专利名称：抗体中的a-岩藻糖基化检测的制作方法
抗体中的a-岩藻糖基化检测
本发明涉及用于检测糖基化抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法。
发明背景
尽管抗体的Fab (抗原结合片段)结构域内的可变区负责抗原的识别，但Fc (可结晶片段)区代表抗体的恒定部分，其负责介导效应功能。在免疫球蛋白G(IgG)的情况下， 这些效应功能包括补体的固定和与Fey受体(FcyR)的结合。同型二聚体Fc片段的CH2 结构域内单个保守位点(AsM97)处N-连接寡糖的存在对于介导这这些效应功能是必须的。最近发现，所连接糖类的修饰也可以对Fc YRIIIa和IgG之间的相互作用具有亲和力改进作用。负责这种作用的糖类修饰是不存在岩藻糖残基，所述岩藻糖残基通常与双触角 (biantennary)复合物型IgG聚糖中的第一个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基连接(

图1)。
体内和体外实验显示，此种增加的亲和力导致主要由自然杀伤(NK)细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的增强。因此，还认为，此种a_岩藻糖基化抗体在目的为清除受调理的细胞的处理中具有改进的效力。
a_岩藻糖基化抗体的产生代表重要的生物技术挑战，其可以通过几种方法实现。 尽管完全缺失参与岩藻糖基化生物合成的酶的细胞系(例如通过基因敲除)可以产生定量的a-岩藻糖基化抗体，但大多数其他方法还不能。例如，siRNA处理或用几夫碱共培养抗体表达细胞(Zhou等人，Biotechnol Bioeng Q008) 99，652-665)，以及通过N-乙酰葡糖胺转移酶III (GnT-III)(其促进等分寡糖的形成，因此抑制岩藻糖基化反应)的糖修饰(Umana 等人，Nat Biotech (1999) 17，176-180)仅产生了部分a_岩藻糖基化的抗体。
在抗体库内，这些部分a_岩藻糖基化抗体主要表现出不均一的岩藻糖基化分布。例如，在发酵期间，岩藻糖基化速率可以不同。此外，岩藻糖基化事件可以是协同的，即在同型二聚体抗体上的第二岩藻糖基化可以相对于第一岩藻糖基化而言，以增加的(正协同)或降低的(负协同)速率发生。
(^1 111&/186复合物具有1 1的化学计量，但IgG具有Fc YRIIIa的两个结合位点。因此，在单岩藻糖基化抗体中，受体可以以高亲和力与由IgG的a-岩藻糖基化聚糖和蛋白质核心形成的结合位点结合或者以低亲和力与由岩藻糖基化的糖类和蛋白质核心组成的结合位点结合。因此可以推断，具有50% a-岩藻糖基化的抗体库可以由其中仅两个N-聚糖中的一个是岩藻糖基化的抗体的均一群体组成，或者由50%为其中两个N-聚糖都是岩藻糖基化的抗体而其余50%为N-聚糖都没有岩藻糖基化的抗体组成。显而易见， 此种a-岩藻糖基化的差异分配影响了对Fc γ RIIIa的整体亲和力，并导致不同的生物学活性。因此，必须直接地通过应用生物学测试系统(生物测定法)或者间接地通过生物化学测量岩藻糖基化的速率和分布，来分析此种抗体制剂的生物学活性，这产生了更准确的结果。
当今技术水平的糖分析法(glycoanalytics)使用来自脑膜败血金黄杆 M (Flavobacterium meningosepticum)白勺 N- ft | F (PNGase F) |ij N- 3 ^ 白勺糖类，随后进行MALDI-MS(基质辅助激光解吸离子化质谱)分析(根据Papac等人， Glycobiology (1998) 8，445-454)。然而，由于应用该方法，丢失了键合信息，并且也不可能测定抗体制剂内岩藻糖基化的分布。
另一方面，使用ESI-MS(电喷射离子质谱)分析完整抗体产生了复杂质量模式，其不允许定量解释，这是由于除岩藻糖基化外的多种修饰，如半乳糖基化、C-末端赖氨酸异质性、脱酰胺作用等，其可能在或不在同型二聚体IgG的两个亚基中都发生。
因此，还存对于消除上述不均一性但保留键合信息的新的分析方法的需求。
发明详述
本发明克服了上述缺点，其提供了用于检测糖基化抗体内存在或者不存在岩藻糖残基的方法。优选地，测定抗体或其片段内岩藻糖残基的量及其分布模式。分析抗体制剂中每一 Fc分子的岩藻糖残基的分布也是本发明的一部分。此外，本发明可以用于测定发酵期间抗体制剂中协同的岩藻糖基化。因此，本发明提供了填补抗体分析学中空缺的方法。通过该新方法得到的抗体及其片段内岩藻糖基化模式的信息，目前可以更准确地预测Fc介导的潜能。
令人惊奇地，本发明的发明人发现，Endo S(具有内切糖苷酶活性的酶，最初在酿脓链球菌(Sti^ptococcus pyogenes)中鉴定(Collin 和 01 sen，EMBO J (2001)20, 3046-3055))从人IgG的Fc区中切割了复合型聚糖部分，仅留下可能与岩藻糖残基连接的第一个GIcNAc残基。由Endo S区分的(备用的(spared))该杂合型糖类可以在相同的位点受内切糖苷酶H(Endc) H)定量切割。因此，两种酶的组合允许制备仅岩藻糖含量不同的均一糖基化蛋白质。分析此种经处理的Fc片段不仅允许测定分析的抗体库内岩藻糖残基的岩藻糖含量，还允许测定岩藻糖残基的分布。这些新发现填补了分析学空缺，并且根据所分析的抗体在ADCC诱导中的功效，允许所分析的抗体的潜能估计。
因此，本发明涉及用于检测糖基化的抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法。
在一个实施方案中，本发明方法包括以下步骤
a)从蛋白质中去除全部异质性糖残基，
b)从蛋白质中去除全部其他异质性残基，
c)随后分析该蛋白质。
在另一实施方案中，所述方法的步骤C)额外包括分析之前的纯化步骤。在特定的实施方案中，通过亲和层析或者大小排阻层析实现纯化。亲和层析可以使用例如A蛋白或 G蛋白进行。
在一个实施方案中，通过本发明方法处理和分析的蛋白质是抗体或抗体片段。优选地，所述抗体是IgG型抗体。所述抗体片段优选地是Fc片段，特别是IgG型抗体的Fc片段。
在特定的实施方案中，步骤a)的去除通过特异切割复合型或杂合型N-连接糖类的一种或多种酶进行。优选地，这些酶包括Endo S和Endo H。
在另一特定的实施方案中，步骤b)的去除通过一种或多种酶进行。优选地，这些酶包括纤溶酶和/或羧肽酶B。
在另外的特定实施方案中，步骤c)的分析包括CE-SDS丽(毛细管电泳-十二烷基硫酸钠分子量)分析、ESI-MS分析或液相层析-质谱(LC-MQ或者它们的组合。
在优选的实施方案中，上述方法的步骤a)包括从蛋白质的糖结构中在所述糖结构的第一个GICNAC残基后切割异质性糖类，从而留下与抗体核心连接的岩藻糖残基。该步骤可以用两种酶(例如Endo S和Endo H)进行，所述酶特异性切割通常在生物技术产生的抗体中存在的复合型或者杂合型N-连接的糖类。
在优选的实施方案中，上述方法的步骤b)包括定量去除抗体重链的C末端赖氨酸残基，优选地使用酶，所述酶优选地包括羧肽酶B。
在另一优选的实施方案中，上述方法的步骤b)包括在抗体的Fab和Fc片段之间切害I]。优选地，在Fab和Fc片段之间的切割后，在Fc片段内保留了重链的铰链肽内的共价链间二硫键。优选地，通过酶实现切割。优选地，此种酶包括纤溶酶。
在优选的实施方案中，上述方法的步骤c)包括在没有任一先前的纯化步骤的情况下，通过LC-MS分析所处理的抗体分子或Fc片段。该分析通常产生了仅三种质量，所述三种质量对应于具有两个岩藻糖基化聚糖的蛋白质、具有一个岩藻糖基化聚糖和一个a-岩藻糖基化聚糖的蛋白质，以及其中两个聚糖都a-岩藻糖基化的蛋白质。
在另一实施方案中，上述方法的步骤C)包括使用标准方法纯化所处理的抗体分子或Fc片段，并通过ESI-MS分析分析它。该分析通常产生了仅三种质量，所述三种质量对应于具有两个岩藻糖基化聚糖的蛋白质、具有一个岩藻糖基化聚糖和一个岩藻糖基化聚糖的蛋白质，以及其中两个聚糖都是a-岩藻糖基化的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明方法包括以下步骤提供抗体制剂，任选地分离该抗体制剂的Fc片段部分、用Endo H和Endo S从所述抗体或Fc片段中去除异质性糖残基、用羧肽酶B从所述抗体或Fc片段中去除C端赖氨酸残基，以及通过ESI-MS、LC-MS或CE-SDS MW 分析，分析所处理的抗体或Fc片段。
在另一实施方案中，所述方法包括以下步骤提供抗体制剂，任选地使用纤溶酶分离该抗体制剂的Fc片段部分、用Endo H和Endo S从所述抗体或Fc片段中去除异质性糖残基、用羧肽酶B从所述抗体或Fc片段中去除C端赖氨酸残基，以及通过ESI-MS、LC-MS或 CE-SDS MW分析，纯化并分析所处理的抗体或Fc片段。
又在另一实施方案中，本发明涉及适合于进行测定法的试剂盒，所述测定法检测糖蛋白内岩藻糖残基的存在或者不存在。本发明试剂盒包括在上述方法中提及的全部组分 (例如Endo H、Endo S、羧肽酶B、纤溶酶、合适的缓冲液)、描述上述方法中任意之一的步骤的说明，以及用于试剂盒的内含物的容器。
将Endo S用于切割糖蛋白，优选地糖基化抗体或者其片段的复合型N-连接寡糖的用途也是本发明的一部分。
定义
在本文中所用的术语通常同样地用于本领域中，除非在以下另外定义
如本文中所用，术语“异质性糖”包括不与岩藻糖残基连接的糖基化抗体或者抗体片段的任一单糖部分。糖基化抗体或者抗体片段的异质性糖的非限制性实例是甘露糖、唾液酸、半乳糖、乙酰葡糖胺。通常，在本发明方法的步骤a)中去除的异质性糖是除第一个 GlcNAc残基(即与蛋白质的天冬酰胺残基连接的GIcNAc残基)，以及与第一个GIcNAc残基连接的岩藻糖残基之外的全部糖。
如本文中所用，术语“异质性残基”意为糖基化抗体或者抗体片段的任一其他部分 (除异质性糖外)，其可以干扰在所述抗体或者抗体片段内岩藻糖残基的检测。异质性残基5的非限制性实例是除岩藻糖基化之外的糖基化抗体或者抗体片段的多种修饰，例如半乳糖基化、C端赖氨酸异质性和脱酰胺作用。术语“异质性残基”可以进一步包括未糖基化的抗体片段，例如Fab片段、scFv片段和其他片段。如本文中所用，术语“抗体”意图包括整个抗体分子、抗体片段或者融合蛋白质，所述融合蛋白质包含与免疫球蛋白的Fc区等同的区域。术语“复合型寡糖”和“杂合型寡糖”指抗体或者抗体片段的糖基化模式。“复合型寡糖”和“杂合型寡糖”的非限制性实例显示于图7中。本领域技术人员应当理解，富含等分(bisected)杂合型寡糖的糖蛋白通常由生产细胞系中&1T-III的过表达产生。等分杂合型寡糖的示例结构详述与图7-III中。富含等分的复合型寡糖的糖蛋白通常由生产细胞系中ManII和&ιΤ-Ι II的共表达产生。等分复合型寡糖的示例性结构详述于图7-IV中 (Ferrara 等)κ, Biotechnol Bioeng (2006) 93,851-861)。如本文中所用，糖残基“之后”切割，意为在该残基的末端切割，即切割连接该残基与朝向糖结构的外端的相邻残基的糖键。在N连接聚糖的“第一个GIcNAC残基之后”切割， 意为在第一个(即与天冬酰胺残基连接的)和第二个(即与第一个连接的)GlcNAc残基之间切割寡糖的壳二糖核心。抗体制剂内岩藻糖残基的“分布”指抗体或Fc分子的制剂内的存在，所述抗体或 Fc分子在Fc区中与N-连接聚糖相关的岩藻糖残基的数目方面不同。例如，IgG分子在其 Fc区具有两个N-连接的聚糖，其中每一个都可以具有与糖结构的第一个GIcNAC残基连接的岩藻糖残基。因此，在IgG制剂中，可能存在三种不同的分子种类在Fc区中具有两个、一个或者没有与N-连接聚糖相关的岩藻糖残基的IgG。除测定总岩藻糖含量，即岩藻糖基化或者a-岩藻糖基化N-聚糖的级分外，可以通过本发明方法测定这些不同种类的比率(即每一 Fc分子的岩藻糖残基的分布)。以下实施例更详细地说明了本方法。给出的实施例能使本领域技术人员更清楚地理解并实施本发明。然而，本发明并不受限于示例性实施例的范围，所述示例性实施例仅旨在说明本发明的单个方面，并且功能性等同的方法也在本发明范围内。附图简述图1.图示与人IgGl-Fc的Asnj97连接的糖类部分。以粗体显示的糖定义了 N-连接聚糖结构的戊糖核心；其他糖残基的添加是可变的。灰色显示了等分GIcNAC残基。图2.通过CE-SDS监测的抗体A (野生型抗体)和C (糖基化改造抗体)的完整Fc 片段的去糖基化。显示了酶处理之前和之后非还原Fc片段的电泳图谱。(A)没有酶处理 (虚线)和用PNGase F (点线)或Endo S (实线)去糖基化的抗体C的Fc片段，⑶没有酶处理(虚线)和用PNGaseF去糖基化(点线)或Endo S (实线)去糖基化的抗体A的Fc 片段。图3.通过用Endo S和PNGase F或者用Endo S和Endo H连续处理，从抗体C的 Fc片段中释放的N-连接的寡糖的阳离子MALDI-T0F质谱。(A)通过用Endo S处理释放的聚糖的谱图。(B)通过用PNGase F后续处理释放的Endo S抗性糖的谱图，产生了在m/z = 1663处分离的信号(如图示，其可能对应于杂合型或者复合型结构)。(C)通过用杂合型结构特异的酶Endo H后续处理释放的聚糖的谱图(图示了通过Endo H处理释放的对应于 m/z = 1460的杂合型结构)。
图4.通过CE-SDS漏分析(A)和阳离子MALDI-T0F质谱⑶监测抗体C的Fc片段的去糖基化。(A)不用糖苷酶处理的(虚线)和用Endo S和Endo H的组合处理的(实线)非还原Fc片段的电泳图谱的叠加。(B)用Endo S和Endo H处理，从Fc片段中释放的 N-连接寡糖的质谱。图示了通过Endo H释放的对应于m/z = 1460的杂合型结构。图5.用Endo S和Endo H处理后Fc片段的ESI-MS谱。(A)抗体A的Fc片段， (B)抗体 B 的 Fc 片段，(C)抗体 C 的 Fc 片段。峰 1 :Fc-GlcNAc/GlcNAc ，峰 2 =Fc-GIcNAc/ GlcNAc+Fuc ，峰 3 :Fc_GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。图6.通过CE-SDS(A)和阳离子MALDI-TOF质谱⑶监测的抗体C的去糖基化。 (A)显示了酶处理之前和之后未还原的IgG的电泳图谱不用酶处理的(虚线)和用PNGase F去糖基化的(点线)或用Endo S和EndoH组合处理的(实线)抗体C。(B)从用Endo S 和Endo H处理的完整IgG中释放的N-连接寡糖的质谱。图7.产生复合型或杂合型结构的N-连接寡糖生物合成途径。Ml 甘露糖苷酶I， Gl β 1,2-Ν-乙酰葡糖胺转移酶I，G3 β 1,4-Ν-乙酰葡糖胺转移酶III，Gt β 1,4-半乳糖基转移酶。图8.用Endo S和Endo H处理后，完整IgG的ESI-MS谱。(A)抗体Α，⑶抗体D。 峰 1 :Fc-GlcNAc/GlcNAc，峰 2 :Fc_GlcNAc/GlcNAc+Fuc，峰 3 :Fc_GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。图9.用Endo S和Endo H处理后，完整IgG的LC-MS谱。。(A)抗体A，(B)抗体D。 峰 1 :Fc-GlcNAc/GlcNAc，峰 2 :Fc_GlcNAc/GlcNAc+Fuc，峰 3 :Fc_GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。
实施例实施例1 方法从人IgG中产生Fc将根据Papac等人，1998测定的具有不同a_岩藻糖基化聚糖含量(括号内的含量)的4种不同的人IgG用于分析a-岩藻糖基化分布野生型抗体A(2. 12% )、糖基化改造的抗体B (47.0% )，糖基化改造的抗体C (69.6% )，和糖基化改造的抗体D (85% )。在25°C，在具有每毫克0.42U纤溶酶(Roche)的 50mM Tris pH 8. 0、150mM NaCl 中温育蛋白质72小时。使用用缓冲液A(50mM Tris pH 8. O、IOOmM甘氨酸、150mM NaCl)平衡并洗涤(5个柱体积(CV))的A蛋白亲和柱(5ml HiTrap A蛋白HP柱，GE Healthcare)，分离已切割的Fc与Fab片段。收集含Fc的级分，并通过加入1 40 (ν/ν)的2Μ Tris pH 8.0 中和。使用超浓缩器(ultra concentrator) (Vivaspin 15R10O00 MWCO HY, Sartorius), 将样品浓缩至2. 5ml的体积，并随后应用于用2mM MOPS pH 7. 4、150mM NaCl.O. 02% (w/ ν) Ne^3平衡的PD-IO脱盐柱(GE Healthcare)。将纯化的蛋白质冷冻于液氮中，并储存于-80"C。从人Fc中释放N-连接的寡糖将不同的酶用于水解人IgG的N-连接的聚糖。通过用0.005U重组PNGase F(QAbio, Vista Monte，美国)温育，从Img的Fc中切割N-连接的寡糖。对于使用未标记的Endo S(Genovis)从Fc中释放糖类，将样品用1 20摩尔比的单独的Endo S或者Endo S与0. lU/mg Endo H(QAbio)的组合温育。在37°C，在20mM Tris pH 8. O中温育所有反应物16小时。
对于分析由Endo S切除(spared)的糖类，如上所述，在Endo S处理后，通过使用 A蛋白的亲和层析纯化Fe，并随后用PNGase F或Endo H消化。从完全人IgG中释放N-连接的寡糖使用不同酶释放人IgG的N-连接的聚糖。通过在37°C，在20mM TrispH 8. O中用 0. 005U的重组PNGase F(QAbio)温育16小时，从Img的IgG中切割N-连接的寡糖。对于使用未标记的Endo S(Genovis)从IgG中释放糖类，将样品应用于用20mM Tris pH 8. O平衡的 NAP-5 脱盐柱(GEHealthcare)。使用超浓缩器(Amicon 5' 000MWC0，Millipore)，将洗脱的样品浓缩至細g/ml的终浓度，并在37°C，用1 7的Endo S与0. lU/mgEndo H(QAbio) 的组合温育16小时。羧肽酶B处理为了去除由C端赖氨酸残基引起的异质性，在去糖基化后，将样品用羧肽酶 B (Roche ；lmg/ml)进一步温育。从而，将每50 μ g人Fc或完整抗体1 μ 1的羧肽酶B加入到内切糖苷酶反应中，并在37°C再次温育1小时。释放的寡糖的MALDI-T0F质谱分析通过质谱(Auto flex, Bruker Daltonics GmbH)在阳离子模式中，分析人Fc或完整抗体的中性寡糖谱(Papac等人，1998)。纯化去糖基化的人Fc或完整抗体通过A蛋白亲和层析(AgilentTechnologies)使用Agilent HPLC 1100系列分离 Fc或完整IgG与酶和经切割的糖类。将样品应用于用缓冲液A(50mM Tris，IOOmM甘氨酸， 150M NaCl,pH 8.0)平衡的包装在保护柱 2X20mm C-130B(Upchurch Scientific)中的 A 蛋白基质(Poros 20A ；Applied Biosystems)。用5. 5CV的缓冲液A洗涤后，使用8. 3CV以上的缓冲液B(50mM Tris，100mM甘氨酸，150M NaCl，pH 3.0)通过pH-梯度洗脱人Fc或完整IgG。通过加入1 40(v/v)的2M Tris pH 8. O中和含所述蛋白质的级分。随后将纯化的蛋白质进一步用于用酶处理以分析未切割的糖类、CE-SDS分析或者 ESI-MS0CE-SDS MW 分析使用具有UV检测的Beckman PA800，通过CE_SDS_MW分析监测去糖基化。使用旋转浓缩器(5000MWC0，Millipore)将100 μ g每一A蛋白纯化的样品的缓冲液交换成20mM Tris pH 8. O0 使用 ProteomeLabSDS-MW 分析试剂盒(Beckman Coulter)，如在 SDS-MW Analyses Guide中所述，制备未还原的样品。最终蛋白质浓度为lmg/ml。将样品应用于预先调节的熔融硅毛细管(bare fused silica capillary) (50 μ m IDX30.2cm)。根据使用说明进行预调节和分离。用于ESI-MS的样品制备使用旋转浓缩器(5000MWC0，Millipore)将A蛋白纯化的样品的缓冲液交换成2mM MOPS pH 7. 4、150mM NaCl.O. 02% (w/v)NaN30将蛋白质冷冻于液氮中，并储存在_80°C。通过直接注入(离线检测)对人Fc和完整IgG的聚糖结构的ESI-MS分析通过大小排阻层析脱盐将20-50 μ g(高达90 μ 1)用蛋白酶纤溶酶和羧肽酶B和用内切糖苷酶Endo S 和Endo H处理抗体后的Fc或者用Endo S, Endo H和羧肽酶B处理后的完整IgG注射到用2%甲酸、40%乙腈以0.5ml/分钟的流速平衡30分钟的kphadex G25自包装ECO SR 柱(5X250mm;KronLab)上。用2%甲酸、40%乙腈以Iml/分钟的流速应用8分钟等度洗脱，对所注射的蛋白质样品脱盐。通过^Onm处的UV记录脱盐蛋白质的洗脱，并将洗脱的样品(体积约200-300 μ 1)收集在1.5ml反应管中。将脱盐样品的等分试样人工装入金属涂布的玻璃针头(Proxeon Biosystems Nano ESI-needles，货号ES387)中，插入到质谱仪器的纳喷雾(nanospray)源中，并喷射到来自Waters的ESI-Q-TOF II质谱仪中或者来自 Applied Biosystems 白勺 Q-Star Elite Mifftc^。直接注入的MS参数A)在Q-TOF II仪器(Waters)上，经纤溶酶处理样品(人Fe)的直接注入MS参数使用1000V的毛细管电压、30V的锥孔电压，在1000-2000m/z的质量范围，使用 80°C源温度以阳离子模式获取MS谱。去溶剂化温度为关闭。通过各个仪器软件获取MS数据大约2-3分钟。B)在MaXis-ESI-MS仪器(Bruker)上，完整抗体的直接注入MS参数使用NanoMate装置作为喷雾界面获取MS谱。将以MS仪器获取数据的值设定为， 对于转移参数，400Vpp (funnel RF)、120eV(ISCID 能量)和 400Vpp (Multipol RF)，对于 9皿办叩01参数，5.0^(离子能量)和300m/z(低质量)，调整碰撞池(collision cell)为 15eV (碰撞能量)和3000Vpp (碰撞RF)，以及对于转移时间800Vpp、160 μ s和离子冷却器 20 μ s的前脉冲存储。以阳性离子模式在1000-4000m/z的质量范围记录数据。使用内部开发的软件，从Fc片段或完整抗体种类的各个m/z模式中，测定含有由所应用的内切糖苷酶截短的聚糖结构的不同组合，即GlcNAc/GlcNAc、GlcNAc+Fuc/GlcNAc 和GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc的二聚体Fc片段和完整抗体的摩尔质量。使用二聚体Fc片段或完整抗体的不同糖基化变体的m/z谱的峰面积总和，用相同的内部软件计算多种残留的糖基化二聚体Fc片段或完整抗体的相对比率。通过LC-MS (在线检测)对完整IgG的聚糖结构的ESI-MS分析在与Q-TOF II 质谱仪(Waters)偶联的 Dionex HPLC 系统(Dionex Ultimate 3000)上进行 LC-MS。在 ACE C4 柱(5 μ m 颗粒大小，300A 孔大小，1 X 30mm ；Advanced Chromatography Technologies)上进行层析分离。洗脱液A为0. 1 %甲酸，洗脱液B为 99. 9%乙腈和0. 甲酸。流速为10(^1/分钟，在751进行分离，并使用2口8(1(^1)的用Endo S和Endo H，但不用纤溶酶处理处理的完整抗体样品。表1. LC-MS 的参数
权利要求
1.用于检测糖基化抗体或其片段内存在或者不存在岩藻糖残基的方法，包括a)从蛋白质中酶促去除异质性糖残基，b)从蛋白质中酶促去除其他异质性残基，c)随后分析所述蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中步骤c)额外包括分析之前的纯化步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中测定了抗体制剂内分子之间岩藻糖残基的数量及其分布模式。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中测定了抗体制剂中每一Fc分子的岩藻糖残基的分布。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述步骤a)的去除通过EndoS和/或Endo H 进行。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述步骤b)的去除通过纤溶酶和/或羧肽酶B 进行。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述步骤c)的分析包括LC-MS分析、CE-SDS丽分析或者ESI-MS分析。
8.权利要求1-7中任一项的方法，包括a)提供抗体制剂，b)任选地分离该抗体制剂的Fc片段部分，c)用EndoH和Endo S从所述抗体或Fc片段中去除全部异质性糖残基，d)用羧肽酶B从所述抗体或Fc片段中去除C端赖氨酸残基，e)通过LC-MS分析、ESI-MS或者CE-SDSMW分析，分析所述抗体或者Fc片段。
9.权利要求8的方法，其中步骤e)额外包括分析之前的纯化步骤。
10.权利要求1-9中任一项的方法的用途，用于测定在发酵期间在抗体制剂中协同的岩藻糖基化。
11.用于定性和定量检测肽内岩藻糖残基的试剂盒，其包含EndOS和/或Endo H、纤溶酶和/或羧肽酶B、根据权利要求1-9中任一项所述方法的全部组分、给出根据权利要求 1-9中所述方法任一项的步骤的说明，以及用于试剂盒的内含物的容器。
12.Endo S用于从糖蛋白中切割复合型寡糖的用途。
13.基本上如上文所述，特别参照前述实施例的方法、试剂盒和用途。
全文摘要
本发明描述了新的分析方法，以测定抗体制剂内每一Fc的岩藻糖的数量和分布。
文档编号G01N33/68GK102511007SQ201080041521
公开日2012年6月20日 申请日期2010年9月28日 优先权日2009年10月2日
发明者C·耶格尔, H·科尔, P·乌马纳, P·松德尔曼 申请人:罗切格利卡特公司