面确定了ELISA最佳反应条件，建立了苏丹红I和对位红间接竞争ELISA方法。(1)苏丹红I竞争ELISA检测方法苏丹红I标准品间接竞争ELISA的程序与间接ELISA程序大部分相同，不同之处是在封阻并且洗板3次后，将苏丹红腹水原液稀释50,000倍，苏丹红I标准品稀释到0ug/L，0.01ug/L，0.03ug/L，0.1ug/L，0.3ug/L，0.9ug/L六个浓度梯度。在一个孔中加入50ul苏丹红腹水稀释液和50ul苏丹红I标准品稀释液，37。C温育lh。0.05%PBST洗5遍后，加入二抗(兔抗鼠酶标抗体，1:5000稀释)，37。C温育lh。0.05%PBST洗5遍，加底物显色液，充分显色后，加入终止液2MH2S0450ul/孔，酶标仪490nm波长读数。_表3苏丹红I标准品的酶标孔光密度值测定结果_苏丹红I标准品竞争ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)对位红竞争ELISA检测方法对位红标准品间接竞争ELISA的程序与苏丹红I间接竞争ELISA程序类似，不同之处是将苏丹红腹水原液稀释100,000倍，对位红标准品稀释到Oug/L，0.1ug/L，0.3ug/L，0.9ug/L，2.7ug/L，8.1ug/L六个浓度梯度。在一个孔中加入50ul苏丹红腹水稀释液和50ul对位红标准品稀释液，其余步骤均一致。表4对位红标准品的酶标孔光密度值测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.4470.4430.4230.3650.2620.203OD平均值0.4380.4320.4180.3740.2600.202(3)单抗腹水的特异性鉴定选择苏丹红II、III、IV号和四种常用添加剂(克伦特罗、孔雀石绿、结晶紫、胭脂红)，进行交叉反应试验。计算ICsc值和交叉反应率。结果见表5。ICso值为各标准品最大信号值降低50%所对应的待测物浓度。交叉反应率(CR%)=苏丹红I的ICso值/测试物质的ICso值X100%。表5单抗腹水与不同待测物的ICso值和交叉反应率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于以苏丹红衍生物与牛血清白蛋白交联的复合物作为免疫抗原，将免疫抗原免疫Balb/C小鼠，将小鼠的致敏脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合制备杂交瘤细胞，经间接ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体，其中，间接ELISA筛选中使用的包被抗原是指苏丹红衍生物与卵清白蛋白交联的复合物，苏丹红衍生物为羧基苏丹红。2.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于免疫抗原是由羧基苏丹红分别与N-羟基琥珀酰亚胺NHS和N,N-二环己基碳二亚胺DCC反应，再与牛血清蛋白偶联的复合物。3.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包被抗原是由羧基苏丹红分别与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)反应，再与卵清白蛋白偶联的复合物。4.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于杂交瘤细胞株SU-211-10，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCCNO:C200813。5.如权利要求1所述的单克隆抗体采用间接竞争ELISA检测法检测苏丹红I残留的应用。6.如权利要求1所述的单克隆抗体采用间接竞争ELISA检测法检测对位红残留的应用。7.如权利要求1所述的单克隆抗体采用间接竞争ELISA检测法同时检测苏丹红I和对位红残留的应用。全文摘要本发明涉及一种单克隆抗体的制备及其用途，具体说涉及一种适用于同时检测苏丹红I和对位红残留的单克隆抗体的制备及其用途，属于免疫化学分析
技术领域：
。本发明以苏丹红衍生物与牛血清白蛋白交联的复合物作为免疫抗原，将免疫抗原免疫Balb/C小鼠，将小鼠的致敏脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合制备杂交瘤细胞，经间接ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。本发明的提供一种基于上述方法制备的抗原及其单克隆抗体特性适用于定性和定量检测苏丹红I和对位红及其含量的酶联免疫测定(ELISA)方法。文档编号G01N33/531GK101393218SQ20081020146公开日2009年3月25日申请日期2008年10月21日优先权日2008年10月21日发明者恺李,冰杜,磊汪,群王,旻钱,韩红辉,顾虹洁申请人:华东师范大学