专利名称：一种用高效液相色谱法快速测定尿中微量白蛋白的方法
技术领域：
本发明介绍的是测定尿中微量白蛋白的方法，具体涉及的是用高效液相色谱法快速测定尿中的微量白蛋白。
背景技术：
正常人尿液中存在着白蛋白，但含量很低，一般小于30mg/24h尿液。当肾脏发生可逆性损伤时，尿液中的白蛋白会增高，一般在30-300mg//24h尿液，此时称为微量白蛋白尿，其测定对人体的早期肾损伤具有重要意义。最初的尿液白蛋白定量检测依赖于放射免疫测定，此法需利用放射性元素作为示踪剂，影响检验者的身体健康，并严重污染环境。随后大量的免疫学方法被临床实验室采用，该方法灵敏度高，精密度好，但只能检出免疫化学反应性白蛋白，这被解释为白蛋白经过近曲肾小管时，由于肾小管溶酶体酶的作用，白蛋白的一部分抗原表位被修饰或发生了构象改变，白蛋白抗体不能与之反应而造成对其含量的低估。用分子筛色谱柱分析尿中微量白蛋白的高效液相色谱法，是一种集分离和测定于一体的分析技术，具有良好的敏感性和准确性，能检出尿中免疫化学反应性白蛋白和免疫化学非反应性白蛋白，比免疫学方法能检出更多的尿中微量白蛋白。目前已报道的高效液相色谱法所用流动相主要有NaCl-磷酸盐缓冲溶液、三氟乙酸-乙腈溶液组成的梯度洗脱系统和硫酸钠-磷酸盐缓冲液，这些流动相配制相对繁琐费时。白蛋白的出峰时间均较长，最长的在14. lmin[1]，其次为13. lmin[2]，最短的也要9. 5min[3]。而本法采用甲酸水溶液-乙腈作为流动相，配制简单省时，白蛋白在1.7min左右就出峰，大大缩短了样品的检测时间， 实现了快速测定。参考文献[1]李梅爱，万根平，骆明勇，等.HPLC法测定尿免疫化学非反应性白蛋白及其在早期诊断儿童糖尿病肾病中的意义.中国病理生理杂志，2009，25 (8) =1625-1627.[2]陈筱菲，杨建荣，陈丽玲，等.HPLC法测定尿白蛋白方法的建立和初步临床应用·中华检验医学杂志，2007，30(1) 37-40.[3] Osicka TM, Comper WD. Characterization of ImmunochemicalIy NonreactiveUrinary Albumin. Clin Chem. 2004，50(12) :2286_2291·

发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱快速分析尿中微量白蛋白含量的方法。用分子筛色谱柱，甲酸水溶液_乙腈组成的流动相，紫外波长205nm进行检测，达到测定方法结果准确、灵敏度高而且缩短检测时间的目的。为实现上述目的，采用下面的技术方案a、用分子筛色谱柱 Agilent Zorbax GF—250 250mm X 4. 6mm i. d,4ym ；b、流动相的组成0. 甲酸水溶液与乙腈按17 3比例(体积比)配制，所述的 0. 的甲酸水溶液的百分比浓度为体积百分比；
C、流速lml/min，柱温30°C，进样量:20μ 1 ；d、检测波长205nm ；e、尿液样品的处理过程为尿液样品3000g/min离心lOmin，然后取上清液于玻璃进样瓶中，再加入2倍体积的0. 2mol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样20 μ 1。f、白蛋白标准液的处理先将白蛋白标准液用超纯水稀释成系列浓度，进样时再将其分别与PH7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液作体积比1 2稀释。具体稀释方法为取系列浓度的标准液1份于玻璃进样瓶中，再加入PH7. O的0. 2mol/L磷酸盐缓冲液2份，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样20 μ 1。g、空白样品的处理取1份超纯水与2份pH7. O的0. 2mol/L磷酸盐缓冲液，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样20 μ 1。h、制作标准曲线、精密度评价、回收试验、检测低限、线性范围及方法的比较等。

与现有技术相比，本方法的优点有1、本法白蛋白出峰时间大约在1.7min左右，大大缩短了样品的检测时间，实现了快速测定。2、本法操作简单，用常见的紫外波长进行检测，不需要特殊试剂，流动相配制简单。3、经过反复试验，摸索出一套测定尿中微量白蛋白的最佳条件，包括磷酸盐缓冲液用于标准液和尿样的稀释，色谱柱和流动相的选择，流速、柱温、进样量、检测波长的设定寸寸。4、线性试验及检测低限结果表明，线性范围宽，白蛋白标准液浓度在2000mg/L范围内，浓度和峰面积的线性关系良好(R2 = 0.9969)；灵敏度高，尿液样品的检测低限为 2mg/L。5、本法测定尿液样品中微量白蛋白的批内变异系数和批间变异系数均小于5% ； 回收率为 102. 3%,98. 1%,97. 2% 06、本法与免疫散射比浊法进行配对样本t检验，差异有统计学意义(P <0.05)，可认为两种方法对尿中白蛋白的测定结果不同，高效液相色谱法测定结果明显高于免疫散射比浊法。高效液相色谱法能检出更多的白蛋白，比免疫散射比浊法的敏感性更高。


图1为空白样品色谱图；图2为白蛋白标准液色谱图；图3为尿液样品色谱图；图4为标准曲线图。
具体实施例方式以下实施方式是为了详细说明本发明，而不会影响它要求保护的范围。主要仪器设备及色谱条件Agilent Technologies 1200 series 高效液相色谱仪，G1367C 自动进样器，G1316B柱温箱，G1379B在线脱气机，G1312B双元泵，G1314A紫外检测器，Agilent Chemstation分析软件。免疫散射比浊法仪器为美国BECKMAN-COULTER公司IMMAGE 800。色谱柱AgilentZorbax GF-250250mmX 4. 6mm i. d，4 μ m ；流动相体积百分比 0. 的甲酸水溶液与乙腈按17 3比例(体积比)配制；流速lml/min ；柱温30°C ；进样量:20μ 1 ；检测波长:205歷主要试剂白蛋白标准品，购自Randox公司；甲酸，分析纯，购自天津市科密欧化学试剂开发中心；乙腈，色谱纯，购自 CNW Technologies GmbH ；免疫速率散射比浊法的试剂与标准品为Beckman Coulter公司微量白蛋白试剂
品.ο实施例1一、色谱条件的建立及标准液的配制(一)、高效液相色谱条件的选择1、流动相选择流动相首先用lOmmol/L的甲酸铵和甲醇对白蛋白标准液采用恒流和梯度洗脱系统进行测定，，接着用20mmol/L甲酸铵和甲醇作为流动相，采用梯度洗脱系统，然后用 20mmol/L甲酸铵和乙腈，采用恒流和梯度洗脱系统，都不能很好地分离白蛋白峰，最后确定 0.1%甲酸水溶液与乙腈按17 3比例(体积比)配制流动相可得到理想的空白液色谱图、 标准液色谱图及样本色谱图，白蛋白标准液浓度和峰面积成良好的线性关系。2、检测波长的选择蛋白质肽键能较强地吸收215nm附近的光谱，分别以254nm、220nm、215nm、210nm、 205nm、200nm、195nm作为检测波长，对20mg/L、200mg/L、2000mg/L不同浓度的白蛋白标准液和1份尿液样品进行测定，结果白蛋白标准液在205nm波长处峰高和峰面积均较大，尿液样品也在205nm处有更清晰的色谱峰，故选择205nm作为检测波长。3、流速对分离效果的影响采用0. 5ml/min, lml/min, 1. 5ml/min, 2. 0ml/min不同的流动相流速进行试验。实验表明，在0. 5ml/min时，洗脱不充分，在1. 5ml/min和2. 0ml/min,峰面积响应值减小，色谱系统的后压增大。而在lml/min时，白蛋白峰完全洗脱，峰面积大小适中，故采用lml/min 作为流速。(二)、标准液的配制取白蛋白标准品冻干粉剂按操作说明书加超纯水5ml至完全溶解配成浓度为 42. 5mg/L的白蛋白标准液。实施例2一、样品的检测1、空白样品的检测取1份超纯水与2份pH7. 0的0. 2mol/L磷酸盐缓冲液，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样20 μ 1。高效液相色谱条件色谱柱选用的是Agilent Zorbax GF-250250mmX4. 6mm i. (1，4μπι色谱柱；流动相体积百分比0. 的甲酸水溶液与乙腈按17 3比例(体积比)配制；流速:lml/min ；柱温30°C;进样量20 μ 1 ；检测波长:205歷。图1为进样白蛋白空白样品色谱图。2、标准液的检测先将白蛋白标准液用超纯水稀释成不同浓度，进样时再将其分别与ρΗ7.0的
0.2mol/L磷酸盐缓冲液作1 2稀释，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样 20μ1。高效液相色谱条件色谱柱选用的是Agilent Zorbax GF-250250mmX 4. 6mm i. d， 4μπι色谱柱；流动相体积百分比0.1%的甲酸水溶液与乙腈按17 3比例(体积比)配制；流速:lml/min ；柱温30°C;进样量:20μ 1 ；检测波长:205nm ；出峰时间1. 72min。图2 为进样1000mg/L白蛋白标准液色谱图。3、尿液样品的检测将2ml新鲜尿液样品平衡至37 °C，然后3000g/min离心IOmin，取上清200 μ 1 于玻璃进样瓶中，再加入0.2mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液400μ 1，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样20 μ 1。高效液相色谱条件色谱柱选用的是Agilent ZorbaxGF-250250mmX4. 6mm i. d，4y m色谱柱；流动相体积百分比0. 的甲酸水溶液与乙腈按17 3比例(体积比)配制；流速:lml/min ；柱温30°C;进样量:20μ 1 ；检测波长 205nm ；出峰时间1. 72min。图3为进样某一尿液样品色谱图。4、定量分析用外标法测定峰面积进行定量分析。即在相同色谱条件下测定白蛋白标准品和尿液样品，把尿液样品中白蛋白的色谱峰面积和白蛋白标准品的色谱峰面积进行比较求得尿液样品中白蛋白的含量。用公式表示为
Au
尿液白蛋白浓度XCs注Au =尿液中白蛋白峰面积As =白蛋白标准液峰面积Cs =白蛋白标准液浓度5、标准曲线的制作配制一系列浓度的白蛋白标准液2mg/L、10mg/L、50mg/L、200mg/L、500mg/L、 1000mg/L、2000mg/L。每个浓度作平行4_5管，分别取其平均值以白蛋白浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得方程为Y= 1. 1872X+21.286，相关系数R2 = 0.9984。图4为白蛋白标准曲线图。6、线性范围的测定配制系列浓度白蛋白标准液0mg/L、2mg/L、2. 5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、25mg/ L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、250mg/L、500mg/L、lOOOmg/L 和 2000mg/L，每个样品进样 3 次， 分别取其平均值以白蛋白浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程为Y =
1.1927Χ+18. 977，相关系数R2 = 0. 9969，表明在2000mg/L范围内，尿白蛋白测定结果呈非常好的线性关系。7.检测低限的测定取空白样品重复测定20次，得20个峰吸收值，计算其平均值加3倍标准差，得到检测低限为2mg/L。8、精密度的评价选择低、中、高(20mg/L、200mg/L、2000mg/L)三种浓度的样品分别平行测定20次， 求得X，s，得到批内CV为3. 99%、3. 60%、4. 74%。同样用这三种浓度的样品，每天上午、下午各测1次，共做20次10天，求得批间CV分别为4. 01%,3. 55%,4. 65%。三种浓度的样品，其批内和批间精密度均小于5%，如表1所示。表1三种浓度样品的批内和批间精密度
~尿液白蛋~批内(n=20)批间(n=20)
白浓度 (mean 士 s) CV/% (mean 士 s) CV/% (mg/L)_
2023.84 士 0.95 3.9923.93 士 0.974.01
200 225. 28 士 8. 12 3.60225.85 士 8.023.55
2000 2044. 75 士 96. 98 4.742044. 98 士 95. 024.659、回收率试验取正常人尿混合标本尿液样品3. 6ml平均分为四组，第1组加入0. Iml超纯水作为基础样品，第2、3、4组分别加入浓度为100mg/L、500mg/L和1500mg/L的白蛋白标准液 0. 1ml，每组浓度平行测定三次，取其平均值计算回收率。结果见表2。表2回收率测定试验结果
加入浓度(mg/L)回收浓度(mg/L)回收率(%)
1010. 23102. 35049.0598.1 150145.8097. 2
10、方法学比较试验随机选取中南大学湘雅医院门诊和住院病人新鲜尿标本56例，分别用高效液相色谱法和免疫散射比浊法进行测定，对两种方法的测定结果进行配对样本t检验，差异有统计学意义(P < 0. 05)，可认为两种方法对尿中白蛋白的测定结果不一致，高效液相色谱法测定结果明显高于免疫散射比浊法。高效液相色谱法能检出更多的白蛋白，比免疫散射比浊法的敏感性更高。
权利要求
1.一种用高效液相色谱法测定尿中微量白蛋白的方法，其特征在于，所述方法操作的具体条件如下a、用分子筛色谱柱Agilent Zorbax GF-250250mmX 4. 6mm i. d,4ym ；b、流动相按照0.甲酸水溶液与乙腈按17 3体积比配制，所述的0. 的甲酸水溶液的百分比浓度为体积百分比；C、流速:lml/min，柱温:30°C ；d、检测波长205nm。
2.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱法测定尿中微量白蛋白的方法，其特征在于，尿液样品的前处理过程为尿液样品3000g/min离心lOmin，然后取上清液于玻璃进样瓶中，再加入2倍体积的0. 2mol/LpH7. O的磷酸盐缓冲液，漩涡混勻30s，经针头式滤器过滤移至样品瓶中进样。
3.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱法测定尿中微量白蛋白的方法，其特征在于，用超纯水稀释后的系列标准液在测定前再用PH7. O的0. 2mol/L磷酸盐缓冲液稀释。
全文摘要
本发明提供一种用高效液相色谱法(HPLC)快速检测尿中微量白蛋白的方法。具体的操作条件为a、用分子筛色谱柱(Agilent Zorbax GF-250250mm×4.6mm i.d，4μm)；b、0.1％甲酸水溶液与乙腈按17∶3比例(体积比)配制流动相；c、流速1ml/min，柱温30℃；d、检测波长205nm。该方法操作简单，不需要特殊试剂，结果准确、灵敏度高、线性范围宽。与其它的HPLC方法相比最突出的优点是分离快速，大大缩短了检测时间。
文档编号G01N1/38GK102221588SQ20111007290
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年2月24日
发明者刘小兰, 刘芳, 向跃芸, 夏璐玲, 徐克前 申请人:中南大学