专利名称：组合物、装置和相关方法
组合物、装置和相关方法
相关申请的交叉引用 在药学研究、临床诊断、食品和饮料质量监测、水净化、 土壤、水及空气污染监测、或者在化学战剂或生物战剂检测等各种应 用中，可能都需要对化学分析物及生物分析物进行检测。
0004可使用能特异性识别分析物的分子(探针)，对一种或多 种化学分析物或生物分析物进行4企测。可通过两种分子(例如酶与底 物、抗体与抗原等)间的高度特异性相互作用来识别。可利用合适的检 测手段来检测识别反应是否发生，作为分析物存在与否的指示。在某 些应用中，分析物可能以极低浓度存在，探针和分析物间的识别事件 可能不易检出。可采用分析物扩增技术来提高原本难以精确定量的分 析物的浓度。在某些分析物检测技术中，探针与分析物间的识别可以 是部分的或者可以不是完全特异性的，导致假阳性。
图8是根据本发明的一个实施方案的组合物的示意图。
-丙酰胺、2，2'-偶氮双(N,N'-二亚甲基异丁脒)二盐酸盐、2，2'-偶氮双 (2-酰氨基丙烷)二盐酸盐、2,2'-偶氮双(N，N'-二亚曱基异丁酰胺)、2,2'-偶氮双(2-甲基-N-[l,l-双(羟曱基)-2-羟乙基]丙酰胺)、2,2'-偶氮双(2-曱 基-N-[ 1 ， 1 -双(羟曱基)乙基]丙酰胺)、2，2'-[2-曱基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]、 2，2'-偶氮双(异丁酰胺)二水合物、2,2'-偶氮双(2,2,4-三甲基戊烷)、2，2'-偶氮双(2-曱基丙烷)、过氧乙酸叔丁酯、过氧苯曱酸叔丁酯、过氧辛 酸叔丁酯、过氧新癸酸叔丁酯、过氧异丁酸叔丁酯、过氧新戊酸叔戊 酯、过氧新戊酸叔丁酯、过氧二碳酸全异丙酯、过氧二碳酸二环己酯、 二异丙苯基-过氧化物、二苯曱酰基过氧化物、二月桂酰过氧化物、过 二^5危酸钾、过二辟^酸铵、连二次硝酸二^又丁酯或连二次硝酸二异丙苯 酯。光化学引发剂的合适实例可包括安息香衍生物、二苯曱酮、酰基 膦氧化物和光氧还系统。氧化还原引发剂的合适实例可包括氧化剂(例 如过二硫酸钾、过氧化氬、叔丁基氢过氧化物)或还原剂(例如铁(II)、
钛(in)、碌L代亚辟b酸钾、亚碌b酸氢钾)或其组合。0080] 在一个实施方案中，引发剂可包括ATRP引发剂。ATRP 引发剂可包括烷基卣和过渡金属络合物(金属配体络合物)的组合。过 渡金属络合物可与引发剂和休眠聚合物链(dormant polymer chain)— 起参与氧还循环，但不与聚合物链形成直接碳-金属键。过渡金属络合 物可选自Cu(I)/Cu(n)、 Fe(II)/Fe(III); Ru(II)/Ru(111)、 Cr(II)/Cr(III); Mo(0)/Mo(I); Mo(II)/Mo(III); W(II)/W(III); Rh(III)/Rh(IV); Co(I)/Co(H)、 Re(II)/Re(III); Ni(0)/Ni(I); Mn(III)/Mn(IV); V(II)/V(III); Zn(I)/Zn(II); Au(I)/Au(II);和Ag(I)/Ag(11)。配体的合适实例可包括联吡啶、烷基取 代的联吡啶衍生物、烷基吡啶亚胺(例如N-(丙基)-2 25吡啶基甲亚胺 (methanimine))、三胺、四胺(例如N,N，N',N",N"-五曱基二乙撑三胺和 三(2-(二曱氨基)乙基(胺))。在一个实施方案中，引发剂可引发直接 ATRP反应类型。在一个实施方案中，引发剂可引发间接ATRP反应 类型。间接ATRP引发剂可包括自由基引发剂和金属卣化物配体络合 物。在一个实施方案中，引发剂可包括烷基溴和CuCl络合物。CuCl 络合物可包括联吡啶配体或三(2-(二曱氨基)乙基(胺))配体。在一个实施方案中，引发剂可包括ROMP引发剂。 ROMP引发剂可包括金属亚烷基催化剂。在一个实施方案中，ROMP 《1发剂可包括一种或多种具有下式(I)至(VI)的分子或其衍生物。
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(I)
萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、伊红、伊红衍生物例如异硫氰酸伊红、赤藓红、 赤藓红衍生物例如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；乙锭；荧光素和衍生 物例如5-羧基荧光素(FAM)、 5-(4,6-二氯三溱-2-基)氨基荧光素 (DTAF)、 2'7'-二曱氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫 氰酸荧光素(FITC)、 QFITC (XRITC);荧光胺衍生物(与胺反应时发荧 光)；IR144; IR1446;异硫氰酸孔雀绿；4-曱基伞形酮；邻曱酚酞； 硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红、B-藻红蛋白；邻苯二曱醛衍生物(与 胺反应时发荧光)；芘和衍生物例如芘、芘丁酸和1-芘丁酸琥珀酰亚胺 基酯；活性红4 (Reactive Red 4) (Cibacron. Brilliant Red 3B-A)、罗丹 明和衍生物例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、 6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝 胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰 酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101磺酰 氯衍生物(德克萨斯红)；N,N，N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA); 四曱基罗丹明、四曱基异硫氰酸罗丹明(TRITC);核黄素；玫红酸和 镧系螯合衍生物、量子点、花青素和方酸菁。荧光团的一些其它实例 可包括一种或者一种或多种以下荧光团荧光素、罗丹明、德克萨斯 红、VECTORRed、 ELF(酶标记的荧光)、Cy2、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy7、 FluorX、钩黄绿素、钙黄绿素-AM、 CRYPTOFLUOR、 Orange (42 kDa)、 Tangerine (35 kDa)、 Gold (31 kDa)、 Red(42kDa)、 Crimson (40 kDa)、 BHMP、 BHDMAP、 Br画Oregon、 Lucifer Yellow、 Alexa染料家 族、N-[6-(7-硝基苯-2-氧杂-l,3-二唑-4-基)氨基]己酰基](NBD)、 BODIPY、硼二吡咯亚曱基二氟化物(boron dipyrromethene difluoride)、 Oregon Green、 MITOTRACKER. Red、 DiOC(3)、 DiIC.sub.18、藻红 蛋白、藻胆蛋白BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa)、 Spectrum Blue、 Spectrum Aqua、 Spectrum Green 、 Spectrum Gold、 Spectrum Orange、 Spectrum Red、 NADH、 NADPH、 FAD、红外(IR)染料、环状GDP-核糖(cGDPR)、 CalcofluorWhite、丽丝胺、伞形酮、 酪氨酸或色氨酸。 在一个实施方案中，聚合物前体可包括一个或多个带有 信号发生器标记的单体。信号发生器标记的单体的合适实例可包括-荧光团标记的单体。荧光团标记的单体的一些实例可包括花青素标记 的单体或荧光素标记的单体。根据本发明的一个实施方案的信号发生 器标记的聚合物前体的 一些实例可包括具有下式(XIII)至(XVI)的结 构。
(XIII)
= 0.5 mg/pl, CuCl :Me6TREN= 1:1.5)。在额外的冷冻-泵-融化循环后，在氮气下加 入引发剂修饰的石英玻片，然后进行最后一次冷冻-泵-融化循环。在 室温下聚合过夜。从反应混合物中取出石英玻片，依次用去离子水、 DMF和NaHC03/Na2C03緩冲液漂清并风干。然后用Perkin-Elmer LS55发光分光计，在460 nm处用激发峰测定荧光谱。
(XXII)
Me6TREN
60(XXIII) MPEO， Mw = 300
实施例14.在引发剂修饰的磁颗粒上，非荧光单体(MPEO)和荧光单 体(FITC-MA)的表面引发的ATRP共聚。 = 0.5 mg/|aL, CuCl:Me6TREN =1:1.5),使混合物发生反应但无需搅拌过夜。用磁铁收集氧化铁颗粒， 再依次用去离子水洗涤3次，用NaHC(VNa2C03緩沖液(pH = 9.6)洗 涤2次。用Perkin-Elmer LS55发光分光计，在NaHC03/Na2C03緩冲 液中，在460 nm处激发而测定荧光语。
实施例IS.在引发剂修饰的石英玻片上，非荧光单体(MPEO)和荧光 单体(FITC-MA)的表面引发的ATRP共聚，以观察猝灭效果。 = 0.5 mg/nL, CuCl:bpy= 1:1.5),将混合物移入放有引发剂(例如 引发剂修饰的石英)的反应室中。聚合过夜后，通过用过量水漂清石英 而猝灭反应物。该过程得到赖氨酸标记的聚合物，见图21。乙烯基苯曱酸在支持性ATRP引发剂石英表面上的聚
合。将乙烯基苯曱酸即VBA (0.500 g, 3.38 mmol)溶于含有0.126 g碳 酸氢钠和0.130 g氢氧化钠的1.5 mL脱气去离子水中，形成澄清溶液。 将CuBr (9.9 mg， 0.138 mmol)、 CuBr2(5.1 mg， 0.023 mmol)和2， 2'-联p比 啶(32 mg， 0.207 mmol)加入到同时装有来自实施例7的ATRP引发剂 修饰的石英玻片和未修饰的对照玻片的小管中。小管用橡胶隔片密封 并脱气。再将单体溶液移入小管中，温和振摇后形成均匀的褐色溶液。 在室温下聚合过夜。从反应混合物中取出石英玻片，依次用去离子水、 DMF和去离子水漂清并风干。记录玻片的紫外-可见光谱(见图23)。 对表面结合的聚(乙烯基苯曱酸)的观察。为了使玻片表 面染色，将季铵化(quarternized)聚芴-嵌段-聚(曱基丙烯酸二曱氨基亚 乙酉旨)溶于1:1 DMSO/水中，形成4 mg/mL澄清溶液。将玻片在溶液 中浸泡15分钟，再用去离子水充分漂清。然后在吸收峰处或其附近(在 该情况下为约375 nm)激发，测定荧光谱(图23)。标记后，表面引发 的聚合(SIP)反应产物的吸光度大于对照。SIP聚合物在标记后的荧光 强度大于对照的荧光强度和SIP聚合物在标记前的荧光强度。 使用表面固定的ROMP催化剂引发单体混合物(1M)的 聚合反应1:10摩尔比的Cy5-降冰片烯(结构XVI)和葡糖酸降水片烯 (结构XVIII)。表面固定的ROMP催化剂也用于引发1M单体混合物 的聚合反应1:10摩尔比的Cy5-PEG-降冰片烯和葡糖酸降冰片烯(结 构XVIII)。用胺(浓度为1% (v/v)和10% (v/v))对具有单层Cy5-NHS的 石英玻片进行表面官能化，作为对照。 石英玻片用10% (v/v) 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和90% 三曱氧基硅烷(TMS)修饰。在THF溶液，通过ROMP方法，将ATRP 引发剂(降水片烯-溴异丁酸曱酯)与降水片烯-NHS和乙酸降冰片烯酯 共聚合，通过NH2-NHS反应，将所得大引发剂移入到胺包被的石英 表面上。所得固定在石英表面上的溴官能化降水片烯聚合物再经历 ATRP聚合反应(使用Cu(I)Cl、 Cu(II)Br2和2，2，-联吡啶(1:0.3:2)催化剂， 浓度为25 mM)。所用单体是FITC-MA和MPEO (1:20,摩尔比)，浓 度为1 M。=CHPh 催化剂引发ROMP反应。
实施例23.在同 一反应混合物中，在THF中同时进行ATRP和ROMP=CHPh催化剂引发ROMP反应。
实施例24.通过来自互补DNA-反义DNA杂合体的荧光单体和非荧光 单体的表面引发的ATRP反应，进行分析物检测。
0225用生物素化DNA序列作为分析物，用链霉抗生物素颗 粒作为基底，将DNA序列分析物固定在基底上。探针与分析物杂交 之前，使具有5，端NH2残基的反义DNA探针序列与NHS-ATRP引发 剂反应。然后在DNA分析物和反义DNA探针间进行杂交反应。杂交 进行5小时。杂交反应后，使用Cu(I)Cl、 Cu(II)Br2和2，2，-联吡啶 (l:0.3:2.9)催化剂(浓度为25 mM),分析物-探针杂交体经历ATRP反 应。所用单体为FITC-MA和MPEO(l:20,摩尔比)，浓度为1 M。
饰的链霉抗生物素颗粒杂交并用作对照。图27是对照样品和试验样 品使用ATRP聚合的示意图。图28显示用表面引发的聚合反应(SIPS) 制备的试验样品和具有单个染料的对照样品的荧光强度。当与具有单 个染料分子的样品相比，SIPS-样品表现出几乎1.5倍的信号强度。
实施例25.用能结合两种不同分析物的两种探针的多重检测。 本发明的分析物;险测实施例类似于实施例24，除了本实 施例包括能识别同一分析物(互补DNA序列)上的不同结合位点的多 种化学上不同的探针(不同的反义DNA序列)之外。在本实施例中，化 学上不同的各类型的探针连接在化学上不同的引发剂上。例如，与分 析物DNA中的互补序列结合的第 一反义DNA序列可与ATRP S1发剂 结合，而与分析物DNA中的不同互补序列结合的第二反义DNA序列 可与ROMP引发剂结合。根据本实施例，使样品暴露给第一和第二反 义DNA序列，因而允许任何互补DNA序列的存在，以结合反义DNA 序列。再将DNA/DNA杂合体连续暴露在ATRP和ROMP反应条件 下，因而通过ATRP形成第 一聚合物，并通过ROMP形成第二聚合物。 观察来自第一聚合物和第二聚合物的重合信号。因此，可准确区分同 一样品中分析物的存在并进行定量测定。 本发明说明书或其权利要求书中所涉及的用化学名称 或化学式表示的反应物和组分，无论是单数还是复数，在与用化学名 称或化学类型表示的另 一物质(例如另 一反应物或溶剂)接触之前，都 可以鉴定出它们的存在。在所得混合物、溶液或反应介质中发生的初 步和/或过渡的化学变化、转化或反应(如果有的话)，可以鉴定出中间 体、母体批次等，并且可具有与反应产物或终产物用途不同的用途。 将指定反应物和/或组分在本公开内容给出的条件下混合在一起，可导 致其它后续变化、转化或反应。在这些其它后续变化、转化或反应中， 被混合在一起的反应物、成分或组分可鉴定或指示反应产物或终产 物。
[0231上述实施例是为了说明本发明的某些特征。所附权利要 求书是用来要求保护其范围同所构思的那样宽的发明，并且本文所给 出的实施例是用于说明从所有可能的许多实施方案中精选出的实施 方案。因此，申请人的目的是所附权利要求书并不限于由所选出的所 用实施例来说明的发明特征。本发明权利要求书所用的术语"包括(包 含、含有)，，及其语法变体在逻辑上也包含和包括变化程度不同的短语， 例如但不限于"基本上由……组成"和"由……组成"。必要时，可 补充范围予以说明，这些范围包括所有介于两者之间的小范围。可以 预期在这些范围中的变化会向具有公众并不知道的所属领域普通技 能的技术人员表明它们自身，所附权利要求书将涵盖这些变化。科技 进步会带来可能的等同实施方案和替换，而这些等同实施方案和替换 因语言描述不够准确的原因并未涵盖在其中；所附权利要求书也应当 涵盖这些变化。
权利要求
1.一种组合物，所述组合物包含第一探针；与第一探针结合的第一引发剂组分；第二探针；和与第二探针结合的第二引发剂组分，其中第一探针和第二探针能与同一分析物结合，和当第一引发剂组分和第二引发剂组分彼此接近且当第一探针和第二探针与分析物结合时，第一引发剂组分和第二引发剂组分能形成引发剂。
2. 权利要求1的组合物，其中第一探针或第二探针中的至少一种 能够通过形成物理键而与分析物结合，所述物理键来自静电相互作 用、氢键结合、疏水相互作用或亲和相互作用中的一种或多种。
3. 权利要求1的组合物，其中第一探针或第二探针中的至少一种 能够通过形成共价4定而与分析物结合。
4. 权利要求1的组合物，其中第一探针或第二探针中的至少一种 能够通过在生理条件下结合常数大于约105 M"的结合机制而与分析 物结合。
5. 权利要求l的组合物，其中所述引发剂能引发控制聚合反应。
6. 权利要求1的组合物，其中所述引发剂能引发选自以下的聚 合原子转移自由基聚合类型、开环易位聚合类型、基团转移聚合类 型、硝基氧介导聚合类型或可逆加成断裂链转移聚合类型。
7. 权利要求1的组合物，所述组合物还包含分析物，其中第一探 针和第二探针都与所述分析物结合。
8. 权利要求7的组合物，所述组合物包含聚合物前体，其中所述 引发剂能引发所述聚合物前体的聚合反应。
9. 一种组合物，所述组合物包含权利要求8的组合物的反应产物。
10. 权利要求9的组合物，所述组合物还包含直链或支链聚合物。
11. 权利要求IO的组合物，其中所述聚合物的数均聚合度范围为 约100克/摩尔至约1000000克/摩尔。
12. 权利要求10的组合物，其中所述聚合物具有单峰分子量分布。
13. 权利要求IO的组合物，其中所述聚合物的多分散性为小于约1.5。
14. 权利要求8的组合物，其中所述聚合物前体包含一种或多种 信号发生器。
15. 权利要求14的组合物，其中所述信号发生器包括生色团、荧 光团、拉曼活性标签、电活性标记、磁性标记或放射性标记中的一种 或多种。
16. 权利要求14的组合物，其中所述信号发生器包括一种或多种 酶或酶的底物。
17. 权利要求1的组合物，其中所述分析物包括一种或多种选自 以下的污染物空气污染物、水污染物、土壤污染物及其两种或更多 组合。
18. 权利要求1的组合物，其中所述分析物包括一种或多种与肉 类副产品相关的腐败指示剂。
19. 权利要求1的组合物，其中所述分析物包括一种或多种选自 以下的化学战剂失能性毒剂、催泪剂、糜烂性毒剂、起疱剂、神经 性毒剂、肺毒剂、血毒剂、恶臭物及其两种或更多的组合。
20. 权利要求1的组合物，其中所述分析物包括一种或多种选自 以下的生物战剂病原体、毒素及其组合。
21. 权利要求1的组合物，其中所述分析物包括一种或多种选自 以下的生物分子肽、蛋白质、核酸、多糖、脂质、酶、酶的底物、 抗原、半抗原、适体、维生素及其两种或更多的组合。
22. 权利要求1的组合物，其中第一探针和第二探针都独立地包 括核酸、蛋白质、糖、脂质、碳水化合物、维生素、酶或酶的底物中 的一种或多种。
23. 权利要求1的组合物，所述组合物包含能与同一分析物结合 的多种探针对，其中各探针对包含与第 一引发剂组分结合的第 一探针 和与第二引发剂组分结合的第二探针，并且当所述引发剂组分彼此接近而形成引发剂且当所述探针对与所述分析物结合时，各探针对能与 所述引发剂结合。
24. 权利要求l的组合物，其中所述组合物在室温下溶于水。
25. 权利要求1的组合物，其中所述组合物在室温下溶于有机溶 剂，所述有机溶剂包含曱醇、乙醇、二曱亚砜、二甲基曱酰胺或N-曱基吡咯烷酮中 一种或多种。
26. —种流体组合物，所述流体组合物包含 权利要求1的组合物；聚合物前体；和 溶剂。
27. —种试剂盒，所述试剂盒包含 能够检测分析物的组合物，所述组合物包含 与第 一 引发剂组分结合的第 一探针；与第二引发剂组分结合的第二探针；和 聚合物前体；其中第一探针和笫二探针能与同一分析物结合，当第一引发剂组 分和第二引发剂组分彼此接近且当第 一探针和第二探针与所述分析 物结合时，第一引发剂组分和第二引发剂组分能形成引发剂，所述引 发剂能51发所述聚合物前体的聚合反应。
28. —种物品，所述物品包含基底，包含在所述基底表面上分布的分析物， 并且所述基底能够通过所述分析物、与第一引发剂组分结合的第一探针、与第二引发剂组分结合的第二探针和引发剂而与聚合物締 合，所述引发剂是当第 一 引发剂组分和第二引发剂組分彼此接近时形 成的。
29. 权利要求28的物品，其中所述基底包括颗粒、玻片、凝胶、 细胞、组织样品或微阵列中的一种或多种。
30. —种装置，所述装置包括权利要求28的物品，其中所述装置 能够检测所述分析物的类型、所述分析物的含量或者同时检测所述分 析物的类型和含量。
31. —种方法，所述方法包括使权利要求1的组合物与分析物接触而形成复合物；其中所述复 合物具有彼此接近的第 一 引发剂组分和第二引发剂组分； 自第一引发剂组分和第二引发剂组分形成引发剂；和 使所述复合物与至少 一种聚合物前体接触。
32. 权利要求31的方法，所述方法还包括自所述聚合物前体形成 聚合物。
33. 权利要求32的方法，所述方法还包括观察来自所述聚合物的 信号。
34. 权利要求33的方法，所述方法还包括使所述聚合物与一种或 多种信号发生器接触，然后观察所述信号。
35. 权利 求33的方法，所述方法还包括找到所述信号与分析物 类型、分析物含量或者分析物类型与含量的相关性。
全文摘要
本发明组合物包含第一探针、与第一探针结合的第一引发剂组分、第二探针、以及与第二探针结合的第二引发剂组分。第一探针和第二探针能与同一分析物结合，而且当第一引发剂组分和第二引发剂组分彼此接近且当第一探针和第二探针与所述分析物结合时，第一引发剂组分和第二引发剂组分能形成引发剂。提供了相关试剂盒、装置和方法。
文档编号G01N33/532GK101627307SQ200780050706
公开日2010年1月13日 申请日期2007年12月4日 优先权日2006年12月4日
发明者A·苏德, B·莫亚泽, G·A·格罗斯曼, J·R·奈尔逊, J·Y·鬼, L·羌, Z·潘, 苏 吕, 巍 蔡, 郑志新 申请人:通用电气公司