专利名称：一种负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电化学发光免疫传感器及对hiv的检测方法
技术领域：
本发明涉及到艾滋病病毒(HIV)抗体的检测分析，其基本方法是基于一种负载量子点并且包被纳米金的介孔材料作为信号标签构建HIV免疫传感器，通过电致化学发光分析技术手段，建立对HIV抗体的高灵敏，高选择性的定量检测分析方法。
背景技术：
后天免疫缺乏综合症，又称艾滋病(AIDS)是由一种人类免疫缺陷病毒(HIV)所感染导致的。HIV的危害性大，传播范围广，目前没有特效药对艾滋病进行治疗，因此加强对HIV潜在的感染者以及艾滋病患者进行早期诊断和监测，以达到控制艾滋病流行的目的，是目前所有有关研究艾滋病治疗与预防工作的一个重要课题与追求的目标。目前临床诊断是否感染爱滋病毒，可以于抗体产生之后，经由酶联免疫吸附实验(ELISA)或是明胶颗粒凝集实验(PA)等检验法验出，感染至抗体产生的期间称作空窗期，平均约是2-8周，目前国际间的共识约是12周，这都是在艾滋病诊断领域所公知的。或是可以使用RT-PCR等方式检测血中是否带有病毒的RNA/DNA作为诊断，此方法的空窗期约7-14天，一般建议为28天，但是检测方法操作复杂，费用昂贵，也未能够在临床筛选检测中大规模的应用。当前对艾滋病毒的检测要求逐步提高，因此建立一种高灵敏，快速，前处理操作简单且干扰小的分析检测方法，为检测艾滋病毒成为一种迫切的需要。电致化学发光免疫分析基于此种需要逐渐被公众所接受。电致化学发光(Electrochemiluminescence, ECL)是在化学发光基础上发展起来的一种新的检测技术，通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或者电流，使发光物质受激发并跃迁回基态而发出光子，因此电化学发光具有电化学优良的选择性和化学发光的高灵敏度的优点。基于以上所述电致化学发光优良性质，构建电致化学发光免疫传感器，建立相关电致化学发光免疫分析方法应用到实际分析检测。介孔材料具有巨大的比表面积和孔容积，可控的孔径分布，易于表面改性修饰等优良性质在分离，化学催化，生物传感器，药物负载与缓释控方面得到了广泛的应用。文献Adv. Funct. Mater. ,21,1850-1862 (2011)，报道利用介孔氧化硅负载抗肿瘤药物到病变部位控制药物释放。文献Analyst，137. 608-613 (2012)，报道了用介孔氧化硅负载硫堇作为电子媒介体制备化学免疫传感器。量子点作为一种新型的电致化学发光源物质，其可控的粒子尺寸，窄的发射光谱与宽的激发光谱以及背景信号低的优点，被广泛的应用到构建生物免疫传感器，国内外已经有大量文献报道量子点的在生物成像，生物免疫分析方面的应用，但是针对基于介孔材料巨大的比表面积与孔容积负载大量的量子点制备高效率，信号方法的免疫传感器还未见报道。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种负载量子点并且包被纳米金的介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器，该传感器用于HIV抗体的检测。本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。本发明所要解决的问题是，传统的基于量子点构建的免疫传感器是通过将量子点固定于电极表面，通过层层组装的过程制备而成，基于信号降低的变化量，达到检测的目的；或者是将单分散的量子点标记在所需要的分析的物质表面，组装形成夹心免疫复合物，基于信号的增加的变化量，实现目标物质的分析。但是上述的两种方法均存在以下的缺陷，首先是基于信号下降法，其干扰大，基体物质复杂，极易覆盖在传感器表面引起电阻增大，导致电致化学发光信号减弱；后者基于电致化学发光信号增加的变化量能够克服物质的干扰问题，但是单分散的量子点标记的物质，其自身信号较低，难以做到超灵敏的检测。为解决上述问题，本发明采用如下机理介孔材料巨大的比表面积，孔容积以及易于改性修饰，通过在介孔材料表面修饰功能基团，将量子点固定在介孔材料中，即可大量提高量子点的标记量，在负载量子点的介孔材料表面通过正负电荷的作用包裹一层纳米金，实现信号放大的作用。根据上述的机理，本发明通过以下技术方案实现—种负载量子点并且包被纳米金的介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极体系中，参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl)电极，对电极是钼丝电极，工作电极为表面修饰有负载量子点并且包被纳米金的介孔材料组装的夹心免疫复合物的玻碳电极。一种制备上述负载量 子点并且包被纳米金的介孔材料的电致化学免疫传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为(I)将20mg负载量子点并且表面包被纳米金的介孔氧化硅(mSi02 @ CdTe-Au)分散在IOmL的pH为7. 4的磷酸盐(PBS)缓冲液中，加入ImL浓度为50 μ gmL—1的HIV抗原(Ag)，4°C温度下搅拌24h，离心分离得到信号标签mSi02 @ CdTe-Au/Ag ；(2)浓度为IOmg mL—1的纳米磁珠(NMP)超声分散在pH为7. 4的PBS缓冲液中，吸取ImL,SOygmL4的羊抗人抗抗体(anti_IgG)加入，在4°C的温度下混合搅拌24h,用lmLl%牛血清蛋白(BSA)封闭其他未结合抗体的活性位点，磁性分离洗涤未被磁珠固定的ant1-1gG，洗涤过后重新分散在ImL pH7. 4的PBS溶液中，得到具有磁性的捕获探针(NMP/ant1-1gG)；(3)上述制备得到的磁性捕获探针(NMP/ant1-1gG)溶液中加入一定浓度的HIV抗体(Ab)，在4°C的温度下搅拌24h然后通过磁性分离洗涤将未被磁性探针捕获的HIV抗体洗脱，得到磁性捕获探针捕获HIV抗体的复合物(NMP/ant1-1gG/Ab)(4)夹心免疫复合物的制备将上述NMP/ant1-1gG/Ab与所得到的信号标签物质mSi02 @ CdTe-Au/Ag在室温20°C的条件下搅拌60min,通过磁性洗漆分离未与磁性捕获探针的信号标签，然后重新分散在50 μ LpH7. 4的PBS溶液中，得到NMP/anti_IgG/Ab/Ag/CdTe-Au @ mSi02免疫复合物。本发明第一次将负载量子点并且包被纳米金的介孔材料用于构建电致化学发光免疫传感器，通过介孔材料巨大的比表面积与孔容积，提高了量子点的负载量，并且表面包被了纳米金能够增加该复合材料的生物兼容定，促进电子的传递性能，对电致化学发光信号起到一个增强的作用。
本发明建立一种对HIV抗体的高选择性，高灵敏度，检测简单的电致化学发光免疫传感器，结合了电致化学发光的高灵敏度，生物传感器的高特异性，应用与HIV抗体的检测，取得了满意的的结果，同样的原理还可以推广到其他肿瘤标志物的检测，具有广泛的应用前景。为进一步说明本发明的特点和效果，在附图中说明相关构件的功能和检测方法。


图1几种不同修饰电极的电致化学发光响应信号，曲线a是裸电极的电致化学发光响应；曲线b是NMP/ant1-1gG修饰电极的电致化学发光响应；曲线c是NMP/ant1-1gG/Ab的电致化学发光响应；曲线d是NMP/ant1-1gG/Ab/Ag/CdTe-Au @ mSi02的电致化学发光响应。图2电致化学发光响应信号Λ I的对数值与不同稀释倍数(I 2000,1 1000,I 800，I 500，I 200，I 100，I 20)的HIV抗体的对数值工作曲线。
具体实施方式
下面就具体结合实例对本发明的进行详细描述本发明检测HIV抗体，由免疫传感器，电解池,数据输出、采集和处理系统组成。以下实例中使用的电化学工作站与光电倍增管为西安瑞迈仪器有限公司电化学工作站(ΜΡΙ-Β型号)，三电极体系包括工作电极，参比电极(Ag/AgCl)，辅助电极(钼丝电极)，工作电极为免疫复合物修饰的传感器，各电极通过橡胶板固定在同一个平面上。实施例1 :负载量子点并且包被纳米金的介孔氧化硅的制备本发明所用的量子点，介孔氧化硅，纳米金分别是根据文献报道方法合成，具体方法参见文献(Talanta，80，1737-1743 (2010)，Langmuir，27，6099-6106 (2011) ,Anal. Chem.，77,3324-3329(2005)。负载量子点并且包被纳米金的介孔氧化硅的具体制备方案如下(I) 50mg的介孔氧化娃分散在IOmL无水甲苯中，同体积的水溶性的CMTe量子点加入并且于40°C均匀搅拌24h，离心分离，用蒸馏水及无水乙醇各至少洗涤三次，真空干燥得到巯基化修饰的介孔氧化硅。(2) 20mg巯基化修饰的介孔氧化硅分散在IOmL四氢呋喃中，同体积的CdTe溶液，以[Cd2+]的浓度计算为IOmmol L—1，加入混合，均匀搅拌6h，，离心后乙醇洗涤三次，真空干燥，得到负载量子点的介孔氧化硅。(3) 20mg上述制备的负载量子点的介孔氧化硅分散在IOmL的3%的TODA溶液中搅拌30min，使该材料表面带有大量的正电荷，然后用蒸馏水洗涤残余的TODA，将该材料重新分散到ImL的蒸馏水中，在均匀搅拌的条件下，逐滴的滴加到纳米金溶胶中，搅拌30min后离心蒸馏水洗涤三次，真空干燥得到负载量子点并且表面包被纳米金的介孔氧化硅材料。实施例2 电致化学发光免疫传感器的构建本发明通过使用上述负载量子点并且表面包被纳米金的介孔氧化硅与磁珠一起构建而成电致化学发光免疫传感器，具体实施方案如下(I)磁性捕获探针的制备10mg πιΓ1的磁珠超声分散在pH为7. 4的PBS缓冲液中，吸取ImL, 50 μ g mL—1的羊抗人抗抗体ant1-1gG加入,在4°C的温度下混合搅拌6h,用lmLl%牛血清蛋白(BSA)封闭其他未结合抗体的活性位点，磁性分离洗涤未被磁珠固定的ant1-1gG，洗涤过后重新分散在ImL pH7. 4的PBS溶液中，得到具有磁性的捕获探针(NMP/ant1-1gG);将上述制备得到的磁性捕获探针(NMP/ant1-1gG)溶液中加入一定浓度的HIV抗体(Ab)，在4°C的温度下搅拌6h然后通过磁性分离洗涤将未被磁性探针捕获的HIV抗体洗脱，得到磁性捕获探针捕获HIV抗体的复合物(NMP/ant1-1gG/Ab)(2)夹心免疫复合物的制备将上述NMP/ant1-1gG/Ab与所得到的信号标签物质mSi02 @ CdTe-Au/Ag在室温20°C的条件下搅拌60min,通过磁性洗漆分离未与磁性捕获探针的信号标签，得到NMP/ant1-1gG/Ab/Ag/CdTe-Au @ mSi02免疫复合物。(3)电致化学发光免疫传感器的构建将制备得到的NMP/ant1-1gG/Ab/Ag/[email protected]疫复合物均匀分散在50μ LpH7. 4的PBS溶液中，吸取10μ L均匀的涂覆在玻碳电极的工作区域，于40 60W的红外灯下烘干制备得到电致化学发光免疫传感器。实施例3几种不同修饰电极的电致化学发光响应采用不同的材料对电极的修饰，比较其电致化学发光响应，其结果如图1所示。裸电极(图 1，曲线 a)在 O. lmol/L 的 KCl 中含有 O. lmol/L PBS(pH = 7. 4)和 O. lmol/LK2S2O8溶液中的电致化学发光行为，其电致化学发光响应信号很弱；当电极表面修饰NMP/ant1-1gG(图1，曲线b)后，其电致化学发光信号同样很弱，这是因为电极表面覆盖有一层绝缘的蛋白质层，并且并无电致化学发光源物质，因此其电致化学发光信号几乎没有；同一原理，当电极表面修饰NMP/ant1-1gG/Ab (图1，曲线c)后，其电致化学发光信号同样没有变化；当电极表面修饰夹心免疫复合物NMP/ant1-1gG/Ab/Ag/[email protected] (图1，曲线d)后，其电致化学发光信号明显增强，这是因为负载量子点的并且包被纳米金的介孔氧化硅的复合材料标记到HIV抗原后与抗体形成夹心免疫复合物，将电致化学发光信号源物质引入到电极表面，通过施加电压后与溶液中的K2S2O8发生反应产生电致化学发光信号。

实施例4 一种负载量子点并且包被纳米金的介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器对HIV的检测方法将原HIV抗体溶液使用pH为7. 4的PBS配制稀释不同倍数的HIV抗体稀释液，稀释浓度分布为1: 500 1: 50 ;将NMP/ant1-1gG/Ab 修饰到电极表面，在 O. lmol/L 的 KCl 中含有 O.1moI/LPBS (pH=7. 4)和O. lmol/L K2S2O8溶液中扫描背景信号，记录信号强度Itl ；按照上面实施例1所述的电致化学物发光免疫传感器的构建方法，使用上述不同稀释倍数的HIV抗体进行组建电致化学发光免疫传感器，在0. lmol/L的KCl中含有0. lmol/L PBS (pH = 7. 4)和0. lmol/L K2S2O8溶液中，通过电致化学发光分析方法测定不同稀释倍数的HIV抗体对应的电致化学发光响应信号，信号强度分别记录为I1, I2, I3…。实验结果表明，随着HIV抗体浓度的增加，其检测信号逐渐增大，定义空白背景电致化学发光信号Itl，在含不同稀释倍数的HIV抗体电致化学发光检测信号其响应值为、^，^ ^则电致化学发光响应信号强度增加值八^八〗=Ix-10)的对数与不同稀释倍数的HIV抗体(I 2000 1: 20)的对数成正比。绘制IogA1-1og C标准工作曲线如图2所示。其线性回归方程为IogAI = 4. 1032+0. 48521og C (C 为稀释倍数的倒数)。
权利要求
1.一种基于负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器，所述的电致化学发光免疫传感器，其特征在于三电极体系传感器，三电极体系中参比电极为银/氯化银电极，对电极为钼电极，工作电极为负载量子点并且包被纳米金的介孔氧化硅所形成的免疫复合物修饰的玻碳电极。
2.一种制备根据权利要求1所述的一种基于负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器对HIV的检测方法，其特征在于该方法的具体步骤为负载量子点并且包被纳米金的介孔氧化硅用于固定HIV抗原作为信号标签；然后是通过纳米磁珠固定羊抗人抗抗体作为捕获探针，在溶液中用于捕获HIV抗体；然后通过抗原/抗体之间的免疫作用结合形成带有信号标签的免疫复合物，通过分离修饰到玻碳电极表面，与参比电极与对电极构建而成三体系的电致化学发光免疫传感器。
全文摘要
本发明涉及分析测试领域，基于一种基于负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器，实现对HIV抗体检测的夹心免疫分析方法。所述的电致化学发光免疫传感器是通过负载量子点并且包被纳米金的介孔材料作为信号标签，通过生物免疫的方法形成免疫复合物，修饰到电极表面，构成电致化学发光免疫传感器。本发明的一种负载量子点并且包被纳米金的介孔材料，基于介孔材料负载大量的量子点，增加信号源物质，并且包被纳米金既可方法信号，还可以增加其生物兼容性，样品前处理简单能够适应高灵敏度的检测分析血清样品中HIV抗体的含量。
文档编号G01N21/76GK103048314SQ20121043934
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者干宁, 周汉坤, 李天华, 曾少林, 周靖, 熊萍, 杜晓雯 申请人:宁波大学