专利名称：活细胞核质成像的方法及其在活细胞核质信号传导通路监测的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞分子生物学和非线性光学显微成像领域，具体来说是一种活细胞
核质成像的方法及其在活细胞核质信号传导通路监测的应用。
背景技术：
多细胞生物是一个繁忙而有序的细胞社会，这种社会性的维持不仅依赖于细胞的物质代谢与能量代谢，还有赖于细胞通讯与信号传递，从而以不同的方式协调它们的行为，诸如细胞生长、分裂、死亡、分化及其各种生理功能。 生物体细胞之间的信息转导可通过相邻细胞的直接接触来实现，但更重要的也是更为普遍则是通过细胞分泌各种化学物质来调节自身和其它细胞的代谢和功能。细胞接受外界信号，通过一整套特定的机制，将胞外信号转导为胞内信号，最终调节特定基因的表达(细胞核内)，引起细胞的应答反应，这是细胞信号系统的主线，这种反应系列称之为细胞信号通路(Signaling Pathway)。因此，在人体中，信号传导通路通常是由分泌释放信号物质的特定细胞、信息物质(包含细胞间与细胞内的蛋白质、分子、离子等)以及靶细胞(包含特异受体等)等构成。 信号传导通常包括以下步骤特定的细胞释放信息物质一信息物质经扩散或血循环到达靶细胞一与靶细胞的受体特异性结合一受体对信号进行转换并启动细胞内信使系统一靶细胞产生生物学效应。 其中，转录因子在细胞内信息传递中起着非常重要的作用，基因转录过程由这些调节蛋白所控制，它们的结构中含有特异性区域，即DNA结合区域，能与靶基因调节区域(即启动子和增强子)上的特定DNA序列结合。根据其DNA结合区域的不同，转录因子被分为不同家族，如核因子NF-k B(Nuclear factor ka卯a B)(张宁译徐永健校核因子KB : —种新的治疗途径？德国医学1999， 5 :261) 、 JAK/STAT、 DREB等。因此有效监控这些转录因子在核质间(细胞质与细胞核之间)的转运过程有助于增进了解细胞内信号通路，从而对我们进一步理解肿瘤的产生机制以及药物的作用机制具有重要的现实意义。
荧光标定技术是将荧光标记物与特异性目标分子相结合，通过研究荧光标记物的行为来示踪目标分子的行为。荧光标记物包括所有具备荧光发射基团的物质，如小分子的荧光染料(Fluorescein,Rhodamine，Texas Red等)、生物荧光大分子(GFP及其衍生物等)、量子点(Quantum Dots)荧光探针等。荧光标记物与目标分子的结合方式包括直接的特异性结合(DNA与溴化乙啶EB)、通过抗原抗体介导的间接结合(免疫荧光标定技术)、通过基因重组将生物荧光分子与特定的目标分子相结合的标定技术(如本发明所使用的GFP标定NF-kB的方法)等。 目前研究转录因子(如核因子NF-k B)活细胞内调控通路的单光子共焦显微成像的研究中，要获得荧光标记的NF-k B激活前后在核质间的动态分布的信息，首先需要明确细胞核的位置，这通常由下面的方法来实现(l)荧光标记蛋白在细胞质中大量聚集，而细胞核中浓度极低，以荧光分布的强弱大致判断细胞核的位置；(2)利用其它荧光染料对细胞核进行标定，通过图像叠加确定目标蛋白在细胞核位置的浓度变化；(3)转换到明视场对细胞核成像等。但它们带来相应方法上的不足其中方法(1)实施的前提是筛选到荧光蛋白高表达的细胞株，而这种异常高表达一方面对细胞的正常生理活动会有潜在的影响，另一方面也给细胞株的筛选和维持带来困难。方法(2)在样品的准备过程中增加了一道细胞核荧光染色的程序，外源性的荧光染料进入可能会对细胞的生理状态造成一定的影响，并且如果使用在低表达细胞株的情况下(对细胞尽可能微小的外部干扰下)，对实验数据的采集造成困难，从而无法实现对细胞尽可能造成微小外部干扰状态下的动态研究；方法(3)频繁的进行光路变化带来繁琐的操作。 随着二十世纪九十年代飞秒激光技术的出现，近年来快速发展的非线性双光子显
微成像技术为活体细胞下分子水平的生物医学研究提供了更加有力的工具。 与单光子共焦显微成像相比，双光子显微成像具有以下优势 (1)由于依赖于两个光子在焦平面的同时作用，非聚焦平面可能发生的概率极小，具有清晰的自动三维(3D)断层能力，同时极大程度地降低了焦平面外的光漂白作用和光毒性，可实现样品长时间的活体成像。 (2)同时由于较长近红外波长的采用，降低了生物组织对光的吸收和散射效应，成像深度大大增加。 非线性双光子光学成像中的第 一 种成像模式为双光子荧光(Two-PhotonFluorescence， TPF)成像模式。近来年由于意识到双光子荧光成像(TPF)较单光子荧光成像突出的优点，同时实际荧光探针技术等相应技术的成熟，双光子荧光显微成像在活体生物组织及细胞中的成像都得到了广泛的应用。 非线性双光子光学成像中存在另 一 种重要模式_ 二次谐波(Second-HarmonicGeneration， SHG) 。 SHG现象首度被Franken等于1961年发现当两个具有相同基频的光子与具有非对称结构的样品相互作用时，散射产生恰好双倍于激发频率的二次谐波光信号(半波长，双倍能量)。 SHG与TPF—样，是一种非线性光学现象，因为它的产生效率(p)与激发光(I)的强度成非线性平方依赖关系(P= al2)，因此它同样具有形成高分辨率非线性光学成像的基础，从而拥有双光子激发荧光成像的所有优点。但双光子荧光信号与二次谐波信号在彼此特点上有所不同。由于与双光子荧光产生所涉及的吸收和再发射过程不同，SHG为相干散射过程，因此与荧光成像相比，SHG还具有其特殊的优势由于不涉及能级的跃迁，SHG中没有能量的损失，理论上完全消除了光致毒性和光漂白，可长时间作用于活体细胞而不损伤细胞的功能。同时，生物组织中存在大量的内源性SHG成份，因此不需要添加外源性的标定物，最大程度地降低了对生物组织的可能损伤及干扰。 需要说明的是，二次谐波在生物组织的大量应用中(主要是胶原纤维)，与本发明最直接相关联的是Sh印pard等在分散的DNA成份中得到了 SHG成像(如图l所示)(鲱鱼精细胞，购至Sigma公司)(R. Gauderson， P. B. Uikins， C. J. R. Sh印pard，Simultaneousmultichannel nonlinear imaging :combined two—photon excitedfluorescence andsecond—harmonic generation microscopy, Micron 32 :685-689(2001))。
在成像设备上，与单光子共焦显微成像，双光子荧光显微成像使用不同的激光光源。由于需要满足同时吸收两个光子的能量与单光子时吸收一个光子的等效能量匹配，一般采用长波长(低能量)的近红外(Near-Infrared)光代替单光子激发时具有较短波长(高能量)的蓝紫色或紫外光激发。同时飞秒(Femtosecond, 10—15s)脉冲激光器产生的飞秒脉冲光源是近年来较为常见使用的双光子激发光源。 在一套双光子成像系统中，可同时实现双光子荧光成像和二次谐波成像。
美国专利US2005/0259A1公开了一种双光子荧光和二次谐波显微成像系统。该系统可实现同一激发光源激发，同时记录双光子荧光和二次谐波信号(系统同时收集前向传播的二次谐波信号和背向传播的荧光信号)。系统的基本组成为Ti:S即pire(TS)激光器(激发波长为760-880nm)， 一个Berek偏振补偿仪，扫描箱，和一个聚焦物镜(0. 45 1. 3NA)。对于收集系统，TPF是共轭收集从样品发出的荧光，由分光镜和发射滤光片分成适合的波长通道后通过光电倍增管收集。占前向主导传播的二次谐波通过物镜(0.95NA)和平凸镜，并通过使用带通和蓝光滤波片将二次谐波信号从激发光和荧光中分离。光电倍增管与计算机相连获取数据。 美国专利US6208886B1公开了另一种可同时实现双光子荧光信号和二次谐波信号探测的光学系统示意图(同一激发光源激发)，该系统中双光子荧光信号和二次谐波信号同为背向收集方式，扫描实现为台架移动方式。移动台架实现样品的3D移动扫描。激发光源经反光镜至分光镜后，进入物镜聚焦于样品，样品背向传播的荧光和二次谐波信号透过分光镜，经透镜聚焦后经带通滤波片由光电倍增管收集。图2为使用该光学系统从鸡肌纤维中得到的在100fs脉冲，625nm激发波长激发下的非线性光谱，同时获得了 SHG信号和双光子荧光信号。

发明内容
本发明的目的在于提供一种无需对细胞核进行额外染色的活细胞核质成像的方法。 本发明的另一个目的是提供上述活细胞核质成像的方法在活细胞核质信号传导通路监测中的应用。
—种活细胞核质成像的方法包括如下步骤 (a)用经显微镜聚焦的近红外飞秒激光照射活细胞； (b)活细胞经显微镜聚焦的近红外飞秒激光的作用下产生双光子荧光及二次谐波光； (c)同时对双光子荧光及二次谐波光显微成像，双光子荧光显微成像被荧光标定的目标分子，二次谐波光显微成像细胞核。 进一步地，所述近红外飞秒激光的波长为800 850nm。 上述活细胞核质成像的方法在活细胞核质信号传导通路监测的应用，双光子荧光显微成像示踪被荧光标定的目标分子的分布和迁移，二次谐波光显微成像示踪细胞核，从而监测活细胞核质信号传导通路。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 (1)用双光子荧光显微成像(TPF)示踪目标分子的活动，同时二次谐波显微成像(SHG)定位细胞核(DNA)的位置，两者的结合可以准确地监测剌激对目标分子的诱导和调控过程。由于多光子的特性——特别是利用内源性的细胞核(DNA)的SHG成像，理论上消除了光致毒性和光漂白——可以对活体细胞进行较长时间的观察而不至影响细胞的活性、最大程度地维持了细胞的功能环境，从而真正实现动态地、清晰地、活体状态下观察目标分子在微小外部干扰下在细胞质与细胞核间转运的过程。 (2)利用TPF和SHG同时成像，尤其是利用内源性的细胞核SHG成像技术来探讨目标分子调控通路的研究，除在肿瘤产生机制的细胞分子水平层面研究中有广阔作用外，在传统中药的药效机制研究中也有颇具吸引力的应用前景。


图1为鲱鱼精细胞细胞核中DNA的SHG成像。 图2是从鸡纤维中利用双光子光学成像系统同时获得的二次谐波信号(SHG)和双光子荧光信号(TPF)。 图3为HeLa癌细胞(倒掉培养液PBS，造成细胞膜破损后的细胞)在830nm的近红外飞秒激光激发下的SHG成像(成像波谱范围为405-425nm)。 图4为HeLa癌细胞(倒掉培养液PBS，造成细胞膜破损后的细胞)透射光成像。
图5为HeLa癌细胞(倒掉培养液PBS，造成细胞膜破损后的细胞)所在区域在830nm的近红外飞秒激光激发下的光谱(376_550nm)。 图6是本发明用于研究转录因子在核质间转运的双光子荧光和二次谐波非线性光学显微成像技术路线。 图7是本发明用于监测荧光标定的转录因子在核质间转运时拟采用的双光子荧
光和二次谐波显微成像组合光学系统示意图。 图8NF-KB在细胞质与细胞核间转运示意图。 图9JAK/STAT信号通路示意图。 图IO类固醇受体信号通道示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地描述。 图1为鲱鱼精细胞细胞核中DNA的SHG成像。购至Sigma公司的鲱鱼精细胞DNA在蒸馏水中分散并固定。图像大小为43x43um。激发波长为800nm，照射于样品上的激光功率< 15mW。此

细胞核的DNA成份为内源性(无需额外染色)SHG信号来源材料。
图2使用实现双光子荧光信号和二次谐波信号探测的光学成像系统(美国专利No. 6208886B1)从鸡肌纤维中得到的非线性光谱(100fs脉冲，625nm激发波长下激发)，同时获得了二次谐波信号(SHG)和双光子荧光信号(TPF)。需要说明的是，该图例结果表明同一双光子光学成像系统可以同时实现双光子荧光信号和二次谐波信号的探测，但该二次谐波信号来自纤维组织，并非细胞核或DNA成份。 图3为HeLa癌细胞(倒掉培养液PBS，造成细胞膜破损后的细胞)在830nm的近红外飞秒激光激发下的SHG成像(成像波谱范围为405-425nm)。对比图4所示的细胞透射光成像以及图5所示的光谱特性，我们可以看出图2所得图像为具有明显轮廓的细胞核，同时确定形成该图像的信号来源为SHG信号。 图4为HeLa癌细胞(倒掉培养液PBS，造成细胞膜破损后的细胞)的透射光成像。
图5为HeLa癌细胞(倒掉培养液PBS，造成细胞膜破损后的细胞)所在区域在830nm的近红外飞秒激光激发下的光谱。根据SHG的光谱特性，其中的狭窄峰(415nm)为SHG信号表征。此图例说明DNA形成的完整细胞核同样可以作为内源性SHG信号来源材料，进一步证实在本发明中希望借助于细胞核内源性SHG信号定位细胞核位置，显示细胞核轮廓，从而示踪目标分子在核质间转运的可行性。 图6是本发明用于研究转录因子在核质间转运的双光子荧光和二次谐波非线性光学显微成像技术路线。在本发明中，能清楚地观察转录因子(如核因子NF-kB)从细胞质向细胞核的转运，因此一方面能在活体细胞中示踪转录因子的运动；同时有清晰的细胞核轮廓来显示转录因子的运动位置。因此，二次谐波信号将结合双光子荧光信号来共同实时跟踪观察转录因子在活体细胞中由细胞质到细胞核调控通路的全过程。双光子荧光信号示踪荧光标定的转录因子(如核因子NF- k B-GFP融合蛋白)的活动，SHG信号同时成像细胞核的位置及轮廓，因此组合的双光子成像可以实时地监控转录因子的活动，进而利用转录因子的活动通道探索与其相关的各类机制。 图7是一种实现本发明的对于活细胞中特定蛋白、离子、分子等在细胞质和细胞核之间转运的双光子荧光和二次谐波显微成像组合光学系统示意图。该光学系统可同时实现双光子荧光TPF监控特定蛋白、离子、分子，二次谐波显微成像SHG显示细胞核位置轮廓。双光子荧光和二次谐波同为背向收集方式。光学系统由飞秒脉冲激光光源和双光子显微成像系统(Leica TCS SP2)共同组成。激光器为Ti : S即phire自锁模飞秒激光器(波长可调范围700 1100nm，脉冲宽度为110fs，脉冲重复频率76MHz， Coherent Mira 900-F);激发光被分光镜DBS反射后进入扫描物镜(聚焦物镜，水浸UplanApo/IR，60X ， NA = 1. 25，Olympus)，通过物镜聚焦于样品，样品产生的背向传播的双光子荧光和二次谐波光通过同一物镜收集，由滤波片(IR禁通，KP650，Zeiss)阻断激发光后经透镜聚焦，通过棱镜分光仪分光(可探测的光谱范围为400-850nm)。通过狭缝的各单色光通过PMT采集，分别成像双光子激发荧光和二次谐波光，从而实现高通量地观察标定目标蛋白在细胞质与细胞核间的活动过程。X、Y扫描为光扫描装置，实现X、Y方向光束的移动扫描，Z方向的扫描通过移动台架实现。 图8是NF-kb在细胞质与细胞核间转运示意图。核因子k b(多指p65、p50形成的异源二聚体)，通常与其抑制蛋白(NF-KBinhibitor，lKB)形成三聚体(NF-kB/IkB)，以失活(即无生物学活性)状态存在于细胞质中。在剌激作用下，I k B被I k B激酶(I k Bkinase, IKK)磷酸化后再被蛋白酶降解，核因子k B逐步从三聚体上释放出来，迅速移位入细胞核(核易位存在于细胞浆中的蛋白被激活后，通过核膜进入细胞核内发挥生物活性的过程)，与靶基因上启动子区KB位点发生特异性结合，从而启动和调控相应基因(如各种细胞因子如TNF-a、粘附因子及极早蛋白等)的转录。利用基因重组技术标定的NF-KB表达荧光蛋白GFP，因此利用双光子荧光成像示踪该目标分子NF-KB的活动，在同一光学成像系统中同时成像同一细胞核的位置和轮廓，因此可精确监控目标分子NF- k B在核质间的调节通路。 图9是JAK/STAT信号通路示意图。JAK(Ja皿s激酶)-STAT (信号转导子和转录激活子)信号通路是与细胞生长、增殖和分化关系十分密切的一条信号通路，其信号传递的基本过程可概括为细胞因子与其相应受体结合；受体和JAKs发生聚集，临近的JAKs相互磷酸化而被激活；JAKs的JH1结构域催化STATs上相应部位的酪氨酸残基磷酸化，同时STATs的SH2功能区与受体中磷酸化的酪氨酸残基作用而使STATs活化；STATs进入核内同其他一些转录因子相互作用从而调节基因转录。利用相应的荧光技术标定技术(基因重组技术、免疫荧光技术、量子点标记技术)对STATs进行荧光标记，获得具有荧光特征的STATs目标分子，在此基础上结合本发明提供的成像方法追踪目标分子STATs的活动，可准确地揭示STATs在活细胞状态下穿越核膜启动相应基因表达的调控过程。STATs分子的跨膜转运就是通过同一光学系统中TPF/SHG所确定的核质边界进行监测的。
图IO类固醇受体信号通道示意图。图中，H指配体(类固醇激素)，HSP90指热休克蛋白(Heat Shock Protein) ，HRE指激素反应元件(Hormone Response Element)。类固醇激素包括糖皮质激素、盐皮质激素、雄激素、雌激素、黄体素。类固醇激素分子量小，不容于水而溶于脂溶剂中，易于通过简单扩散而透过细胞膜的脂质层进入细胞浆。进入细胞内的类固醇激素先与细胞浆中的特异性受体激活形成类固醇-受体复合物，胞浆类固醇受体是蛋白质，分子量介于50000 150000之间，具有高度特异性，可识别类固醇结构上的微小差别，所以任意靶细胞的胞浆受体只能与相应的类固醇激素结合，而对其他类固醇激素仅有轻微的亲和力或完全不与之结合。类固醇激素与特异的受体蛋白结合后，受体蛋白的构象发生变化，由原来的非活性形式转变为活性形式，才能转移至细胞核内。已活化的受体均以二聚体的形式与靶基因中的激素反应元件(HRE)结合，从而发挥其转录调节作用。该信
号通路中类固醇受体是信号传递的重要蛋白分子。为了描述该类固醇受体活化后核易位的过程，采用本发明提供的双光子荧光成像技术结合二次谐波成像技术对类固醇受体的核质
分布进行准确的监测，仍需对类固醇受体蛋白进行有效的荧光标记，标记的方法同样可以是转录前的基因重组标记或转录后的免疫荧光标记等。通过在同一光学系统中对体外培养的特定细胞进行TPF/SHG成像，不需其他附加步骤，直接获得细胞质和细胞核的位置信息，也就相应获得了荧光标记类固醇受体分子在核质间分布情况，从而推断标记分子的转移过程。 实施例1 本发明的第一个实施例为利用本发明方法观察人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)中通过基因重组技术GFP标定的NF-KB在核质间的转运过程-肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor， TNF)作为NF-kB信号通路的激活剂。 人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)的培养细胞培养液为RPMI 1640，添加15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺(Glutamine) 、25mmol/L HEPES、 100IU/ml青霉素和100mg/mL链霉素。进行细胞转染时，将30% 50%汇聚的人肺腺癌细胞与Lipofectin试剂和足量的重组质粒载体(Vienna大学Schmid教授惠赠)的悬浮液共培养6h，之后补充适量新鲜培养液扩增培养。转染的过程就是对细胞内特定分子进行标记的过程，本专利采用基因重组的办法对分子进行荧光标定，将绿色荧光蛋白(GFP)基因与目标分子的基因进行重组连接，将结合后的基因(外源基因)转染导入宿主细胞，此外源基因在宿主细胞的表达产物就是NF-kB与GFP结合在一起的融合蛋白，该标记方法对目的分子本身的功能及宿主细胞的生理状态基本不会产生影响，通过监测荧光分布的变化即可示踪目标分子的转移过程。
上述转染细胞(5ml培养皿)经48h培养后，直接放在双光子激光共焦显微镜载物台(具备细胞工作站系统以维持培养环境)上，使用高倍率水镜镜头(UplanApo/IR，60X，NA = 1. 25， Olympus)直接浸入培养液进行TPF和SHG观测，近红外飞秒激光的波长选用830nm。 首先对静息状态下培养细胞中荧光强度在核质间的分布情况并进行实时记录，之后马上在培养液中添加终浓度为5ng/ml的肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)作为NF-kB信号通路的激活剂，该剌激信号经膜表面受体传递给NF-kB/I-kB复合物，导致I-kB磷酸化并降解，释放NF-kB使其核转移位点暴露进而易位到细胞核并启动相关基因的转录并翻译成蛋白质，从而实现细胞对外界剌激的反应(见图6)。这一过程的变化是由与NF-kB所挂接的GFP荧光分子的位置变化所反映的，当实验所观测到的细胞质荧光强度减弱而细胞核荧光强度增加则反映出该信号通道被激活并发挥了相应的反馈调节作用。
实施例2 本发明的第二个实施例为利用本发明观察人淋巴细胞中通过基因重组技术GFP标定的STAT在核质间的转运过程_干扰素(Interferon)作为信号通路STAT的激活剂。
使用淋巴细胞作为验证JAK/STAT信号通路的宿主细胞系。全血来自血站的健康捐血者，肝素抗凝血液通过淋巴细胞分离液分离获得淋巴细胞。淋巴细胞培养液使用RPMI1640，添加10%胎牛血清、HEPES、抗生素、白细胞介素_2 (IL_2)、植物凝集素(PHA)。转染载体的构建将STATs家族(STAT 1 6)的基因克隆到质粒载体pEGFP-Cl (Catalog恥084-l，Clontech)的羧基末端。Lipofectin试剂和足量的重组质粒载体与上述体外培养的淋巴细胞进行共培养6h。转染的过程就是对细胞内特定分子进行标记的过程，将绿色荧光蛋白(GFP)基因与目标分子的基因进行重组连接，将结合后的基因(外源基因)转染导入宿主细胞，此外源基因在宿主细胞的表达产物就是STAT与GFP结合在一起的融合蛋白，通过监测荧光分布的变化即可示踪目标分子的转移过程。
上述转染细胞(5ml培养皿)经48h培养后，直接放在双光子激光共焦显微镜载物台(具备细胞工作站系统以维持培养环境)上，使用高倍率水镜镜头(UplanApo/IR，60X，NA = 1. 25， Olympus)直接浸入培养液进行TPF和SHG观测，近红外飞秒激光的波长选用800nm。 本实施例采用干扰素(Interferon)作为信号通路剌激物。干扰素是病毒进入机体的诱导宿主细胞产生的反应物，它从细胞释放后可促使其他细胞抵抗病毒的感染。将微量(终浓度5ng/ml)的干扰素添加到经转染处理的体外培养淋巴细胞中后，干扰素与细胞表面的干扰素受体相结合，结合干扰素后受体亚基发生二聚化或多聚化，并影响与之耦联的JAKs，激活JAKs的自磷酸化。这样，JAKs成为了一个相互转移磷酸基过程中的底物，它们的催化功能因为JH1结构域活化环上的酪氨酸残基的磷酸化而被激活，进而激活细胞质中非活化形式的STATs单体使之磷酸化。活化的STAT形成二聚体，并且还结合有GFP荧光标记，分子量较大，进入细胞核必须要经过核孔复合体(NPC)，这种穿越核膜的方式必须借助输入子(Importin)进行，而STAT与Improtin相互识别并发生作用的前提条件就是STAT的活化，因此干扰素信号经过一系列的传递最终使活化的STAT进入细胞核，进而启动相关基因的表达。表达的结果引起各类淋巴细胞的增殖，去对抗侵入体内的细菌、病毒、异物，或对肿瘤细胞进行攻击。
实施例3 人骨骼肌细胞的培养细胞培养液为DMEM，添加10 %胎牛血清、5uM生长因子(GrowthFactor) 、2mM谷氨酰胺(Glutamine) 、25mmol/L HEPES、 100IU/ml青霉素和lOOmg/mL链霉素。进行细胞转染时，将30% 50%汇聚的人骨骼肌细胞与Lipofectin试剂和足量的重组质粒载体的悬浮液共培养6h，之后补充适量新鲜培养液扩增培养。转染质粒的构建将雄激素受体基因插入到商品化的EGFP质粒载体氨基末端，将绿色荧光蛋白(GFP)基因与雄激素受体基因进行重组连接，将结合后的基因(质粒载体)转染导入骨骼肌细胞，此外源基因在骨骼肌细胞的表达产物就是雄激素受体与GFP结合在一起的融合蛋白。当使用雄激素对上述体外培养的骨骼肌细胞进行剌激时，通过监测荧光分布的变化即可示踪目标分子的转移过程，由于雄激素对于骨骼肌细胞的生长有强烈的剌激作用，可使启动该信号通路的体外培养的骨骼肌细胞的增殖水平相对于正常培养状态下有明显的增强。
上述转染细胞(5ml培养皿)经48h培养后，直接放在双光子激光共焦显微镜载物台(具备细胞工作站系统以维持培养环境)上，使用高倍率水镜镜头(UplanApo/IR，60X，NA = 1. 25， Olympus)直接浸入培养液进行TPF和SHG观测，近红外飞秒激光的波长选用850nm。 培养细胞放入测试系统后，首先寻找表达质粒载体的细胞(即通过荧光显微镜搜索具有荧光特征的细胞)，使用本专利提出的TPF/SHG组合的方法对核质间的荧光分布进行实时记录。之后在培养液中添加终浓度为10、20、50ng/ml的雄激素作为该类固醇受体信号通路的激活剂，该激活剂直接穿过质膜进入胞浆，并特异性的与标记了荧光蛋白的雄激素受体结合，引起受体变构导致结合在雄激素受体上的热休克蛋白二聚体脱离并暴露出其DNA结合区，使受体从无活性形式转变为能与DNA相互作用的活性形式，活化后的受体蛋白均以二聚体的形式与靶基因中的激素反应元件(HRE)结合，HRE为一较短的特异性DNA序列，多位于启动子附近， 一般在转录起始位点上游400bp内，它示DNA与受体结合的关键部位，即DNA与受体的识别部位，HRE与雄激素受体的结合将导致一系列下游基因的表达，结果之一就是诱发骨骼肌细胞的生长、增殖。 从前面的讨论中很清楚地看出，基于其它的生物学方法实现的荧光探针标定，例如免疫荧光方法，而不是单纯地基于基因重组的标定方法，以及其它的荧光探针，例如近年来使用的"量子点(Quantum dots)"标记；被标记对象不局限于核因子NF-k B的其它蛋白、分子、离子；同时还包括其它剌激成分(如中药)引起的蛋白、分子、离子的监控，当使用双光子荧光来示踪该标记物，同时使用二次谐波成像细胞核，来观察该标记物在细胞质与细胞核之间的转运过程，也被本发明的范围所涵盖。
权利要求
一种活细胞核质成像的方法，其特征在于包括如下步骤(a)用经显微镜聚焦的近红外飞秒激光照射活细胞；(b)活细胞经显微镜聚焦的近红外飞秒激光的作用下产生双光子荧光及二次谐波光；(c)同时对双光子荧光及二次谐波光显微成像，双光子荧光显微成像被荧光标定的目标分子，二次谐波光显微成像细胞核。
2. 根据权利要求1所述的活细胞核质成像的方法，其特征在于所述近红外飞秒激光的波长为800 850nm。
3. 权利要求1所述活细胞核质成像的方法在活细胞核质信号传导通路监测的应用。
全文摘要
本发明公开了一种活细胞核质成像的方法，包括如下步骤(a)用经显微镜聚焦的近红外飞秒激光照射活细胞；(b)活细胞经显微镜聚焦的近红外飞秒激光的作用下产生双光子荧光及二次谐波光；(c)同时对双光子荧光及二次谐波光显微成像，双光子荧光显微成像被荧光标定的目标分子，二次谐波光显微成像细胞核。本发明还公开了上述活细胞核质成像的方法在活细胞核质信号传导通路监测的应用。本发明消除了光致毒性和光漂白，可以对活体细胞进行较长时间的观察而不至影响细胞的活性、最大程度地维持了细胞的功能环境。本发明可应用于肿瘤产生机制的细胞分子水平层面研究，以及传统中药的药效机制研究。
文档编号G01N33/48GK101738462SQ20081021908
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月14日 优先权日2008年11月14日
发明者邓小元, 金鹰 申请人:华南师范大学