专利名称：邓老凉茶颗粒指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种广东凉茶的质量控制方法，具体涉及邓老凉茶颗粒高效液相色谱法指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。
背景技术：
广东凉茶是岭南人民根据本地的气候和水土特性，在长期预防疾病与保健过程中以中医养生理论为指导，以中草药为基础，研制总结出来的具有清热解毒、生津止渴等功效的一类植物饮料。邓老凉茶是著名的广东凉茶之一，由金银花、菊花、白茅根、桑叶、蒲公英和甘草6味药材组成，具有清热解毒、祛湿生津、凉血排毒等功效，用于风热感冒、咽喉肿痛等症。现已有邓老凉茶含糖颗粒、无糖颗粒、罐装饮料、蜜炼膏、草本含片等剂型上市。目前国内还没有文献报道对邓老凉茶质量控制的研究。中药指纹图谱技术是一种表征中药所含成分与其质量关系的有效手段，已成为国内外广泛认可的重要质量评价模式。因此，建立邓老凉茶制剂的标准指纹图谱，能从整体上全面反映制剂的内在质量，为其质量控制提供一种提供直观、简便、有效的手段。

发明内容
本发明的目的在于为邓老凉茶颗粒的质量控制和真伪鉴别提供一种新的方法，通过建立邓老凉茶颗粒指纹图谱的方法，并由此方法得到邓老凉茶制剂的标准指纹图谱。为达到本发明的目的所采用的技术方案用高效液相色谱法建立邓老凉茶颗粒指纹图谱的方法，具体包括如下步骤(1)对照品溶液的制备A.绿原酸对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，用甲醇配制成每Iml 含绿原酸0. 2 0. 5mg的溶液；B.新绿原酸对照品溶液的制备精密称取新绿原酸对照品适量，用甲醇配制成每 Iml含新绿原酸0. 2 0. 5mg的溶液；C.异绿原酸A对照品溶液的制备精密称取异绿原酸A对照品适量，用甲醇配制成每Iml含异绿原酸A 0. 2 0. 5mg的溶液；D.异绿原酸B对照品溶液的制备精密称取异绿原酸B对照品适量，用甲醇配制成每Iml含异绿原酸B 0. 2 0. 5mg的溶液；E.混合对照品溶液的制备分别吸取1. OOmL绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B对照品溶液，组成混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备精密称取邓老凉茶颗粒0. 5 20g，50% 100%甲醇提取，采用索氏提取或超声提取或微波辅助萃取或加速溶剂萃取方法进行提取，提取时间为 10 150min，提取液浓缩定容至10 50mL，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A 为0. 1 3%磷酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱时间为20 180min，柱温20 50°C，流速0. 3 1. OmL/min,紫外检测波长240 262nm ；(4)测定精密吸取供试品溶液0. 5 10 μ 1注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。(5)相似度评价供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004Α 版》进行评价，在240 检测波长下的相似度均大于0. 80。本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施( 供试品溶液的制备称取邓老凉茶颗粒5. Og，用滤纸包好，置索氏提取器中，精密加入甲醇150mL，索氏提取1. ，提取液旋转蒸馏浓缩至10mL，转移至25mL的容量瓶中，甲醇加至刻度，摇勻，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。( 色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0. 5%的磷酸溶液，流动相B为乙腈，洗脱时间为20min，柱温25°C，流速 0. 5mL/min,紫外检测波长254nm ；在步骤(3)中，所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行流动相A为0. 5%的磷酸溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序如下O分钟时，流动相A为95 %、流动相B为5 % ；3分钟时，流动相A为95 %、流动相B为5 % ；9分钟时，流动相A为80 %、流动相B为20 % ；13分钟时，流动相A为80%、流动相B为20% ；20分钟时，流动相A为5 %、流动相B为95 %。按照本发明所提供指纹图谱的建立方法所得邓老凉茶颗粒的指纹图谱中有16个特征共有峰，其中3号色谱峰最强，为绿原酸参照峰，4号色谱峰为新绿原酸参照峰，13号峰位异绿原酸A参照峰，14号色谱峰为异绿原酸B参照峰，图谱总长为20min，其中单峰面积超总峰面积1 %的峰有16个，它们是1 16号峰；单峰面积超总峰面积5%的有6个，它们是2号峰、3号峰、4号峰、12号峰、13号峰、14号峰；单峰面积超总峰面积10%的有4个，它们是3号峰、4号峰、12号峰、14号峰。具体如下1号峰，平均保留时间RT为2. 26min, RSD为0. 41%，峰面积为34. 2495mAU*s为 4. 00%。2 号峰，平均保留时间 RT 为 3. 23min, RSD 为 0. 60%，峰面积为 103. 8625mAU*s，RSD 为 1. 12%。3号峰为绿原酸，平均保留时间RT为7. 24min, RSD为0. 19 %，峰面积为 183. 5252mAU*s，RSD 为 20. 12%。4号峰为新绿原酸，平均保留时间RT为7. 71min, RSD为0. 15 %，峰面积为 111. 0776mAU*s，RSD 为 8. 60%。5 号峰，平均保留时间 RT 为 8. 56min，RSD 为 0. 02%，峰面积为 27. 6046mAU*s，RSD 为 13. 09%。6 号峰，平均保留时间 RT 为 9. 65min，RSD 为 0. 21%，峰面积为 39. 1353mAU*s，RSD 为 13. 57%。7 号峰，平均保留时间 RT 为 10. 95min, RSD 为 0. 08%，峰面积为 27. 0746mAU*s，RSD 为 11. 97%。8 号峰，平均保留时间 RT 为 11. 15min，RSD 为 0. 11 %，峰面积为 33. 6M6mAU*s，RSD
4为 5. 69%。9 号峰，平均保留时间 RT 为 11. 34min，RSD 为 0. 11%，峰面积为 43. 5254mAU*s，RSD 为 7. 21%。10号峰，平均保留时间RT为11. 47min, RSD为0. 11%，峰面积为47. 5335mAU*s， RSD 为 8. 57%。11号峰，平均保留时间RT为11. 67min, RSD为0. 14%，峰面积为47. 5072mAU*s， RSD 为 8. 56%。12 号峰，平均保留时间 RT 为 12. 18min，RSD 为 0. 17%，峰面积为 108. 6137mAU*s， RSD 为 8. 00%。13号峰为异绿原酸A，平均保留时间RT为12. 50min，RSD为0. 19 %，峰面积为 56. 1588mAU*s，RSD 为 11. 94% 014号峰为异绿原酸B，平均保留时间RT为13. 83min，RSD为0. 27 %，峰面积为 117. 6081mAU*s，RSD 为 13. 42%。15号峰，平均保留时间RT为16. 54min, RSD为0. 04%，峰面积为41. 5771mAU*s， RSD 为 12. 79%。16号峰，平均保留时间RT为17. 94min, RSD为0. 03%，峰面积为42. 4393mAU*s， RSD 为 6. 55%。本发明的原理是根据邓老凉茶颗粒中主要的活性成分是药材金银花、菊花、白茅根、桑叶、蒲公英和甘草的提取物，其指纹图谱能从色谱的整体面貌上把握邓老凉茶颗粒的质量，所说的邓老凉茶颗粒包括邓老凉茶含糖颗粒剂和无糖颗粒剂。本发明的有益效果如下(1)按本发明提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，能有效的表征邓老凉茶颗粒的质量，有利于全面监控产品的质量。(2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定一、二个化学成分而判定邓老凉茶颗粒整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现型好等优点。(4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明并没有限制。


图1、11批次邓老凉茶颗粒的叠加2、邓老凉茶颗粒的HPLC标准指纹图谱下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明并没有限制。
具体实施例方式实施例1.邓老凉茶无糖颗粒指纹图谱的检测
1仪器与试药1. 1仪器Agilent 1100高效液相色谱系统，ChemStation色谱工作站。1.2试剂绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B对照品；乙腈(色谱纯)、 甲醇(色谱纯)、二次重蒸水、磷酸(分析纯)。2.高效液相色谱2.1色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Poroshell 120SB_C18色谱柱，100X2. Imm, 2. 7 μ m)；流动相为0.5%磷酸㈧与乙腈⑶组成的梯度洗脱液，柱温 250C ；紫外检测波长为2Mnm ；流速0. 5ml/min ；分析时间20min。进样量供试品溶液与对照品溶液各1 μ 1。理论塔板数按绿原酸计算应不低于3000。梯度洗脱程序如下0分钟时，流动相A为95 %、流动相B为5 % ；3分钟时，流动相A为95 %、流动相B为5 % ；9分钟时，流动相A为80 %、流动相B为20 % ；13分钟时，流动相A为80%、流动相B为20% ；20分钟时，流动相A为5 %、流动相B为95 %。2.2对照品溶液的制备Α.绿原酸对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。B.新绿原酸对照品溶液的制备精密称取新绿原酸对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。C.异绿原酸A对照品溶液的制备精密称取异绿原酸A对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。D.异绿原酸B对照品溶液的制备精密称取异绿原酸B对照品5. Omg,甲醇溶解后转移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得。E.混合对照品溶液的制备分别吸取1. OOmL绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B对照品溶液，组成混合对照品溶液。2. 3供试品溶液的制备邓老凉茶颗粒供试品溶液的制备精密称取邓老颗粒5. 0g，用滤纸包好，置索氏提取器中，加入甲醇150mL，索氏提取1.证，提取液旋转蒸馏浓缩至10mL，转移至25mL的容量瓶中，甲醇加至刻度，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。2. 4测定精密吸取供试品溶液与对照品溶液各1 μ 1注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，所得指纹图谱与图2相似。实施例2.检测11批次邓老凉茶颗粒的标准指纹图谱取邓老凉茶颗粒11批次，按实施例1条件进行检测，得11批次样品的HPLC图谱， 如图1所示。通过11批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰指纹图谱中有16个特征共有峰，现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及占总峰面积汇总，具体如下1号峰，平均保留时间RT为2. 26min, RSD为0. 41%，峰面积为34. 2495mAU*s为 4. 00%,占总峰面积的3. 22%。2 号峰，平均保留时间 RT 为 3. 23min, RSD 为 0. 60%，峰面积为 103. 8625mAU*s，RSD为1. 12%，占总峰面积的9. 75%。3号峰为绿原酸，平均保留时间RT为7. 24min, RSD为0. 19 %，峰面积为 183. 5252mAU*s，RSD 为 20. 12%,占总峰面积的 17. 23%。4号峰为新绿原酸，平均保留时间RT为7. 71min, RSD为0. 15 %，峰面积为 111. 0776mAU*s，RSD % 8. 60%,占总峰面积的 10. 43%。5 号峰，平均保留时间 RT 为 8. 56min，RSD 为 0. 02%，峰面积为 27. 6046mAU*s，RSD 为13. 09%,占总峰面积的2. 59%。6 号峰，平均保留时间 RT 为 9. 65min，RSD 为 0. 21%，峰面积为 39. 1353mAU*s，RSD 为13. 57%,占总峰面积的3. 67%。7 号峰，平均保留时间 RT 为 10. 95min, RSD 为 0. 08%，峰面积为 27. 0746mAU*s，RSD 为11.97%，占总峰面积的2. 54%。8 号峰，平均保留时间 RT 为 11. 15min，RSD 为 0. 11 %，峰面积为 33. 6M6mAU*s，RSD % 5. 69%,占总峰面积的3. 16%。9 号峰，平均保留时间 RT 为 11. 34min，RSD 为 0. 11%，峰面积为 43. 5254mAU*s，RSD % 7. 21%,占总峰面积的4. 09% ο10号峰，平均保留时间RT为11. 47min, RSD为0. 11%，峰面积为47. 5335mAU*s， RSD % 8. 57%,占总峰面积的4. 46% ο11号峰，平均保留时间RT为11. 67min, RSD为0. 14%，峰面积为47. 5072mAU*s， RSD % 8. 56%,占总峰面积的4. 46% ο12 号峰，平均保留时间 RT 为 12. 18min，RSD 为 0. 17%，峰面积为 108. 6137mAU*s， RSD % 8. 00%,占总峰面积的10. 20%。13号峰为异绿原酸A，平均保留时间RT为12. 50min，RSD为0. 19 %，峰面积为 56. 1588mAU*s，RSD 为 11. 94%，占总峰面积的 5. 27%。14号峰为异绿原酸B，平均保留时间RT为13. 83min，RSD为0. 27 %，峰面积为 117. 608lmAU*s, RSD 为 13. 42%,占总峰面积的 11. 04%。15号峰，平均保留时间RT为16. 54min, RSD为0. 04%，峰面积为41. 5771mAU*s， RSD % 12. 79%,占总峰面积的3. 90%。16号峰，平均保留时间RT为17. 94min, RSD为0. 03%，峰面积为42. 4393mAU*s， RSD % 6. 55%,占总峰面积的3. 98%。所述指纹图谱中，邓老凉茶颗粒的指纹图谱中含有16个特征共有峰，其中3号色谱峰最强，为绿原酸参照峰，即S色谱峰，4号峰、13号峰、14号峰分别为新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B参照峰，图谱总长为20min，其中单峰面积超总峰面积1 %的峰有16个，它们是1 16号峰；单峰面积超总峰面积5%的有6个，它们是2号峰、3号峰、4号峰、12号峰、13号峰、14号峰；单峰面积超总峰面积10%的有4个，它们是3号峰、4号峰、12号峰、 14号峰。相似度评价采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见表1，11批次邓老凉茶颗粒的叠加图见附图1。表1 HPLC指纹图谱相似度评价
权利要求
1.一种邓老凉茶颗粒制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤(1)对照品溶液的制备精密配制绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B对照品溶液，浓度为0. 2 0. 5mg/mL ；(2)供试品溶液的制备精密称取邓老凉茶颗粒，50% 100%甲醇提取，提取液浓缩定容后，针孔式微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，梯度洗脱，柱温20 50°C，流速0.3 l.OmL/min，紫外检测；(4)测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；(5)相似度评价供试品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》 进行评价。
2.根据权利要求1所述的邓老凉茶颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(2)供试品溶液的制备，精密称取邓老凉茶颗粒0.5 20g，采用索氏提取或超声提取或微波辅助萃取或加速溶剂萃取方法进行提取，提取时间为10 150min，提取液浓缩定容至 10 50mL。
3.根据权利要求1所述的邓老凉茶颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(3)梯度洗脱的流动相为0.1 3%的磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱时间为20 180min，紫外检测波长为240 ^2nm。
4.如权利要求3所述的邓老凉茶颗粒制剂指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤(3) 色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下浓度配置进行O分钟时，流动相A为95%、流动相B为5% ； 3分钟时，流动相A为95%、流动相B为5% ； 9分钟时，流动相A为80%、流动相B为20% ； 13分钟时，流动相A为80%、流动相B为20% ； 20分钟时，流动相A为5 %、流动相B为95 %。
5.根据权利要求1所述的邓老凉茶颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于所述步骤(4)测定精密吸取供试品溶液0.5 20 μ 1注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
6.根据权利要求1所述的邓老凉茶颗粒指纹图谱的建立方法，其特征是在于所述步骤(5)相似度评价供试品指纹图谱在240 检测波长下的相似度均大于0.80。
7.根据权利要求1所述的邓老凉茶颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于测定所得的指纹图谱中有16个特征共有峰，其中3号、4号、13号、14号色谱峰分别为绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B参照峰，最强峰为3号色谱峰。
全文摘要
邓老凉茶颗粒指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，涉及中药制剂的质量控制方法，具体是建立HPLC标准指纹图谱以检测邓老凉茶颗粒质量的方法。方法包括(1)对照品溶液的配制；(2)供试品溶液的配制；(3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为0.1～3％磷酸与乙腈组成的梯度洗脱液；柱温20～50℃；紫外检测波长240～262nm；流速0.3～1.0mL/min；时间20～60min；(4)测定高效液相色谱法得指纹图谱。本发明的有益效果有效表征邓老凉茶颗粒的质量，有利于产品质量监控；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速准确地鉴别产品的真伪优劣。
文档编号G01N30/02GK102253135SQ201110098429
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者宋化灿, 张中强, 张翠仙, 李娜, 杨运云, 王冠华, 邓洁薇, 郭鹏然 申请人:中国广州分析测试中心