专利名称：来自gagp17和p24保守区域的HIV肽以及它们在例如疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于HIV gag p17和p24的保守区域的新肽，包含至少一种所述肽的游离形式或载体结合形式的抗原，包含至少一种抗原的疫苗组合物，应用这些抗原的免疫测定试剂盒和检测人类免疫缺陷病毒(HIV)或HIV特异肽诱导的抗体的方法。
背景控制HIV感染的全球流行是迫切的需要，而且开发HIV疫苗是艾滋病研究的主要目的之一。大体上来说，疫苗应能够激活抗原提呈细胞，克服T细胞应答的遗传限制，并且产生记忆性T细胞和B细胞。病毒群体的变异性给获得有效的HIV疫苗提出更大的困难。迄今为止，试图开发艾滋病疫苗的过程中还没有重大突破报道。现在普遍认为，抗原特异的体液免疫和细胞介导的免疫的诱导是开发有效的预防和治疗性疫苗的关键。免疫系统的三种武器，包括中和抗体、CD8+CTL和T辅助细胞-1(TH1)，对于HIV的保护性免疫可能是必需的。已知，CTL能清除其它病毒感染(Ada，Immunol.Cell Biol.，72447-454，1994)，并能在细胞产生和释放病毒子代之前裂解感染早期的靶标，Ada等，同上。研究焦点集中在抗原的选择与不同佐剂的设计和评价。用于体外和体内不同研究的抗原包括了所有从粗蛋白质到来源于几种HIV蛋白质的多种人工合成肽。已经对gp120 V3环做了大量的研究。已经观察到B细胞和T细胞免疫应答的诱导，然而有体外研究报道，来源于gp41保守区的肽表明感染的增强(Bell S.J.等，Clin.Exp.Immunol.，87(1)37-45，January 1992)。
由于病毒固有的通过改变表达在感染细胞表面的抗原决定部位而获得的逃逸能力，候选疫苗中天然产生的HIV序列不能刺激稳定的免疫应答。实际上当那些重要的氨基酸隐藏起来的时候，免疫系统错误地认为特定氨基酸序列是有关的。
最近的一项针对gag p24抗体滴度的研究表明，向艾滋病发展的慢性过程与抗体的高滴度相关，而向艾滋病发展的急性过程与抗体的低滴度相关。已表明p24抗体滴度低的人比p24抗体滴度高的人更快地发展成艾滋病(Zwart G..等Virology，201，p.285-93，June 1994)，提示gag和(特别是)p24可能在控制艾滋病发展过程中扮演关键角色。
在WO91/13360中描述了新的HIV p24肽，其中这些肽用于鉴定诊断为HIV阳性的血清样本的真伪。
Johnson R.P.等，The Journal of Immunology，vol.147，p.1512-1521，No.5，September 1，描述了在三个HIV血清阳性个体中gag特异CTL应答的特异性分析，发现此gag特异CTL应答是由HLA-I类分子限制的CD3+CD8+淋巴细胞介导的。GoulderP.J.R.等，Journal of Virology，Vol.74，p.5679-5690，No 12，June2000研究了不同人群中的HIV p17和p24的不同部分的CTL应答。研究发现存在某些免疫显性区域，然而氨基酸组成上较小的差异就能导致应答的较大不同。
EP-A-0 356 007公开了抗原决定簇，尤其是它涉及与HIV-1中蛋白质相关的合成多肽序列，并且这些合成多肽序列能用作抗艾滋病的潜在疫苗的基础。
Rosenberg E.S.等，Science，Vol.278，21 November 1997，p.1447-1450描述了在一些慢性病毒感染中，病毒特异性的CD4+T辅助淋巴细胞是维持有效免疫性的关键，但是在慢性人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染中不能检测到其特征。对p24的HIV-1特异的增生性反应与病毒载量呈负相关。他们得出结论，HIV-1特异的辅助细胞在免疫治疗干预和疫苗开发中可能是重要的。
F.Hoffmann-La Roche和Co.Aktiengesellschaft名下的EP 0 230 222、EP 0 270 114、DE 3 711 016和GB 2 118 639都是关于重组表达和纯化HTLVIII Gag/Env基因的蛋白质或融合蛋白质的。这些天然序列组成的蛋白质能纯化为均一的蛋白质，而且作为检测针对与艾滋病相关病毒的抗体的诊断试验的基础。gag/env蛋白质也可配制成疫苗，从而通过预防免疫接种来抵抗艾滋病。
从诊断和治疗的角度看，使用p24作为试验或治疗的制剂成分其主要问题与p24的大量抗原决定部位有关，这些抗原决定部位刺激产生大量特异性差的抗体，这些特异性差的抗体可通过重复刺激潜在的突变序列能产生自身抗体(HIV感染中α/βT细胞受体的自身抗体(Autoantibodies to the alfa/beta T-cellreceptors in HIV infection)；dysregulation and mimicry.Lake D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(23)10849-53，Nov.8 1994)。进而报道了p24抗体滴度不能达到与包膜蛋白(gp120和gp41)同样高的水平。通常情况下p24抗体是在感染十分早期阶段产生的，但是在开始感染后抗体滴度非常迅速地稳定下来。之后，p24滴度逐渐降低，此时gP160的滴度反而升高。最近关于天然产生的HIV-1 gag突变体拮抗细胞毒性T细胞活性的报道也支持了这一发现(Klenerman P.等，Nature，2369(6479)，p.355，2 June 1994)。这可能是p24滴度迅速稳定下来以及之后又开始下降的原因之一。
基于以上的背景数据，我们决定研究设计能模拟p17和p24表位却不拮抗细胞毒性T细胞活性的新合成肽的可能性，其目的是满足有效的预防和治疗疫苗的需要。
Korber B.等，Human Retroviruses and AIDS 1999Eds.Theoretical Biology and Biophysics Group，Los AlamosNational Laboratory，Los Alamos，NM公布了p17的序列，该序列可以作为开发能引发CTL和抗体应答的肽的可能模板。这些鉴别出来的氨基酸序列位于第33位和第53位氨基酸之间，参考表1
表1氨基酸序号 氨基酸序列 天然产生的氨基酸33 H34 I L V M35 I V36 W37 A38 S N R39 R S40 E41 L M42 E D K G Q43 R K G N44 F S Y45 A T S46 V L I C47 N D S48 P R S T49 G S A D N Q50 L F51 L M52 E G D53 T S A说明书中代表序列中氨基酸的单字母和三字母密码与国际标准及参考书中给出的一致，如Lehninger A.L.，《(Principles ofBiochemistry》，Worth Publishers Inc.，New York，1982.第二列右侧给出的氨基酸代表序列的天然变异。氨基酸修饰引起的抗原决定部位电荷变化涉及到免疫原性的显著提高，氨基酸修饰包含从原来的螺旋结构到折叠结构的可能的构象改变，以一种不同的方式向免疫系统暴露出抗原决定部位以求达到更大的反应程度。
为了进一步增加T细胞表位的数量和减少gag蛋白的免疫逃逸突变，来源于p24的另外三段肽序列是基于下列三段序列133-158，178-199，233-251残基。这些序列分别发表于HumanRetroviruses and AIDS 1999，A Compilation and Analysis ofNucleic Acid and Amino Acid Sequences.Eds.Theoretical Biologyand Biophysics Group，Los Alamos National Laboratory，LosAlamos。参见表2-4表2氨基酸序号 氨基酸序列 在每个位置上天然产生的氨基酸133 P134 IV L135 VM A I136 QS T V137 ND T138 IA L M139 QE K G140 G141 QI142 MP A143 VI A T R144 H145 QH146 AS V N P147 IL M V148 ST149 PA150 R
151 T152 L S153 N F154 A155 W156 V157 K158 V A C表3氨基酸序号 氨基酸序列 在每个位置上天然产生的氨基酸178G179A180TA IV L181PS182QH G T S Y183D184LI V185NY186TM L A187M188L189NS T190TI V A191VI192G193GD194H195Q
196A G197A198M L199Q E H表4氨基酸序号 氨基酸序列 在每个位置上天然产生的氨基酸233G234SA235D236I237A238G239TA S240TS241ST242TN S243LP V Q244QA H245E246QH247IL V M248GA Q T N R H I249W250MT251TS为确定对HIV-1特异而敏感的独特序列，已经合成几种修饰的肽。
发明描述根据本发明的肽来源于上面提到的HIV-1 gag蛋白p17和p24的四个不同的保守区域，它们保持了HIV-1表位的独特性。而且，本发明的新肽有至少一种潜在的CTL表位并且还没发现具有细胞毒性T细胞(CTL)拮抗作用。
根据本发明，满足上述标准的肽选自下面几组序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Gln Leu Gln Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21(SEQ ID NO1)其中链上的氨基酸具有以下意义肽衍生物的第1位Xaa是His，Lys或Arg，第2位Xaa是Ile，Leu，Val或Met，第3位Xaa是Ile或Val，第4位Xaa是Trp或Tyr，第5位Xaa是Ala或Leu，第6位Xaa是Ser，Thr，Arg或Asn，第7位Xaa是Arg或Ser第11位Xaa是Arg，Lys，Gly或Asn，第12位Xaa是Phe，Ser或Tyr，第13位Xaa是Ala，Thr或Ser，第14位Xaa是Val，Leu，Ile或Cys，第15位Xaa是Asn，Asp或Ser，第16位Xaa是Pro，Arg或Ser，第17位Xaa是Gly，Ser，Ala，Asp或Asn，第18位Xaa是Leu或Phe，第19位Xaa是Leu或Met，第20位Xaa是Glu，Gly，Asp或Ile，
第21位Xaa是Thr，Ser或Ala，这个肽包含SEQ ID NO1的至少6个连续的氨基酸。
Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7GlyXaa9LeuVal-ZTyrXaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21AlaXaa23Xaa24Xaa25Xaa26(SEQ ID NO4)其中链上的氨基酸具有以下意义第1位Xaa是Pro，Tyr或Phe，第2位Xaa是Ile，Val或Leu，第3位Xaa是Ile，Ala，Val，Met或Leu，第4位Xaa是Gln，Ser，Thr或Val，第5位Xaa是Asn，Asp或Thr，第6位Xaa是Ile，Ala，Leu或Met，第7位Xaa是Gln，Glu，Lys或Gly，第9位Xaa是Gln或Ile，第13位Xaa省略，第14位Xaa是Ala，Ser，Asn，Val或Pro，第15位Xaa是Ile，Leu，Met或Val，第16位Xaa是Ser或Thr，第17位Xaa是Pro或Ala，第18位Xaa是Arg或Lys，第19位Xaa是Thr或Ser第20位Xaa是Leu或Ser，第21位Xaa是Asn，Phe或Val，第23位Xaa是Trp，Tyr，Gly或无第24位Xaa是Val，Leu，Gly或无第25位Xaa是Lys，Arg，Gly或无第26位Xaa是Val，Ala，Cys，Gly或无SEQ ID NO4的序列包含至少6个连续的氨基酸，-Z-是可选的，并且为PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n(n＝1，2或3)。
Xaa1AlaXaa3Xaa4Xaa5AlaXaa7Xaa8Xaa9LeuLeuXaa12Xaa13Xaa14-Z-Xaa15Xaa16HisGlnXaa19AlaXaa21Xaa22(SEQ ID NO9)其中第1位Xaa是Tyr，Trp，Phe或Gly第3位Xaa是Thr，Ala，Val，Ile或Leu第4位Xaa是Pro或Ser，第5位Xaa是Gln，His，Gly，Thr，Ser或Tyr第7位Xaa是Leu，Ile或Val第8位Xaa是Asn或Tyr第9位Xaa是Thr，Met，Leu或Ala第12位Xaa是Ser，Thr或Asn第13位Xaa是Thr，Ile，Val或Ala第14位Xaa是Val或Ile第15位Xaa是Gly或无第16位Xaa是Gly或无第19位Xaa是Ala或Gly第21位Xaa是Met，Leu，Cys或无第22位Xaa是Gln，Glu，His，Gly或无其中SEQ ID NO9的序列包含至少6个连续的氨基酸，连接子-Z-是可选的，并且为PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n(n＝1，2或3)。
Xaa1Xaa2AlaLeuAlaGlyXaa7Xaa8Xaa9LeuXaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21(SEQ ID NO15)其中第1位Xaa是Trp或Tyr第2位Xaa是Ser或Ala第7位Xaa是Thr，Ala或Ser第8位Xaa是Ser或Thr第9位Xaa是Ser或Thr
第11位Xaa是Leu，Pro，Val或Gln第12位Xaa是Gln，Ala或His第13位Xaa是Glu或Gly第14位Xaa是Gln或His第15位Xaa是Ile，Leu，Val或Met第16位Xaa是Gly，Ala，Gln，Thr，Asn，Arg，His或Ile第17位Xaa是Trp或Tyr第18位Xaa是Thr，Met，Leu或Ile第19位Xaa是Thr或Ser第20位Xaa是Cys，Gly或无第21位Xaa是Gly或无其中SEQ ID NO15的序列由至少6个连续的氨基酸组成，序列的末端可以是游离的羧基或氨基、酰氨基、酰基、乙酰基或者是它们的盐。两个或更多的Cys残基可以形成链间二硫键的一部分，即-S-(CH2)p-S-或-(CH2)p-桥(p＝1-8)其间可选地插入一个或更多的杂原子(如O，N或S)；和/或上述肽序列固定于固体支持物上。
此新的肽序列有适合作为良好抗原的潜能，其中该抗原包含至少一种选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO9或SEQID NO15的肽。抗原性可以通过调整肽的大小或不同肽的比例或浓度来改变，方法为例如二聚体化或多聚体化和/或固定于固相。根据本发明，抗原包含二个或更多的多肽序列，这些多肽或者通过桥联结，例如链间的Cys残基的二硫桥或C1-C8亚烷基之类的桥(此亚烷基上可能插入一个或多个杂原子如O、S或N)，或者优选的它们并不连接。肽链以单体、二聚体或寡聚体形式固定于固相上。可以把更多的氨基酸加到末端形成便于固定的“臂”。
PEG是聚乙二醇(HO(CH2CH2O)mH)，它可以是连接子-Z-的部分，连接前PEG可选地被二羧酸修饰(HO(CH2CH2O)mCO(CH2)oCOOH)或被末端羧基修饰(HO(CH2CH2O)m-1CH2COOH)，其中m＝1-10和o＝2-6。
连接子-Z-可能由PEG、修饰的PEG或它们的组合和/或一个或多个组合的Gly残基组成。或者，连接子-Z-可能由Gly桥[Gly]n(n＝1，2或3)组成。
尽管优选天然出现的L型，本发明的多肽中所有氨基酸可以是D型或L型。
肽序列的C端和N端可以通过对末端-NH2基团和/或-COOH基团的修饰而偏离其天然序列，例如它们可以酰基化、乙酰化、酰胺化或为载体或其它分子提供结合位点而被修饰。
本发明的肽至少由6个氨基酸组成，优选的包含10个至30个氨基酸。它们包括所有在确定位点上的氨基酸的天然变异体。
本发明的多肽抗原是游离的或与载体结合的形式。多肽可选择地结合的载体或固相物质可以在多种已知的载体中选择。载体的选择应该根据固定多肽是用作诊断抗原还是疫苗中的免疫组分而定。
用于例如诊断的载体的例子有磁珠或共聚物乳胶，例如苯乙烯二乙烯苯、羟基化的苯乙烯二乙烯苯、聚苯乙烯、羧基化的聚苯乙烯、炭黑珠、未活化的或聚苯乙烯或聚氯乙烯活化的玻璃、环氧活化的多孔磁性玻璃、明胶或多糖颗粒或其他蛋白质颗粒、血红细胞、单克隆或多克隆抗体或这些抗体的Fab段。
按照本发明的实施方案，本发明中抗原可形成疫苗的一部分，该疫苗可能结合于载体、佐剂或其他免疫刺激成分，如携带env基因的金丝雀痘病毒。用于疫苗目的的载体和/或佐剂的例子有其他蛋白质，如人或牛血清白蛋白，匙孔血蓝蛋白和脂肪酸。免疫刺激物可分为三组佐剂、抗原载体和运载载体(vehicle)。佐剂的例子包括氢氧化铝(aluminum hydroxyd)、铝盐、皂甙、胞壁酰二肽和三肽、单磷酰脂A、棕榈酸、B.pertussis和包括Th1细胞因子IL-12和IL-1在内的多种细胞因子。一些蛋白质毒素可用来运载过客蛋白质(passenger protein)穿越细胞膜进入胞质溶胶，这些蛋白质毒素可用于开发CTL疫苗。载体包括细菌类毒素，如灭活的破伤风毒素和霍乱毒素、遗传脱毒的细菌毒素如大肠杆菌的不耐热肠毒素、脂肪酸、活载体如脊髓灰质炎嵌合体(poliochimeras)和形成颗粒的杂交蛋白(如酵母反转座子杂交TY颗粒和HBcAg颗粒)。现代疫苗中常用的运载载体组分由矿物油乳剂、弗氏完全佐剂和不完全佐剂、植物油乳剂、非离子嵌段共聚物表面活性剂、角鲨烯或角鲨烷、脂肽、脂质体和生物降解微球体组成。两种最新的具有开发新疫苗的潜在意义的佐剂，包括水包油微乳剂(MF59)和多聚微粒。可以使用任何能够增强抗原免疫性的物质，并且美国或欧洲药典中给出了一些可供选择的载体或佐剂的替代物。
用作免疫刺激的抗原的合适制剂中还可以包含干扰素如IFN-γ、抗病毒趋化因子或造血生长因子如粒细胞巨噬细胞生长(集落刺激)因子。
另一种增加抗原刺激和吸收的方法(例如在肠道内)是用本发明的肽与二肽、三肽或四肽等小肽共同使用。这些小肽可以添加方式施用或与本发明的肽结合在一起施用。这些肽更优选的是与YGG三肽一起施用，可以由D型或L型氨基酸组成，最好是D型。
近期，非肠胃外传送疫苗的方法(例如粘膜途径)包括基因融合技术以制造粘膜佐剂的无毒性衍生物、删除必需基因的基因灭活抗原、在调节控制粘膜免疫应答中重要的特异的细胞因子和抗原的共表达、能在宿主细胞允许DNA或RNA吸收和其内源性表达的遗传物质。
维持持久的免疫应答(其中细胞介导的免疫是必需的)的一种方法是接种编码一种或多种特异抗原的质粒DNA。
为了抵抗HIV感染，疫苗应该既诱导粘膜免疫应答也诱导系统免疫应答，而且能以方便的途径施用，肠胃外途径或非肠胃外途径，例如用皮下途径、皮内途径、静脉内途径、肌内途径、口服、粘膜途径或鼻内途径等。
根据本发明的疫苗的优选实施方案中，疫苗含有包含至少一种选自SEQ ID NO1、4、9和15的肽的抗原，更优选的是不同的肽都以等量存在。
更优选的实施方案中，疫苗组分包含下列抗原RLIYATRQLQRFAVNPGLLIT-NH2(SEQ ID NO3)FILQNIEGQLVGGGYAISPRTLVAGGGG(SEQ ID NO6)YAIPQALNTLLNTVGGHQAA-NH2(SEQ ID NO11)和WSALAGTTSLLQGQLGWIT-NH2(SEQ ID NO14)这些序列提供CTL表位并能够激活细胞免疫系统。对CTL表位框架内的氨基酸进行改变以增强结合力。为了便于肽的合成和/或增加肽的可溶性改变了其他的氨基酸。
在体液样本中，使用这里的抗原测定HIV-1或HIV-1特异多肽或蛋白质诱导的抗体的检测方法是本发明的另一个实施方案。本发明还包含进行这种测定的免疫测定试剂盒与同上述抗原选择性反应的抗体。肽制备的描述本发明的肽可以用已知的制备线性氨基酸序列的方法制备，例如，重组DNA技术。将编码本发明的肽或上述肽的多聚体的核酸序列导入一个表达载体。合适的表达载体是例如，质粒、粘粒、病毒和YAC(酵母人工染色体)，他们包含必需的复制和表达控制区域。表达载体在宿主细胞可以被激活表达。合适的宿主细胞是如细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞。这些技术已为大家所熟知并在Sambrook等Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，1989.一书中有描述。其它熟知的方法是降解法或合成法，例如，在液相或优选的固相(树脂)上把一个氨基酸残基与另一个氨基酸残基偶联，例如被称为Merrifield合成的技术。参见如Barany和Merrifield，the Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.2，E.Gross and Meinhofer，Ed.(Acad.Press，N.Y.，1980)，Kneib Coronier和Mullen Int.J.Peptide Protein Res.，30，p.705-739(1987)以及Fields和Noble Int.J.Peptide Protein Res.，35，p.161-214(1990)。
倘若要得到连接或环化的肽，须在适当的线性氨基酸序列合成时，对氨基酸序列进行化学氧化以使两段肽序列上的两个半胱氨酸残基环化或连接。参见Akaji等，TetrahedronLetter，33，8，p.1073-1076，1992。合成过程的一般描述下述实施例中给出的所有的肽衍生物都是用Milligen 9050Peptide Synthesizer在标准程序下合成的。所用树脂为Tenta Gel PRAM(RAPP POLYMERE GmbH，Tübingen)，理论载量0.20meq/g。合成终产物在真空中干燥过夜。然后在作为清除剂的乙二硫醇(5％)和水(5％)存在下，用90％三氟乙酸溶液从树脂上解离产物(室温下1.5小时)。然后过滤树脂并用100％三氟乙酸(2×20ml)洗涤滤器中的树脂。真空蒸干混合滤液(室温下水浴)，残留物质用乙醚(200ml)和滤掉的沉淀产物研磨。立即向滤器中加入冰乙酸(100ml)溶解固体物质，再加入1.5L 20％乙酸的甲醇溶液处理直到微弱的棕色为止。接着加入乙酸盐形式1×8离子交换Dowex(15g)(Bio-Rad，Richmond，CA)并过滤混合物。滤液蒸干，残留物从乙酸中冰冻干燥。产物在填充Kromasil100-5C8(EKA Nobel，Surte，Sweden)的柱上于合适的系统(含有乙氰的0.1％三氟乙酸水溶液)下用反向液相色谱纯化。从柱上收集下来的样品经过装有Kromasil100-5 C8 Column(EKANobel，Surte，Sweden)的分析用高效液相色谱(HPLC)(BeckmanSystem Gold，USA)分析。收集含纯化物质的组分，蒸干溶液，产物从乙酸冰冻干燥。终产物最后用HPLC分析并且用氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来确定肽的结构。
在合成过程中使用的氨基酸都是L-氨基酸，而且它们都用芴基甲氧基羰基保护α-氨基官能团。侧链的保护如下Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，Thr(tBu)。
括号中的缩略语分别指Trt＝三苯基甲基t-Bu＝叔丁基OtBu＝叔丁基酯氨基酸衍生物由瑞士公司Bachem AG提供按照生产商建议的实验方案制备磁性颗粒反应物。所使用的Dynabeads由Dynal AS公司生产。试剂1为覆盖有配基的磁性颗粒。本发明的肽与活化的磁性颗粒表面共价结合。肽也可以通过物理吸附的方法与磁性颗粒表面结合。在试剂1中，颗粒物的浓度范围在1mg/ml至15mg/ml之间。颗粒大小在0.2μm-15μm之间。肽浓度范围在0.01毫克每毫克颗粒至1毫克每毫克颗粒之间。
按照Dako AS公司建议的实验方案制备抗人Ig碱性磷酸酶(Ap)结合的抗体试剂。该方案是本领域的标准程序。将该试剂称为试剂2。
按照Fluka AG公司建议的试验方案制备底物酚酞—单磷酸盐(phenolphtalein-monophosphate)溶液，该方案是本领域的标准程序，将该底物溶液称为试剂3。
所用的洗涤和孵育缓冲液是标准的0.05M Tris-碱缓冲液与以下化合物的混合吐温20(0.01％至0.1％)、甘油(0.1％至10％)和氯化钠(0.2％至0.1％)本实验过程包括孵育步骤，其中在每一孔中加入1滴试剂1与2滴洗脱缓冲液。混合后加入30μl的样品，孵育5分钟。用磁体捕获磁性颗粒，在磁体移去之前弃去液体成分。在与试剂2孵育之前，用4滴洗涤液将孔洗涤2次。加入1滴试剂2和2滴洗涤缓冲液，孵育5分钟。
用磁体捕获磁性颗粒，并在磁体被分离之前弃去液体。试剂3孵育前，进行重复洗涤的步骤。然后在每一小孔中加入2滴试剂3，孵育3分钟。在白色背景下读取结果。阳性结果是红色(深红色代表3+)，而阴性结果与阴性对照相似是清晰的淡黄色/棕色。
免疫测定试剂盒能用于检查由HIV病毒或HIV特异肽或蛋白质(例如本发明的肽)诱导的抗体。
实施例18治疗或预防性疫苗为了预防人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的感染，本发明的至少一种选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO9和SEQ ID NO15的多肽能用于形成抗原并作为预防或治疗性疫苗的主要活性成分。此种疫苗可以包含有益于保护或刺激宿主(人或脊椎动物)免疫系统的化合物，例如白细胞介素、干扰素、粒细胞-巨噬细胞生长因子、造血生长因子或类似物。优选的是，疫苗组合物包含一种佐剂或运载载体；更优选的是，佐剂或运载载体为可能与铝结合的单磷酰脂A(MPL)、弗氏完全或不完全佐剂或氢氧化铝。佐剂或运载载体的最优量取决于选择的运载载体或佐剂的类型。
为了形成脂肽疫苗，可在本发明肽的C端加上单脂肪酸(如单棕榈酰基链)进行修饰。进而，脂肽通过冻融法导入脂质体膜，导致在脂质体表面形成肽配体。
肽或疫苗制剂可在贮存前冷冻干燥。冻干的肽可在无菌水中溶解达到最终浓度0.1-100mg/ml。疫苗优选按一次或多次给药剂量单位分装于安瓿瓶中，低温贮存，以备使用。本发明肽的一般剂量单位为每千克体重0.05μg-1mg，优选的是每千克体重0.15μg-0.15mg。本领域技术人员认为适合的剂量取决于患者的体重、疾病的类型、状况的严重性、给药的途径和一些其他因素。当用作治疗性疫苗时，一般最初注射约12次。可进一步强化治疗，在极端的病例中患者需要终生给药。在注射液的制备中，肽溶于无菌水并使每种肽的终浓度为1mg/ml。常规的注射体积是100μl--200μl(2×100μl)。优选的是，肽与适合的佐剂和/或粒细胞巨噬细胞生长因子共同使用，例如0.1-1mg/ml的浓度范围的Leucomax《Shering Plough》，或按制造商的建议使用。特别优选的是在2000年3月2日申请的国际专利申请号为PCT/NO00/00075和/或共同未决的挪威专利申请号为20004412中描述的肽与本专利提供的肽联合治疗。这些肽可以顺序给药或同时给药。适宜的给药途径有皮内途径、皮下途径、静脉内途径、口服途径、肌内途径、鼻内途径、粘膜途径或其他适合的途径。为了维持保护力，可能需要加强免疫。对于本领域中技术人员来讲，可以理解，本发明的疫苗组合物不仅在感染的预防中有作用，而且在感染的治疗中也有作用。
按每千克体重100μg剂量在小鼠体内注射发现本发明的肽无毒性效应。
上面的实施例仅是本发明的说明。在不背离本专利权利要求书所述的概念和范围内，本领域技术人员可以修饰上述肽、抗原和疫苗。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Bionor Immuno AS(B)街道Strmdalsjordet 4，P.O.Box 1893 Gulset(C)城市3703 Skien(E)国家挪威(F)邮政编码(ZIP)N-3705(G)电话+47 35 50 57 50(H)电传+47 35 50 57 01(i)发明人(A)姓名Birger Srensen(B)街道Meierlia 3(C)城市3727 Skien(D)国家挪威(ii)发明题目来自gag p17和p24保守区域的HIV肽以及它们在例如疫苗中的应用。(iii)序列数目17(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统Windows 2000(D)软件Word 7.0(v)目前申请日申请号(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(v)片段类型内部的(ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝＂位置1的Xaa是His，Lys或Argix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注释＝＂位置2的Xaa是Ile，Leu，Val或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注释＝＂位置3的Xaa是Ile或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注释＝＂位置4的Xaa是Trp或Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝＂位置5的Xaa是Ala或Leuix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置6(D)其它信息/注释＝＂位置6的Xaa是Ser，Thr，Arg或Asnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝＂位置7的Xaa是Arg或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注释＝＂位置11的Xaa是Arg，Lys，Gly，或Asnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释＝＂位置12的Xaa是Phe，Ser或Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点
(B)位置13(D)其它信息/注释＝＂位置13的Xaa是Ala，Thr或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注释＝＂位置14的Xaa是Val，Leu，Ile或Cysix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝＂位置15的Xaa是Asn，Ser或Aspix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝＂位置16的Xaa是Pro，Arg或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17(D)其它信息/注释＝＂位置17的Xaa是Gly，Ser，Ala，Asp或Asnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注释＝＂位置18的Xaa是Leu或Pheix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝＂位置19的Xaa是Leu或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝＂位置20的Xaa是Glu，Gly，Asp或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝＂位置21的Xaa是Thr，Ser或Ala(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Gln Leu Gln Xaa11Xaa12Xaa1Xaa14Xaa15Xaa161 5 10 15Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa2120(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO2His Leu Ile Tyr Leu Thr Arg Gln Leu Gln Arg Phe Ala Leu Asn Pro Gly Leu Leu Ile Thr1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO3Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Arg Gln Leu Gln Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Ile Thr1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度25氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝＂位置1的Xaa是Pro，Tyr或Phe(ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2(D)其它信息/注释＝＂位置2的Xaa是Ile，Val或Leu(ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注释＝＂位置3的Xaa是Ile，Leu，Val，Ala或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注释＝＂位置4的Xaa是Gln，Ser，Thr或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝＂位置5的Xaa是Asn，Asp或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置6(D)其它信息/注释＝＂位置6的Xaa是Ile，Ala，Leu或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝＂位置7的Xaa是Gln，Glu，Lys或Glyix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置9(D)其它信息/注释＝＂位置9的Xaa是Gln或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置13(D)其它信息/注释＝＂位置13的Xaa是去除的ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注释＝＂位置14的Xaa是Ala，Ser，Asn，Val或Proix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝＂位置15的Xaa是Ile，Leu，Met或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝＂位置16的Xaa是Ser或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17(D)其它信息/注释＝＂位置17的Xaa是Pro或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注释＝＂位置18的Xaa是Arg或Lysix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝＂位置19的Xaa是Thr或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝＂位置20的Xaa是Leu或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝＂位置21的Xaa是Asn，Phe或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置23(D)其它信息/注释＝＂位置23的Xaa是Trp，Tyr，Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置24(D)其它信息/注释＝＂位置24的Xaa是Val，Leu，Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置25(D)其它信息/注释＝＂位置25的Xaa是Lys，Arg，Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点
(B)位置26(D)其它信息/注释＝＂位置26的Xaa是Val，Ala，Cys，Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11..12(D)其它信息/注释＝＂选择性插入的连接子-Z-，其为PEG，修饰的PEG和/或[Gly]n，其中n＝1，2或3(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Gly Xaa9Leu Val-Z-Tyr Xaa14Xaa15Xaa161 5 1015Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Ala Xaa23Xaa24Xaa25Xaa2620(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度28氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO5Tyr Ile Leu Gln Asn Ile Glu Gly Gln Leu Val Gly Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu15 10 15 20Val Ala Tyr Leu Arg Gly-NH225(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度28氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO6Phe Ile Leu Gln Asn Ile Glu Gly Gln Leu Val Gly Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu1 5 10 15 20Val Ala Gly Gly Gly Gly-OH25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度26氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，天然p24序列(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Ile Val Gln Asn Ile Glu Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala15 10 15 20Trp Val Lys Val25(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度25氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO8Phe Ile Leu Gln Asn Ile Gln Gly Gln Leu Val Gly Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu1 5 10 15 20Val Ala Gly25(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝＂位置1的Xaa是Tyr，Trp，Phe或Glyix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置3(D)其它信息/注释＝＂位置3的Xaa是Thr，Ala，Val，Ile或Leuix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置4(D)其它信息/注释＝＂位置4的Xaa是Pro或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置5(D)其它信息/注释＝＂位置5的Xaa是Gln，His，Gly，Thr，Ser或Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝＂位置7的Xaa是Leu，Ile或Valix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置8(D)其它信息/注释＝＂位置8的Xaa是Asn或Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置9(D)其它信息/注释＝＂位置9的Xaa是Thr，Met，Leu或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释＝＂位置1 2的Xaa是Ser，Thr或Asnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置13(D)其它信息/注释＝＂位置13的Xaa是Thr，Ile，Val或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注释＝＂位置14的Xaa是Val或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝＂位置15的Xaa是Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝＂位置16的Xaa是Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝＂位置19的Xaa是Ala或Glyix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝＂位置21的Xaa是Met，Leu，Cys或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置22(D)其它信息/注释＝＂位置22的Xaa是Gln，Glu，His，Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14..15(D)其它信息/注释＝＂选择性插入的连接子-Z-，其是PEG，修饰的PEG和/或[Gly]n，其中n＝1，2或3ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝＂位置21的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO9Xaa1Ala Xaa3Xaa4Xaa5Ala Xaa7Xaa8Xaa9Leu Leu Xaa12Xaa13Xaa14-Z-Xaa151 5 10 15Xaa16His Gln Xaa19Ala Xaa21Xaa2220(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，天然p24序列(xi)序列描述SEQ ID NO10Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度20氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO11Tyr Ala Ile Pro Gln Ala Leu Asn Thr Leu Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置23(D)其它信息/注释＝＂位置23的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO12Phe Ala Ile Pro Gln Ala Leu Asn Thr Leu Leu Asn Thr Val Gly Gly Gly Gly His Gln Ala1 5 10 15 20Ala Cys Gly2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，天然p24序列(xi)序列描述SEQ ID NO13Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr15 10 15(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无(xi)序列描述SEQ ID NO14Trp Ser Ala Leu Ala Gly Thr Thr Ser Leu Leu Gln Gly Gln Leu Gly Trp Ile Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置1(D)其它信息/注释＝＂位置1的Xaa是Trp，Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置2
(D)其它信息/注释＝＂位置2的Xaa是Ser或Alaix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置7(D)其它信息/注释＝＂位置7的Xaa是Thr，Ala或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置8(D)其它信息/注释＝＂位置8的Xaa是Ser或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置9(D)其它信息/注释＝＂位置9的Xaa是Ser或Thrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置11(D)其它信息/注释＝＂位置11的Xaa是Leu，Pro，Val或Glnix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置12(D)其它信息/注释＝＂位置12的Xaa是Gln，Ala或Hisix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置13(D)其它信息/注释＝＂位置13的Xaa是Gly或Gluix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置14(D)其它信息/注释＝＂位置14的Xaa是Gln或Hisix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置15(D)其它信息/注释＝＂位置15的Xaa是Ile，Leu，Val或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置16(D)其它信息/注释＝＂位置16的Xaa是Gly，Ala，Gln，Thr，Asn，Arg，His或Ileix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置17
(D)其它信息/注释＝＂位置17的Xaa是Trp ot Tyrix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置18(D)其它信息/注释＝＂位置18的Xaa是Thr，Ile，Leu或Metix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置19(D)其它信息/注释＝＂位置19的Xaa是Thr或Serix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝＂位置20的Xaa是Cys，Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置21(D)其它信息/注释＝＂位置21的Xaa是Gly或无ix)特征(A)名称/关键词修饰位点(B)位置20(D)其它信息/注释＝＂位置20的Cys可以形成二硫键的一部分(xi)序列描述SEQ ID NO15Xaa1Xaa2Ala Leu Ala Gly Xaa7Xaa8Xaa9Leu Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa1515 1015Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21202)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度21氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，天然p17序列(xi)序列描述SEQ ID NO16His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr15 10 15 202)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两者(ii)分子类型肽(iii)假定的无，天然p24序列(xi)序列描述SEQ ID NO17Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp15 10 15 20
权利要求
1.一种肽，其特征在于它包含至少一种选自下列氨基酸序列的氨基酸序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Gln Leu Gln Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21(SEQ ID NO1)其中链上的氨基酸具有以下意义肽衍生物的第1位Xaa是His，Lys或Arg，第2位Xaa是Ile，Leu，Val或Met，第3位Xaa是Ile或Val，第4位Xaa是Trp或Tyr，第5位Xaa是Ala或Leu，第6位Xaa是Ser，Thr，Arg或Asn，第7位Xaa是Arg或Ser第11位Xaa是Arg，Lys，Gly或Asn，第12位Xaa是Phe，Ser或Tyr，第13位Xaa是Ala，Thr或Ser，第14位Xaa是Val，Leu，Ile或Cys，第15位Xaa是Asn，Asp或Ser，第16位Xaa是Pro，Arg或Ser，第17位Xaa是Gly，Ser，Ala，Asp或Asn，第18位Xaa是Leu或Phe，第19位Xaa是Leu或Met，第20位Xaa是Glu，Gly，Asp或Ile，第21位Xaa是Thr，Ser或Ala肽包含SEQ ID NO1的至少6个连续的氨基酸，Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7GlyXaa9LeuVal-Z -TyrXaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21AlaXaa23Xaa24Xaa25Xaa26(SEQ ID NO4)其中链上的氨基酸具有以下意义第1位Xaa是Pro，Tyr或Phe，第2位Xaa是Ile，Val或Leu，第3位Xaa是Ile，Ala，Val，Met或Leu，第4位Xaa是Gln，Ser，Thr或Val，第5位Xaa是Asn，Asp或Thr，第6位Xaa是Ile，Ala，Leu或Met，第7位Xaa是Gln，Glu，Lys或Gly，第9位Xaa是Gln或Ile，第13位Xaa省略，第14位Xaa是Ala，Ser，Asn，Val或Pro，第15位Xaa是Ile，Leu，Met或Val，第16位Xaa是Ser或Thr，第17位Xaa是Pro或Ala，第18位Xaa是Arg或Lys，第19位Xaa是Thr或Ser第20位Xaa是Leu或Ser，第21位Xaa是Asn，Phe或Val，第23位Xaa是Trp，Tyr，Gly或无第24位Xaa是Val，Leu，Gly或无第25位Xaa是Lys，Arg，Gly或无第26位Xaa是Val，Ala，Cys，Gly或无其中SEQ ID NO4包含至少6个连续的氨基酸，-Z-是可选的，并且为PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n，其中n＝1，2或3，Xaa1AlaXaa3Xaa4Xaa5AlaXaa7Xaa8Xaa9LeuLeuXaa12Xaa13Xaa14-Z-Xaa15Xaa16HisGlnXaa19AlaXaa21Xaa22(SEQ ID NO9)其中第1位Xaa是Tyr，Trp，Phe或Gly第3位Xaa是Thr，Ala，Val，Ile或Leu第4位Xaa是Pro或Ser，第5位Xaa是Gln，His，Gly，Thr，Ser或Tyr第7位Xaa是Leu，Ile或Val第8位Xaa是Asn或Tyr第9位Xaa是Thr，Met，Leu或Ala第12位Xaa是Ser，Thr或Asn第13位Xaa是Thr，Ile，Val或Ala第14位Xaa是Val或Ile第15位Xaa是Gly或无第16位Xaa是Gly或无第19位Xaa是Ala或Gly第20位Xaa是Ala第21位Xaa是Met，Leu，Cys或无第22位Xaa是Gln，Glu，His，Gly或无其中SEQ ID NO9的序列由至少6个连续的氨基酸组成，连接子-Z-是可选的，并且为PEG、修饰的PEG和/或[Gly]n，其中n＝1，2或3，Xaa1Xaa2AlaLeuAlaGlyXaa7Xaa8Xaa9LeuXaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21(SEQ ID NO15)其中第1位Xaa是Trp或Tyr第2位Xaa是Ser或Ala第7位Xaa是Thr，Ala或Ser第8位Xaa是Ser或Thr第9位Xaa是Ser或Thr第11位Xaa是Leu，Pro，Val或Gln第12位Xaa是Gln，Ala或His第13位Xaa是Glu或Gly第14位Xaa是Gln或His第15位Xaa是Ile，Leu，Val或Met第16位Xaa是Gly，Ala，Gln，Thr，Asn，Arg，His或Ile第17位Xaa是Trp或Tyr第18位Xaa是Thr，Met，Leu或Ile第19位Xaa是Thr或Ser第20位Xaa是Cys，Gly或无第21位Xaa是Gly或无其中SEQ ID NO15的序列由至少6个连续的氨基酸组成，序列的末端可以是游离的羧基或氨基、酰氨基、酰基、乙酰基或者是它们的盐，两个或更多的Cys残基可以形成链间二硫键的一部分，即-S-(CH2)p-S-或-(CH2)p-桥，其中p＝1-8，其间可任选地插入一个或更多的杂原子如O，N和S，和/或上述肽序列是固定于固体支持物上的。
2.根据权利要求1的肽，其特征在于SEQ ID NO1的氨基酸序列选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
3.根据权利要求1的肽，其特征在于SEQ ID NO4的氨基酸序列选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO8。
4.根据权利要求1的肽，其特征在于SEQ ID NO9的氨基酸序列选自SEQ ID NO11和SEQ ID NO12。
5.根据权利要求1的肽，其特征在于SEQ ID NO15的氨基酸序列是SEQ ID NO14。
6.抗原，其特征在于它包含至少一种根据权利要求1的肽。
7.根据权利要求6的抗原，其特征在于它包含至少一种选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO9和SEQ ID NO15中至少一组的肽。
8.疫苗组合物，其特征在于它包含根据权利要求6的抗原和制药上可接受的稀释剂，可选地也可包含佐剂、载体和/或运载载体和附加的免疫刺激化合物。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其特征在于它包含至少一种选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO4、SEQ ID NO9和SEQ IDNO15的肽。
10.根据权利要求8的疫苗组合物，其特征在于它包含SEQ IDNO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11和SEQ ID NO14的肽。
11.根据权利要求8-10的疫苗组合物，其特征在于肽溶于无菌水溶液，并且可选的免疫刺激化合物是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
12.根据权利要求8-11的疫苗组合物，其特征在于此组合物包含选自单磷酰脂A(MPL)、弗氏完全或不完全佐剂或氢氧化铝的一种佐剂。
13.疫苗组合物，其特征在于根据权利要求6的抗原是以脂肽和/或脂质体制剂配制的。
14.检测体液样本中由HIV或HIV特异肽或蛋白质诱导的抗体的方法，其特征在于对上述样本进行免疫测定，其中抗原选自权利要求1、2、3、4和5中的肽。
15.用于检测体液样本中由HIV或HIV特异肽或蛋白质诱导的抗体的免疫测定试剂盒，其特征在于诊断抗原是前面权利要求1-5中任何一项的肽。
16.抗体，其特征在于它能选择性地与权利要求6和7的抗原发生反应。
全文摘要
本发明包含新的和经过修饰的肽，它们能够诱导HIV－1特异性免疫应答而且不拮抗细胞毒性T细胞的活性，其目的是得到一种针对HIV的有效的预防和治疗疫苗。这些肽基于HIV gagp17和p24的保守区域。本发明还阐述了包含至少一种所述的肽的游离形式或载体结合形式的抗原，包含至少一种抗原的疫苗组合物，以及应用这些抗原的免疫测定试剂盒和检测HIV或HIV特异肽诱导的抗体的方法。
文档编号G01N33/569GK1460111SQ01815742
公开日2003年12月3日 申请日期2001年9月3日 优先权日2000年9月4日
发明者B·索伦森 申请人:比奥诺尔免疫有限公司