专利名称：一种检测去氢甲睾酮的酶联免疫试剂盒及使用方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测去氢甲睾酮的酶联免疫试剂盒及使用方法。
背景技术：
去氧甲辜丽(1-dehydro-l7-methyl testosterone, DMT),又名大力补、美雄丽，分子式C2tlH28O2，分子量300. 44。DMT目前在医学临床上普遍用于再生障碍性贫血、男性发育迟缓、烧伤处理、手术后慢性消耗性疾病、老年骨质疏松和肿瘤恶液汁病等。但DMT属于蛋白质同化激素类，长期或大量服用会对人体有很多副作用。如导致肝功能障碍，生殖功能紊舌L增加患心血管疾病的风险等。DMT还具有促进动物体内营养物质沉积和改善生产性能的作用，在畜牧业上常被用作动物饲料添加剂，以促进动物生长，提高产量。但蛋白同化激 素作为饲料添加剂应用于畜牧生产时，会在动物体内残留，当人们长期食用含有该药物残留的动物性食品时，同样会造成人的生殖系统障碍、发育异常及某些癌症如乳房癌、睾丸癌等，严重危害人类健康。目前，DMT常用的检测方法多为仪器检测方法，如高效液相色谱(HPLC)、液质联用(LC-MS)和气质联用(GC-MS)等。这些仪器检测方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样品的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。因为DMT是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。DMT人工抗原和特异性抗体以及在此基础上建立免疫分析方法尚未见报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒及使用方法。本发明提供了一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括DMT特异性抗体、DMT-载体蛋白偶联物和酶标二抗，三者体积组成比例为1:2:2。其中DMT特异性抗体为鼠抗DMT的单克隆抗体，可用DMT与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫BALB/c小鼠制得。所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，所述DMT与载体蛋白的偶联物可通过将DMT和载体蛋白用活化酯法进行偶联得到。本发明所述的一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，还进一步包括用于固定DMT与载体蛋白偶联物的载体物质很多，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。为方便现场检测和大量样本筛查，所述的试剂盒还可以进一步包括DMT标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。 所述的洗涤液为0. 5%吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1:19)，显色剂A液为过氧化氢，显色剂B液为四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为0. 01M, PH7. 4的磷酸盐缓冲液。另一方面，本发明还提供了利用上述试剂盒检测样品中DMT含量的方法，按照下述步骤进行
(I)样品前处理取10 g (其中肉5 g，精确至0.01 g)绞碎的猪肉的空白样品(肉与水同等重量搅匀)置于50 mL离心管中；添加一定量的DMT标准液后加入叔丁基甲醚20 mL,涡旋混匀器混匀I min，置于超声波发生器中超声波提取10 min，取出8000 r/min离心5min，有机相转移至另一支50 mL离心管中；下层再用20 mL叔丁基甲醚分2次提取，有机相转移至对应离心管中；40 1旋转蒸发，加2 %甲醇-PBS定容至10 mL ;进行ELISA测定。(2)用试剂盒进行检测，向包被有去氢甲睾酮抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入去氢甲睾酮单克隆抗体，孵育后洗涤排干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤排干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。
·
(3)分析检测结果。本发明试剂盒的检测原理为
将DMT抗原吸附于固相载体上，加入样本或DMT标准品溶液并加入DMT抗体工作液，待测样品中DMT和固相载体上包被的DMT抗原竞争DMT抗体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中DMT的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出DMT浓度范围。有益效果
本发明检测DMT的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫法定性或定量样品中DMT含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。本发明该试剂盒采用高特异性的DMT单克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精密度、高准确度、对仪器要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。


图I. DMT酶联免疫检测试剂盒结构图，其中I为试剂盒盒体，2为包被了 DMT-BSA抗原的酶标板，3为系列标准溶液,4为显色剂A, 5为显色剂B, 6为抗体溶液,7为酶标二抗溶液，9为浓缩洗涤液，10为浓缩样品稀释液，11为试剂瓶架。图2. DMT抑制曲线。
具体实施例方式DMT-载体蛋白偶联物的制备方法参见专利201010213218. 7 (董英、张勋、王云、储
晓刚)。本发明使用的酶标二抗为商品化的羊抗鼠IgG抗体，购自Genescript公司。本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I DMT与载体蛋白偶联物及单克隆抗体的制备及纯化1.I DMT与载体蛋白的偶联物的制备
将DMT和牛血清白蛋白(BSA)采用活化酯法进行偶联得到偶联物。I. 2 DMT单克隆抗体的制备及纯化
(I)单克隆抗体的制备取6 8周龄的健康BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5 m经高压灭菌的液体石蜡；约10天后，收集对数期的杂交瘤细胞1D6F10B4 (由实验室前期工作制备，已申请专利)，I 000 r/min离心10 min，弃上清液；用1640不完全培养液将细胞悬起，取少量加入同等体积的台盼蓝染色后进行计数，每只小鼠注射细胞5. OX IO5个；接种杂交瘤细胞7 10天后,用注射器抽取腹水,将得到的腹水经12 000 r/min离心15 min,弃沉淀，收集上清液。(2)采用正辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化步骤具体如下取适量经预处理的小鼠腹水，用0.06 mol/L、pH 4. 8的醋酸缓冲液稀释2倍；按33 ML /mL原始腹水的比例， 30 min内逐滴加入正辛酸，边滴边搅拌；于4 °C静置2 h后，12 000 r/min离心20 min,取上清液滤纸过滤；加入1/10上清液体积的0. I mol/L、pH 7. 4的PBS，并用NaOH调pH至7. 4;上清在4 °C冰浴条件下，按277 g/L的比例加入硫酸铵粉末，同时搅拌，30 min内加完，静置2 h以上或4 °C过夜；在4°C下12 000 r/min离心30 min，弃上清液，收集沉淀，将沉淀溶于一定体积的PBS，并于4°C下置于对5(Tl00倍的PBS中透析除盐2 3天，期间更换3次以上透析液。之后冻存于-20 1下备用。实施例2 检测DMT的酶联免疫试剂盒
2.I检测DMT的酶联免疫试剂盒的结构
检测DMT酶联免疫试剂盒结构如图I.所示其中I为试剂盒盒体，2为包被了 DMT-BSA抗原的酶标板，3为系列标准溶液,4为显色剂A, 5为显色剂B, 6为抗体溶液,7为酶标二抗溶液，9为浓缩洗涤液，10为浓缩样品稀释液，11为试剂瓶架。试剂瓶架11上制有凹孔，上述试剂瓶3-10安放在试剂瓶架的凹孔内，试剂瓶架11及酶标板2安放在盒体内。其中酶标板2由塑料支架和可拆分的酶标条组成。2. 2所用试剂的配制
a. DMT标准溶液DMT系列标准溶液6瓶，1_3 mL/瓶。b.包被缓冲液pH 9. 6,0. 05 mL的碳酸盐缓冲液。c.封闭液3%聚乙二醇。d.浓缩洗涤液含I %吐温的磷酸盐缓冲液(0.01 M，pH 7. 4)，为正常使用浓度的 20 倍，30-50 mL，l 瓶。2.3酶标板的制备
用包被缓冲液将DMT与载体蛋白的偶联物用包被缓冲液稀释成I呢/mL，每孔100 ML，37°C温浴2h，倾出包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200 ML封闭液，4 0C过夜,倾去孔内液体,干燥后用保鲜膜密封保存。实施例3 免疫检测方法的建立
3.I ELISA方法确定最佳包被浓度与抗体工作浓度
将 4 u g/mL>2 u g/mL> I u g/mL>0. 5 u g/mL>0. 25 u g/mL>0. 125 Ug/mL 系列浓度的牛血清白蛋白DMT-BSA偶联物按每孔100 u L包被酶标板，每行一种浓度，4°C包被过夜，洗涤3次，拍干，按每孔200 UL封闭液37 °C封闭2 h，洗涤3次，拍干。加入1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:12000、1:16000、1:24000、1:32000 稀释的抗体 100 u L，每列一
种浓度，37 °C作用50 min，洗涤3次，立即加入100 UL酶标羊抗鼠抗体，37°C作用lh，洗涤3次，加入100 u L底物液，37 1避光作用15 min, 50 u L终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置平行重复孔，取OD值为I. 0左右时的包被浓度与抗体工作浓度为最佳浓度。实验数据列于表I。可以确定，最佳包被浓度为I U g/mL,最佳抗体工作浓度为稀释8000倍。表I.棋盘法确定最佳包被浓度与抗体工作浓度
权利要求
1.一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括DMT特异性抗体、DMT-载体蛋白偶联物和酶标二抗。
2.根据权利要求I所述一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，其特征在于DMT特异性抗体、DMT-载体蛋白偶联物和酶标二抗三者体积组成比例为1:2:2。
3.根据权利要求I所述一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，其特征在于其中DMT特异性抗体为鼠抗DMT的单克隆抗体，用DMT与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫BALB/c小鼠制得；所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，所述DMT与载体蛋白的偶联物通过将DMT和载体蛋白用活化酯法进行偶联得到。
4.根据权利要求I所述一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，其特征在于还进一步包括用于固定DMT与载体蛋白偶联物的载体物质，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯；载体的形式是微量反应板凹孔。
5.根据权利要求I所述一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还可以进一步包括DMT标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液； 所述的洗涤液为O. 5%吐温-20磷酸盐缓冲液； 所述的显色剂由体积比为1:19的显色剂A液和显色剂B液组成，显色剂A液为过氧化氢，显色剂B液为四甲基联苯胺； 所述的浓缩样品稀释液为O. 01M, PH7. 4的磷酸盐缓冲液。
6.权利要求I所述一种快速检测DMT的酶联免疫试剂盒检测样品中DMT含量的方法，其特征在于按照下述步骤进行 (1)样品前处理取10g绞碎的猪肉的空白样品置于50 mL离心管中；添加一定量的DMT标准液后加入叔丁基甲醚20 mL，涡旋混匀器混匀I min，置于超声波发生器中超声波提取10 min，取出8000 r/min离心5 min，有机相转移至另一支50 mL离心管中；下层再用20mL叔丁基甲醚分2次提取，有机相转移至对应离心管中；40 °〇旋转蒸发，加2 %甲醇-PBS定容至10 mL ;进行ELISA测定； (2)用试剂盒进行检测，向包被有去氢甲睾酮抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入去氢甲睾酮单克隆抗体，孵育后洗涤排干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤排干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值； (3)分析检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测去氢甲睾酮的酶联免疫试剂盒及使用方法，涉及酶联免疫和兽药残留检测技术领域。本发明所提供的去氢甲睾酮的酶联免疫试剂盒包括去氢甲睾酮特异性抗体、去氢甲睾酮与载体蛋白的偶联物和酶标二抗。本发明的检测去氢甲睾酮的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品中残留的去氢甲睾酮。
文档编号G01N33/74GK102707073SQ20121020669
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者姚萍, 董英 申请人:江苏大学