专利名称：一种检测邻苯二甲酸二丁酯含量的elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，属于生物技术领域。
背景技术：
近年来在许多国家和地区，塑化剂对食品、环境的污染引起了人们强烈的担忧。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)属于苯二甲酸酯类化合物，被普遍应用于塑料制品、胶水、油漆、指甲油、洗发水和沐浴液等数百种产品中。邻苯二甲酸二丁酯是半挥发性化合物，不与终产品共价结合，在生产和生活中，被不断地释放到大气、土壤和水环境中。环境中的邻苯二甲酸二丁酯又通过呼吸、饮食、皮肤接触等三种途径进入人体。因此，人类正面临着越来越高的邻苯邻苯二甲酸二丁酯暴露风险。有研究报告指出我国普通人群DBP日摄入量为12. 2ug/kg bw,高于世界平均水平。动物模型研究和流行病学调查发现邻苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖发育的障碍。邻苯二甲酸酯还具有免疫毒性，能导致儿童产生哮喘、湿疹、鼻炎等持久性过敏症。此夕卜，邻苯二甲酸二丁酯还能能导致糖尿病、肥胖症等。因此，邻苯二甲酸二丁酯检测已成为食品安全、环境监测、毒理学研究等领域的重要工作。由于邻苯二甲酸二丁酯在水环境、生物体内的含量较低，常常在检测域以下，因此邻苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困难的工作。早期用含同位素14C的DBP饲喂实验动物，然后检测体内组织中的放射性水平来评价DBP的水平。但是由于DBP在生物体内降解快，所检测到的放射量只是DBP和降解代谢物的总体水平，并不能代表DBP在生物组织内的真正含量。现在DBP的分析多采用气相色谱(GC)、HLPC、GC-质谱联用法等色谱分析技术，但这些技术需要进行样品前处理等，耗时多，并且有较高的仪器要求，色谱柱等耗材价格昂贵，此外，还需要操作人员有丰富的经验。免疫分析由于选择性强、灵敏度高，一次可检测多种样品，因此把免疫分析技术应用于DBP检测具有简便、快速、成本低的优点。张明翠等用一种DBP的多克隆抗体，通过免疫组化法分析了水和包装的食品中DBP的含量。Yanaihara等运用酶联免疫分析法(ELISA)分析了邻苯二甲酸酯类物质的含量。但是，这两个研究都是基于多克隆抗体的免疫分析。多克隆抗体对抗原的专一选择性、灵敏度上都不及单克隆抗体。多克隆抗体受限于实验动物，不能无限制的获取。此外，由于从不同动物个体中获取的多克隆抗体的选择性、灵敏度、效价等都不同，因此用多克隆抗体建立同一标准的免疫分析方法就很困难。

发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供操作简便、灵敏度高的检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法。本发明提供两种酶联免疫吸附法(ELISA)检测生物样品和非生物样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)含量。一种是人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量，一种是半抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。本发明所提供的方法之一是
利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，样品中DBP和包被抗原DBAP-BSA竞争结合DBP单克隆抗体，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算，而得到DBP
的含量。 上述方法具体包括如下步骤
1)DBP单克隆抗体的制备；
2)抗体效价的测定 将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被、封闭，与不同稀释度的DBP单克隆抗体结合，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O处抗体稀释度为单克隆抗体的工作浓度；
3)标准抑制曲线的建立
将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被，封闭，不同浓度DBP标准溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横坐标，建立抑制率标准曲线；
4)测定样品抑制率，通过抑制标准曲线确定样品中DBP含量
将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被，封闭，样品溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，计算出抑制率，通过抑制率标准曲线确定样品中DBP含量。上述方案中，所述DBP单克隆抗体制备过程如下人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并克隆化；小鼠腹水法大量制备单克隆抗体；再通过硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体。上述方案中，将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被的过程为用包被缓冲液将人工抗原DBAP-BSA稀释到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml, 100 μ L/孔加入酶标板中，同时设置加有100 μ L包被缓冲液的对照孔，4°C过夜。本发明所提供的方法之二是
利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，样品中DBP和包被半抗原DBAP竞争结合DBP单克隆抗体，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算，而得到DBP的含量。上述方法具体包括如下步骤
1)DBP单克隆抗体的制备；
2)抗体效价的测定
将半抗原DBAP于酶标板中包被、封闭，与不同稀释度的DBP单克隆抗体结合，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O处抗体稀释度为单克隆抗体的工作浓度；
3)标准抑制曲线的建立
将半抗原DBAP于酶标板中包被，封闭，不同浓度DBP标准溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横坐标，建立抑制率标准曲线；4)测定样品抑制率，通过抑制标准曲线确定样品中DBP含量将半抗原DBAP于酶标板中包被，封闭，样品溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，计算出抑制率，通过抑制率标准曲线确定样品中DBP含量。上述方案中，将半抗原DBAP于酶标板中包被过程为
a.酶标板的羧化向酶标板中每孔加入5%的酸性高锰酸钾溶液150μ L, 60°C放置Ih ；
b.洗板每孔加入6mol/L HCl 200 μ L,室温摇动5min，倒出孔内液体，拍干，重复洗3次，以除去二氧化锰颗粒；再用蒸馏水洗3次；
c.包被用蒸馏水稀释半抗原DBAP至一定浓度，每孔70μ L加到羧化后的酶标板中，另设一不包被孔做空白对照；每孔加入70yL碳二亚胺(EDC)，37°C摇动过夜，用蒸馏水洗3次，拍干备用。本发明利用DBP单克隆抗体，分别通过人工抗原(或半抗原)包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。本发明两种方法都是利用DBP人工抗原(DBAP-BSA)免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，生物组织样品(或非生物样品)中DBP和包被抗原与DBP单克隆抗体竞争结合，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算而得到DBP的含量。本发明检测结果已得到气相色谱-质谱联用等技术方法的支持，并得到水样中添加DBP回收计算的支持。本发明可以一次处理大量样品，灵敏度高，方便快捷，稳定性好，成本低廉，且由于本发明的单克隆抗体对DBP特异性强，因此检测结果不受其它酞酸酯的影响；由于DBP在生产和生活中的广泛使用，又易于释放到环境中，DBP可以在某些生物体内积累和在环境中大量存在，因此，本发明可以广泛适用于检测生物样品和非生物样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量，评价环境中邻苯二甲酸二丁酯的污染水平。


图1是以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横坐标，建立的标准抑制曲线，抑制率的计算公式为I%= (A - Ai)/(A - A0)*100, A为阳性对照孔的吸光度值，Ai为含有浓度为i的DBP孔吸光度值，AO为空白孔的吸光度值。图2显示的是分别通过灌胃法、皮肤涂抹法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时取肝组织制成匀浆，通过人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。图3显示的是分别通过灌胃法、皮肤涂抹法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时耳部采血，通过人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。图4显示的是分别通过灌胃法、皮肤涂抹法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时米集大鼠尿液样品，通过人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。图5显示的是分别通过灌胃法、皮肤涂抹法将大鼠暴露于400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时取肾组织制成匀浆，通过人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。一、实验材料1.分泌抗DBP单克隆抗体的杂交瘤细胞株由华中师范大学生命科学学院环境科学实验室保存，可对外发售。该杂交瘤细胞细胞能稳定分泌抗体，生长状态良好。·
2. 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)标准溶液(lmg/ ml) :DBAP50mg溶解于2，5-二甲基呋喃(DMF)并定容到50 ml ο3. DBAP-BSA:用重氮法将DBAP与载体蛋白BSA偶联。将60mg (O. 2mM) DBAP溶于2ml 二氧六环中，搅拌条件下缓慢加入2ml IM的HCl，冷却至4°C，滴加200 μ 17%的NaNO2溶液，搅拌30min，再将IOml含60mgBSA的O. 2M硼酸盐缓冲液加入到上述溶液中，继续反应3h, IOOOOg离心5min,取上清,凝胶层析除去小分子得人工抗原。4. DBP标准溶液(lmg/ ml): DBP50mg溶解于2，5- 二甲基呋喃(DMF)并定容到50ml ο5. 5%酸性高锰酸钾溶液Ig高锰酸钾溶于20ml0. 6M的硫酸中，临时配置。6. EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(8 mg/ ml) 8mgEDC溶于IOmlO. 2M 2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES中，避光保存。7. ELISA检测用试剂及溶液
I)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG, Sigma公司。2)包被缓冲液(O. 05M ρΗ9· 6 碳酸缓冲液)=Na2CO3L 59g，NaHCO3 2. 93g，加水稀释至1000ml，调pH值到9. 6。3)磷酸盐缓冲液(pH7. 4 PBS) NaCl 8. 0g, KH2PO4 O. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g或者 Na2HPO41. 15g 稀释至 1000ml。4)洗涤缓冲液(O. OlM pH7. 4 PBS-Tween-20) NaCl 8. 0g, KH2PO4 O. 2g,Na2HPO4 · 12H20 2. 9g 或者 Na2HPO41. 15g，Tween-20 0. 5ml (用前临时加入)稀释至1000ml。5)封闭缓冲液在pH7. 4 PBS缓冲液中加入5%脱脂奶粉。(用时现配)
6)抗体稀释液在PBS缓冲液中加入O.1%BSA。(用时现配)
7)底物显色液邻苯二胺(OPD)(mg)/0. 2mol/L Na2HPO4(ml)/0. lmol/L，柠檬酸(ml)/dH20 (ml) /30%H202 ( μ 1)=4/2. 57/2. 43/5/4。用时现配。8)显色终止液2M H2SO4,室温保存。二、实验方法1.实验动物染毒处理
6周龄Wistar大鼠购自湖北省疾病控制中心，每笼2-3只饲养在22±3 C和湿度为55± 10%房间里，可自由进食和饮水。将DBP溶解在玉米油中分别通过灌胃方式、皮肤涂抹方式暴露5天，暴露剂量为400mg/kg/d，分别在染毒结束后的24小时、48小时、72小时取大鼠肝、肾组织制成匀浆，或取血液、尿液样品，进行ELISA检测。抗DBP单克隆抗体制备取10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射O. 5ml灭菌石蜡油。10天后。取生长状态良好的杂交瘤细胞，用PBS漂洗，吹下，IOOOrpm离心5min收集细胞，O. 4mlPBS重悬细胞。注射到石蜡处理过的小鼠腹腔内，10-12天后收集小鼠腹水，IOOOrpm离心5min沉淀细胞，收集细胞上清。硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体
1)取腹水与醋酸盐缓冲液按1:2混合，再加入33μ I正辛酸，室温搅拌30min，4°C静置 2h。2)4。。12000g 离心 15min，取上清调 pH 值到 7.4。3)向上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，搅拌30min，4°C静置lh。4) 4°C 12000g离心15min，弃上清，用4ml半饱和硫酸铵溶液洗涤后，再溶于PBS中。5)向悬液中加适量饱和硫酸铵溶液使饱和度为33%，搅拌30min，4°C静置lh。6)4°C 12000g离心15min，弃上清，再溶于PBS中，用100倍体积的PBS4°C透析24h，8h换一次液。7)取透析后样品测定蛋白含量并用SDS-PAGE检测抗体纯度。抗体效价测定
O包被用包被缓冲液将人工抗原(DBAP-BSA)稀释到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml，100 μ L/空加入酶标板中，同时设置加有100 μ L包被缓冲液的对照孔，4°C过夜；
2)封闭倒出酶标板内孔内液体，拍干，每孔加入250μL1%0VA，37°C封闭lh，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200 μ L洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；
3)用抗体稀释液将DBP单抗从1:500开始2倍梯度稀释后加入酶标板孔内，37°C孵育lh，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200 μ L洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；
4)加酶标二抗用抗体稀释液将HRP标记羊抗小鼠IgG以1:10000稀释，100μ L每孔加入酶标板中，37°C孵育lh，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200 μ L洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；
5)显色每孔加入新鲜配制的底物显色液，室温避光反应15min；
6)终止每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4终止反应；
7)用酶标仪测定492nm处吸光度值；吸光度接近1.O处的抗体稀释度1:1600)为抗体的工作浓度；
5.标准抑制曲线建立
O包被(人工抗原包被竞争抑制ELISA法):人工抗原包被竞争抑制ELISA法用包被缓冲液将人工抗原(DBAP-BSA)稀释到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml，100 μ L/空加入酶标板中，同时设置加有100 μ L包被缓冲液的对照孔，4°C过夜；
2)封闭倒出酶标板内孔内液体，拍干，每孔加入250μL1%0VA，37°C封闭lh，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200 μ L洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；
3)竞争DBP标准溶液从4000μ g/L开始2倍梯度稀释，50 μ L/孔加入酶标板中，然后每孔加入2倍工作浓度的单抗50 μ L，混匀，另设50 μ L抗体稀释液+50 μ L 2倍工作浓度单抗的阳性对照孔；37°C孵育lh，洗板；4)加酶标二抗用抗体稀释液将HRP标记羊抗小鼠IgG以1:10000稀释，100μ L每孔加入酶标板中，37°C孵育lh，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200μ L洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；
5)显色每孔加入新鲜配制的底物显色液，室温避光反应15min；
6)终止每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4终止反应；
7)用酶标仪测定492nm处吸光度值；
8)以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横 坐标，建立抑制曲线，抑制率的计算公式为I%=(A-Ai)/(A - A0) *100，A为阳性对照孔的吸光度值，Ai为含有浓度为i的DBP孔吸光度值，AO为空白孔的吸光度值。抑制标准曲线如图1所示。6.样品DBP检测和计算
1)步骤I中准备的大鼠肝、肾组织匀浆，和血液、尿液作为待测样品，样品的包被，封闭同标准曲线建立方法中步骤；
2)样品DBP与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体
取样品溶液50 μ L/孔加入酶标板中，然后每孔加入2倍工作浓度的单抗50 μ L，混匀，另设50 μ L抗体稀释液+50 μ L 2倍工作浓度单抗的阳性对照孔；37°C孵育lh，洗板；
3)后续加酶标二抗、显色、终止、测定同标准曲线建立方法中步骤；倒出酶标板内孔内液体，拍干，每孔加入250 μ L，倒出酶标板内孔内液体，拍干；每孔加入200 μ L洗涤缓冲液洗板，倒出孔内液体，拍干；重复洗3次；
4)根据标准曲线回归方程计算DBP含量
肝组织样品中DBP含量如图2所示,血液中DBP含量如图3所示,尿液中DBP含量如图4所示，肾组织中DBP含量如图5所示。采用半抗原包被竞争抑制ELISA法中的包被过程为
a.酶标板的羧化向酶标板中每孔加入5%的酸性高锰酸钾溶液150μ L, 60°C放置Ih ；
b.洗板每孔加入6mol/LHCl 200 μ L,室温摇动5min，倒出孔内液体，拍干，重复洗3次，以除去二氧化锰颗粒；再用蒸馏水洗3次；
c.包被用蒸馏水稀释半抗原DBAP至一定浓度，每孔70μ L加到羧化后的酶标板中，另设一不包被孔做空白对照；每孔加入70 μ L碳二亚胺(EDC)，37°C摇动过夜，用蒸馏水洗3次，拍干备用。其它步骤同人工抗原包被竞争抑制ELISA法。
权利要求
1.一种检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，其特征在于，利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，样品中DBP和包被抗原 DBAP-BSA竞争结合DBP单克隆抗体，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算，而得到DBP的含量。
2.根据权利要求1所述的ELISA方法，其特征在于，包括如下步骤1)DBP单克隆抗体的制备；2)抗体效价的测定将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被、封闭，与不同稀释度的DBP单克隆抗体结合，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O处抗体稀释度为单克隆抗体的工作浓度；3)标准抑制曲线的建立将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被，封闭，不同浓度DBP标准溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横坐标，建立抑制率标准曲线；4)测定样品抑制率，通过抑制标准曲线确定样品中DBP含量将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被，封闭，样品溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，计算出抑制率，通过抑制率标准曲线确定样品中DBP含量。
3.根据权利要求2所述的ELISA方法，其特征在于，所述DBP单克隆抗体制备过程如下人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与瘤细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞并克隆化；小鼠腹水法大量制备单克隆抗体；再通过硫酸铵沉淀法纯化DBP单克隆抗体。
4.根据权利要求2或3所述的ELISA方法，其特征在于，将人工抗原DBAP-BSA于酶标板中包被的过程为用包被缓冲液将人工抗原DBAP-BSA稀释到O. 25 μ g/ml或O. 5 μ g/ml, 100 μ L/孔加入酶标板中，同时设置加有100 μ L包被缓冲液的对照孔，4°C过夜。
5.一种检测邻苯二甲酸二丁酯含量的ELISA方法，其特征在于，利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，样品中DBP和包被半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯竞争结合DBP单克隆抗体，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算，而得到DBP的含量。
6.根据权利要求5所述的ELISA方法，其特征在于，包括如下步骤1)DBP单克隆抗体的制备；2)抗体效价的测定将半抗原DBAP于酶标板中包被、封闭，与不同稀释度的DBP单克隆抗体结合，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm出的吸光度，吸光度接近1. O处抗体稀释度为单克隆抗体的工作浓度；3)标准抑制曲线的建立将半抗原DBAP于酶标板中包被，封闭，不同浓度DBP标准溶液与包被抗原竞争结合DBP 单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止，用酶标仪测定492nm处的吸光度，以抑制率为纵坐标，DBP浓度为横坐标，建立抑制率标准曲线；4)测定样品抑制率，通过抑制标准曲线确定样品中DBP含量将半抗原DBAP于酶标板中包被，封闭，样品溶液与包被抗原竞争结合DBP单克隆抗体，后续加酶标二抗，显色，终止， 用酶标仪测定492nm处的吸光度，计算出抑制率，通过抑制率标准曲线确定样品中DBP含量。
7.根据权利要求6所述的ELISA方法，其特征在于，将半抗原DBAP于酶标板中包被过程为a.酶标板的羧化向酶标板中每孔加入5%的酸性高锰酸钾溶液150μ L, 60°C放置Ih ；b.洗板每孔加入6mol/LHCl 200 μ L,室温摇动5min，倒出孔内液体，拍干，重复洗3 次，以除去二氧化锰颗粒；再用蒸馏水洗3次；c.用蒸馏水稀释半抗原DBAP至一定浓度，每孔70μ L加到羧化后的酶标板中，另设一不包被孔做空白对照；每孔加入70 μ L碳二亚胺，37°C摇动过夜，用蒸馏水洗3次，拍干备用。
全文摘要
本发明提供了两种酶联免疫吸附法检测生物样品和非生物样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)含量的方法。一种是人工抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量，一种是半抗原包被竞争抑制ELISA法测定DBP的含量。两种方法都是利用DBP人工抗原DBAP-BSA免疫小鼠而制得DBP单克隆抗体，样品中DBP和包被抗原与DBP单克隆抗体竞争结合，再通过酶联二抗的显色反应和抑制率计算而得到DBP的含量。本发明可以一次处理大量样品，灵敏度高，方便快捷，稳定性好，成本低廉，特异性强。
文档编号G01N21/78GK103018460SQ201210530929
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者陈明清, 杨旭, 曾强, 魏晨曦, 袁均林, 丁书茂 申请人:华中师范大学