专利名称：心肌梗死预警胶体金试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学预诊断试剂，特别是一种心肌梗死预警胶体金试剂盒及其制备方法。
背景技术：
心肌梗死(Myocardial infarction, MI 或 acute myocardial infarction, AMI),常常发生在心冠状动脉突然阻塞，造成部分心脏液供应突然中断，产生缺血和氧气短缺，如不及时治疗就会导致心肌细胞死亡。心肌梗死是心血管疾病(又可总称为冠心病)的终极转归，具有突发、无特异性前兆症状的特点，导致救治不及造成高死亡率。最近的流行病学资料显示，全球每年因冠心病死亡约1700万人，其中一半以上死于心肌梗死。我国平均每天就有2778人死于心肌梗死，堪称“第一杀手”。心肌梗死虽然在一瞬间突发，但起因却是缘于一系列的病理生理过程。首先是出现心脏冠状动脉粥样硬化，血小板聚集和血栓形成，导致冠状动脉管腔渐变狭窄、此时心肌已经出现逐渐加重的缺血和再灌注的损伤。最后极度加厚的内膜十分粗糙的动脉会突然闭塞或者动脉粥样硬化斑溃破脱落，导致心肌细胞骤然毫无血液和氧气的供应而死亡。从临床角度看，它涵盖了一组连续进展的病症，包括不稳定心绞痛、非ST段抬高的心肌梗死(NSTEMI)和ST段抬高的心肌梗死(STEMI)。心肌梗死的及时诊断通常是很困难的，特别是梗死前的心肌缺血阶段更是不易。心电图常首先用来评估因胸部不适就诊的病人，但心肌缺血的病人也可多表现为心电图未见异常，其灵敏度低于50%，致使延误治疗发展至心肌梗死。目前临床上常用的血清学检查项目，如肌钙蛋白(tix)pninS:TnI，TnT)、肌红蛋白(myoglobin,Myo)、酸激酶 MB 同功酶(creatine kinase-MB, CK-MB)和 B-型钠尿妝(B-typenatriuretic peptide, BNP)等,仅在不可逆的细胞损害以及细胞膜的完整性被破坏之后，在血中才会升高。短期和可逆的缺血发作,不会导致这些标志物血中水平升高,因此都是心肌已经发生坏死的标志物，不能用作预警指标。只有在心肌发生缺血时就能高度表达的标志物才能作为即将发生心肌梗死的预警信号，指导患者及时得到救助，避免心肌梗死的发生。脂蛋白相关磷脂酶A2 (Lp-PLA2)是磷酸脂酶A2超家族中的非钙离子依赖型磷酸脂酶，最初发现其可以降解血小板活化因子，曾被称为血小板活化因子乙酰水解酶。1995年首次被克隆，其编码基因(PLA2G7)，有12个外显子，染色体定位于6p21. 2212，由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸脂酶，相对分子质量为50X 103(50kDa)。Lp-PLA2以生物膜磷脂为天然底物优先作用于氧化磷脂sn22位上短脂酰链中的酯键，使水溶性强的磷脂产生游离脂肪酸和溶血磷脂参与磷脂的代谢。Lp-PLA2经成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节，主要与低密度脂蛋白LDL结合，能水解血小板活化因子使之失去活性，又能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物质溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸，因此具有促炎症和促动脉粥样硬化的作用。众多研究显示，动脉粥样硬化斑块的炎症发展到严重程度，并将要或者已经出现向血管内腔破裂时，Lp-PLAJf会被大量释放入血液，致使其血液内的水平会大幅提高，因此Lp-PLA2的血液浓度与粥样斑块的严重程度呈正相关性，而独立于疾病相关的任何其他危险因子，因而成为不可被取代的，直接监测疾病的演变过程和危险性的最佳的动态检测指标，尤其对于心肌梗塞的发生，具有相当关键意义的预警提示作用。与传统的心肌梗塞标记物如肌钙蛋白，CRP相比，Lp-PLA2能够更加灵敏的反应病人的状况，而且Lp-PLA2的水平与年龄，病人的身体状况，是否吸烟，高血压，收缩压，舒张压以及甘油三磷酸无关，能够更加特异性地反应病人的状况。美国食品药品管理局已批准Lp-PLA2测定作为预警心肌梗塞的标志物，用于临床诊断。其后大量的临床实践证明Lp-PLA2对心肌梗塞预警有极高的灵敏度和特异性。综上所述，心肌梗死是一个炎性反应的过程，Lp-PLA2是血管内炎性标志物，是预警心肌梗塞最理想、最可靠的早期标志物。将上述血管内炎性标志物Lp-PLA2制作成适于临床使用的心肌梗死近期预警试剂盒是心血管病患者的福音。以酶联免疫反应原理为基础的检测试纸，测试卡或类似的检测反应装置技术非常成熟，其主要依赖抗体抗原特异性结合反应原理、层析技术来捕获并分离目标物质。并通过化学发光或胶体金显色等技术来观察结果。胶体金显色具有简便易于操作等优点，但是，胶体金显色需要将胶体金标记蛋白来包被在检测反应载体上，每种包被的蛋白都有其自身特性和结构特点，这一工艺流程是检测反应试纸等装置是否能灵敏特异地完成检测的关键。

发明内容
本发明基于上述领域的空白及存在的缺陷，通过制备方法的改进提供了两种快速检测全血中脂蛋白相关磷脂酶A2 (Lp-PLA2)的胶体金检测试剂盒。一种用于酶联免疫反应的胶体金标记稳定液，其特征在于，在胶体金标记蛋白溶液中还加入有O. 24mg/ml的PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖，O. 5%(w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二烧基磺酸钠SDS。所述胶体金标记蛋白溶液指胶体金标记脂蛋白相关磷脂酶A2单抗所得的溶液。一种心肌梗死预警试剂盒的制备方法，包括制备胶体金标记脂蛋白相关磷脂酶A2单抗的胶体金标记蛋白溶液以及检测反应载体，其特征在于在胶体金标记蛋白溶液中还加入有 O. 24mg/ml 的 PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖，O. 5% (w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二烧基磺酸钠SDS。所述检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述试纸条从点样端开始依次为胶体金结合区域、测试区域、手持端，所述胶体金结合区域的膜材料为玻璃纤维纸，测试区域的膜材料为硝酸纤维膜，所述硝酸纤维素膜上设置有质控线和测试线，测试线上包被有Img/ml的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，质控线包被有lmg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，其特征在于所述玻璃纤维纸上包被有所述胶体金标记稳定液，所述测试区域采用孔径为5um的硝酸纤维素膜。所述检测反应载体为渗滤盒，所述渗滤盒内部为吸水垫料，渗滤盒上表面设置有一个开阔的通孔为检测反应区，所述通孔下垫有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜下表面与所述吸水垫料紧贴着，上表面使所述通孔封闭，所述通孔中心位置对应的硝酸纤维素膜上设置有呈十字交叉状的质控线和检测线，测试线上包被有lmg/ml的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，质控线包被有lmg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，所述硝酸纤维素膜的孔径为 5 um ο所述制备方法，还包括配制全血处理液，所述全血处理液为含有3mg/mlEDTA_ZK，
O.5% (w/w) TritonX-100,0. 6% (w/w)脱氧胆酸钠，0· 05% (w/w) ProClin300 的 pH 值 7· 4的PBS溶液。上述任一制备方法得到的心肌梗死预警试剂盒。本发明利用血管内炎性标志物脂蛋白相关磷脂酶Α2，制作出了成适于临床使用的检测患者脂蛋白相关磷脂酶Α2水平以预警心肌梗死的试剂盒。本发明的贡献在于试剂盒制备方法上的改进，这些改进使制备得到的试剂盒的灵敏性，稳定性，特异性都得以提高。本发明的第 一个改进在于提供了专门适合于脂蛋白相关磷脂酶Α2与胶体金偶联的稳定液配方，使两者结合更快，更紧密稳定共价键。本发明的制备方法的第二个改进在于，制备的检测反应载体如试纸条上采用孔径为5um的硝酸纤维素膜，可以有效的减少杂波。本发明的制备方法的第三个贡献在于，还提供了制备全血处理液的配方。该全血处理液对待测学清进行预处理，可使检测更灵敏，结果更准确。


图1.试纸条检测结果示意图。图2.渗滤盒结构示意图。图3.试纸条对比试验结果，其中左I为测试试纸条，右I的对照组。图4.试纸条对比试验结果，其中左I边为测试试纸条，右2 4试纸条为对照。图5.渗滤盒对比试验结果，上I为本发明的测试渗滤盒，下4为对照。
具体实施例方式实施例1、免疫胶体金层析法检测Lp-PLA2本发明应用双抗体夹心法检测人血清或血浆中的Lp-PLA2，采用基因工程表达并纯化的Lp-PLA2蛋白制作的单抗包被硝酸纤维素膜，用胶体金标记另一株单抗或多抗均匀涂布于玻璃纤维纸上，运用纸层析技术及免疫金的显色反应达到检测Lp-PLA2的目的。特点整个操作时间约20分钟，既可以由专业的医院检验科检验人员操作使用，也可以由检测人独立使用。本发明的试剂盒组成=Lp-PLA2测试卡，说明书I份，样品稀释液一瓶步骤1.各种试剂的配制1.样品稀释液用SOOmL蒸馏水溶解O. 2g氯化钾(KCl)(北京化学试剂公司，500g/瓶)，1. 44g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO415 12H20)(北京化学试剂公司，500g/瓶)和
O.24 二水合磷酸二氢钾(KH2PO4。2H20)(北京化学试剂公司，500g/瓶)，用盐酸(HCl)(北京化学试剂公司，500ml/瓶)调节溶液的pH值至7. 4，加水至1L，摇匀。2.磷酸盐缓冲液(PBS):用800mL蒸馏水溶解8g氯化钠(NaCl)(北京化学试剂公司，500g/瓶)，0· 2g氯化钾(KCl)(北京化学试剂公司，500g/瓶)，1. 44g十二水合磷酸氢二钠(Na2HP04。12H20)(北京化学试剂公司，500g/瓶)和O. 24g 二水合磷酸二氢钾(KH2PO4. 2H20)(北京化学试剂公司，500g/瓶)，用盐酸(HCl)(北京化学试剂公司，500ml/瓶)调节溶液的PH值至7. 4，加水至1L，摇匀。3.硝酸纤维素膜Whatman ImmunoporeFP, 2. 5cm*50m 带背衬，孔径 5um。4.质控线条包被用抗体(简称C抗体)羊抗鼠免疫球蛋白(IgG)抗体，购自Abnova。用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体重量百分比浓度为lmg/mL。5.全血处理剂3mg/mlEDTA — ZK (Sigma500g/ 瓶)，0· 5%TritonX_100 (北京化学试剂公司，500ml/瓶)，O. 6%脱氧胆酸钠(北京化学试剂公司，500g/瓶)，O. 05%ProClin300(Sigma500g/瓶)加入pH值7. 4的PBS溶液。6.检测线条包被用抗体(简称T抗体)鼠抗人单克隆抗体，购自Abnova。用磷酸盐缓冲液PBS稀释Lp-PLA2单克隆抗体，摇匀，优选浓度为lmg/ml，制得T抗体溶液。步骤2.制备Lp-PLA2金标单克隆抗体反应溶液1.制备胶体金溶液浓度为万分之一，直径10nm，购自北京华美公司。用重量百分比浓度为1%的碳酸钾(K2CO3)(北京化学试剂公司，500ml/瓶)，水溶液调节pH至8. 9。2.鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体，购自Abnova。用磷酸盐缓冲液PBS稀释Lp-PLA2单克隆抗体，摇匀，优选重量百分比浓度为O. l-0.2mg/mL。鼠抗人Lp-PLA2单克隆抗体只与血液中相应的Lp-PLA2抗原发生特异性反应，从而决定了本检测技术的特异性。3.标记蛋白最适胶体金溶液稳定量的测定未加入蛋白或加入蛋白量不足以稳定胶体金溶液的试管，即 呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金溶液的红色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定Iml胶体金溶液的必须蛋白量，在此基础上加上20%的量，即为稳定Iml胶体金溶液所需蛋白的实际用量。实验如表I所示。管1、2、3、4中 ，有明显蓝色聚沉现象，管5略有淡红色沉淀，管6、7、8稳定，无聚沉现象，由此确定，25mg/L为稳定胶体金溶液的蛋白最小用量，在此基础上加20%，即30mg/L为稳定胶体金溶液的抗人Lp-PLA2单克隆抗体的实际用量。表I标记蛋白最适胶体金溶液稳定量实验表
权利要求
1.一种用于酶联免疫反应的胶体金标记稳定液，其特征在于，在胶体金标记蛋白溶液中还加入有O. 24mg/ml的PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖,0. 5% (w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二烧基磺酸钠SDS。
2.根据权利要求1所述的胶体金标记稳定液，所述胶体金标记蛋白溶液指胶体金标记脂蛋白相关磷脂酶A2单抗的溶液。
3.—种心肌梗死预警试剂盒的制备方法，包括制备胶体金标记脂蛋白相关磷脂酶A2单抗的胶体金标记蛋白溶液以及检测反应载体，其特征在于所述胶体金标记蛋白溶液中加有 O. 24mg/ml 的 PEG20000,1. 5% (w/w)牛血清白蛋白，3% (w/w)的鹿糖，O. 5% (w/w)的海藻糖，1% (w/w)的酪蛋白和2% (w/w)的十二烧基磺酸钠SDS。
4.根据权利要求3所述的制备方法，所述检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述试纸条从点样端开始依次为胶体金结合区域、测试区域、手持端，所述胶体金结合区域的膜材料为玻璃纤维纸，测试区域的膜材料为硝酸纤维膜，所述硝酸纤维素膜上设置有质控线和测试线，测试线上包被有lmg/ml的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，质控线包被有Img/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，其特征在于所述玻璃纤维纸上包被有权利要求2所述的胶体金标记稳定液，所述测试区域采用孔径为5um的硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求3所述的制备方法，所述检测反应载体为渗滤盒，所述渗滤盒内部为吸水垫料，渗滤盒上表面设置有一个开阔的通孔为检测反应区，所述通孔下垫有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜下表面与所述吸水垫料紧贴着，上表面使所述通孔封闭，所述通孔中心位置对应的硝酸纤维素膜上设置有呈十字交叉状的质控线和检测线，测试线上包被有lmg/ml的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体,质控线包被有lmg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，所述硝酸纤维素膜的孔径为5um。
6.根据权利要求3 5任一所述的制备方法，还包括配制全血处理液，所述全血处理液为含有 3mg/mlEDTA-ZK，0. 5% (w/w) TritonX-100,0. 6% (w/w)脱氧胆酸钠，O. 05% (w/w)ProCl in300 的 pH 值 7· 4 的 PBS 溶液。
7.权利要求3 6任一制备方法得到的心肌梗死预警试剂盒。
全文摘要
本发明“心肌梗死预警胶体金试剂盒及其制备方法”，涉及医学检测装置。一种心肌梗死预警试剂盒及其制备方法，包括制备胶体金标记脂蛋白相关磷脂酶A2单抗的胶体金标记蛋白溶液以及检测反应载体，其特征在于所述胶体金标记蛋白溶液中加有0.24mg/ml的PEG20000，1.5%(w/w)BSA，3%(w/w)的蔗糖，0.5%(w/w)的海藻糖，1%(w/w)的酪蛋白和2%(w/w)的十二烷基磺酸钠SDS。本发明通过制备方法的改进提供了两种快速检测全血中脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的胶体金检测试剂盒，还提供了使该试剂盒性能优化的胶体金标记蛋白溶液。
文档编号G01N33/577GK103048457SQ20121049159
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者吴凡, 焦守恕, 满慧娟 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司