专利名称：皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒。
背景技术：
皮质醇，也可称为“可的松”，是肾上腺在应激反应里产生的一种类激素。也是最主要的糖皮质激素。它的含量占血中17-羟类固醇总量的4/5。人每日分泌量约为200mg，且此分泌呈明显的时辰节律变化。一般于午夜或清晨I点左右分泌最少，血浆含量最低，凌 晨4时分泌开始增加，至早6 8时分泌最多。8时以后逐渐分泌减少，下午5时左右分泌量较清晨最高值比下降50%或50%以上。半衰期为80 120分钟。分泌入血后，绝大部分与类固醇激素结合球蛋白(CBG)结合。血中游离皮质醇只占总皮质醇的1% 3%，但只有游离的才有生物学活性。通常游离与结合的皮质醇保持相对平衡。皮质醇通过糖异生途径，在抗炎反应以及稳定血压等方面起作用。皮质醇还通过细胞内受体影响许多生理系统，如免疫反应、血糖调节、血管紧张度调节、酶促反应、骨骼新陈代谢等，在当前临床医学和药物学的研究中，测定皮质醇的水平是一项重要的指标。病理学改变1.增高见于柯兴氏综合征、胰岛炎、妊娠中毒、甲状腺机能减退、肝病、哮喘病危象、高山病早期、意外的体温过低、男子女性化、某些精神病患者，不平衡性糖尿病。浓度升高但有节律性见于发热、剧烈疼痛。夜间不减少，且无昼夜节律，见于急性感染、中枢神经系统肿瘤及炎症，并有颅内压升高，肢端肥大症，癌症，充血性心力衰竭(特别是右侧心衰)、肝损伤、肾血管性高血压、垂体机能亢进。2.降低见于阿狄森(Addison)氏病，兼有原发性肾上腺皮质衰竭；垂体机能减退，合并继发性肾上腺皮质衰竭；肾小腺切除术后及严重感染的低血压症患者。由血中皮质醇测定，同时进行尿中17-0HCS的测定，可以引起出垂体-肾上腺皮质系统功能异常的诊断步骤。目前国际上对血清中皮质醇的检测方法主要分为色谱技术和免疫分析技术。色谱分析法包括气象色谱法、气质联用和液质联用法等，虽然色谱法具有灵敏度高、准确性和重复性好等优势，但需要昂贵的仪器设备，而且检测过程繁琐、样本前处理的技术要求很高，难于操作。检测人员需要具备专业的检测技能和丰富的实验经验。常用的免疫分析技术包括放射免疫分析法(Radioimmunoas say, RIA)、化学发光免疫分析法(Chemiluminescent immunoassay, CLIA)和酶联免疫分析法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)。放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)是一种应用放射性同位素的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合而成的体外微量分析方法。虽然该技术特异性较高，灵敏度也较高，但其局限性也很显著，主要有以下几点I)原料来源必须使用放射性核素，需要防护和防止污染。2)稳定性差放射性同位素易衰减，标记抗原有效使用时间短。3)难以实现操作和测量的自动化。[0011 ] 化学发光免疫分析法(Chemiluminescent immunoas say, CLIA)包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),常采用双抗体夹心法、竞争法、间接法等反应模式，化学发光系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光法虽具有高灵敏度、高准确度、高精密度、宽线性、反应快速，影响因素少，结果准确等优点，但化学发光法的缺点是仪器、试剂成本高。因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行皮质醇的检测
实用新型内容
本实用新型目的是皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案本实用新型一方面涉及一种皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由皮质醇抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯酶标板。本专利通过高效的偶联方法的得到稳定性好的皮质醇-3-肟-BSA，并通过免疫动物得到特异性高及亲和力强的抗皮质醇抗体，用来制备皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒。通过与RIA和CLIA试剂盒的比较，其灵敏度、精密度、准确性和试剂盒有效期等方面均优于放射免疫法，与CLIA试剂盒差异性不大，但由于其所需仪器及试剂费用低，更适用于基层试验室。同时由于ELISA试剂盒采用TMB作为显色底物，所以其试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，且实验操作较RIA试剂盒及质谱法简单、不需特殊防护、周期短，可以满足普通实验室的要求。

图I为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。I固相载体，2微孔,3包被层。
具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。如图I所示，本实用新型试剂盒的酶标板，其包括固相载体I和包被层3，固相载体I采用96孔聚苯乙烯酶标板。固相载体I上有多个微孔2，包被层3附着在固相载体上的微孔2上。包被层3是包括抗皮质醇抗体和牛血清白蛋白的复合层。皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒的研制[0024]本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中皮质醇的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使酶标板活化。在酶标板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的，形成待测标本中的皮质醇和生物素化的皮质醇竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。2、经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果a.标准曲线
权利要求1.皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由抗皮质醇抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。
2.根据权利要求I所述的皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是所述的多个微孔是指96个微孔。
3.根据权利要求I所述的皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征是所述的固相载体是聚苯乙烯酶标板。
专利摘要本实用新型公开了皮质醇酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述包被层是由抗皮质醇抗体和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相载体的微孔表面上形成的复合层。本实用新型的试剂盒操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。
文档编号G01N33/74GK202710571SQ20122005909
公开日2013年1月30日 申请日期2012年2月11日 优先权日2012年2月11日
发明者杨娟, 李华渊, 童晓玲, 从旭霞, 李庆, 何峰容 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司