专利名称：：中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药及其提取物的分析方法，特别是一种采用高效液相色谱法进行中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法。
背景技术：
：生物碱为中药附子的主要有效成分，在附子药材及其提取物中，生物碱主要为双酯型、单酯型乌头碱类生物碱，其中主要的九种乌头碱类生物碱的具体结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>现有技术中记载乌头碱类生物碱具有镇痛强心等作用，用于回阳救逆，补火助阳，逐风除湿等。本发明指纹图谱实验方法按2005版中国药典一部附录VID规定的高效液相色谱法和《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》进行实验。但药典高效液相色谱法及《技术要求》只是一个通则和准则，并未描述具体中药品种的分析方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种中药附子或其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，具有简便、快速、可靠、信息全面的特点，能较全面的反映附子及其提取物的质量，对中药附子质量研究控制研究具有积极意义。本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是一种中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅垸键合硅胶(C18)或八垸基硅烷键合硅胶(C8)为填充剂，以有机相-缓冲液为流动相，所述的有机相-缓冲液用醋酸调节pH值为3.08.0，检测波长230240nm，有机相占流动相体积百分比的2070%，其中，有机相为乙腈或甲醇；所述的缓冲液为醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-乙酸铵-醋酸缓冲液中的一种；配制对照品溶液将适量乌头碱、新乌头碱或次乌头碱用流动相溶解，制成含乌头碱、新乌头碱或次乌头碱4080Pg/ml的对照品溶液,优选用新乌头碱作为对照品，新乌头碱的理论塔板数不低于2000;配制供试品溶液将附子粉末用浓氨浸润3060分钟，加入氨水饱和过的乙醚，超声震荡520分钟，38。C冷藏过夜，过滤，残渣用氨水饱和过的乙醚洗涤多次，过滤，合并滤液，挥干乙醚，以甲醇溶解，用流动相稀释制成供试品溶液，过0.22Mm微孔膜；或者，将附子提取物用盐酸溶解，无水乙醚萃取，水层用氨液调pH至910，用无水乙醚萃取多次，合并乙醚萃取液，挥干乙醚，用流动相配成供试品溶液，过0.22Mm微孔膜；测定精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，制定中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱。本发明的反相高效液相色谱法采用C18或C8作为填充剂(固定相)；有机相-缓冲溶液作为流动相，流动相经过滤脱气处理；检测波长为230240nm;调整流动相比例，使色谱峰分离良好，在60min内使所有色谱峰出峰。本发明供试品中的主要成分为单酯或双酯型生物碱，而新乌头碱峰型良好，保留时间稳定，且有对照品标示，故选用新乌头碱色谱峰作为参照色谱峰。在上述方案的基础上，所述醋酸铵或乙酸铵的摩尔浓度为1040mmol/L，所述三乙胺体积浓度为0.050.2%。在上述方案的基础上，所述有机相-缓冲液的pH值为5.07.0。在上述方案的基础上，所述的有机相占流动相体积百分比为3060%，进一步优选在3652%。利用上述指纹图谱的建立方法测定中药附子及其提取物中的生物碱，获得21个共有峰，其中，超过或接近总峰面积10%的色谱峰有4个，为8号峰，其平均相对保留时间RT为0.391，平均相对峰面积为24.109;IO号峰，其平均相对保留时间RT为0.460，平均相对峰面积为4.691;12号峰，其平均相对保留时间RT为0.546，平均相对峰面积为7.010;17号峰，其平均相对保留时间RT为0.900，平均相对峰面积为7.395。本发明的有益效果是以所选定的有机相-缓冲溶液作流动相，能很好分离附子中的各生物碱，且分离出的色谱峰数目是现有技术中最多的，能全面反映附子及其提取物的质量。本发明采用的有机相-缓冲盐溶液流动相对附子中生物碱具有很好的分离作用，且峰型良好，保留时间稳定，符合指纹图谱要求。图1为本发明的附子生物碱指纹图谱。具体实施例方式以下将进一步结合实例来详细描述具体实施方案，以下的实施例并非限定本发明方案。一种中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，采用反相高效液相色谱法，用十八垸基硅垸键合硅胶或八垸基硅垸键合硅胶为固定相，以有机相-缓冲液为流动相，所述的有机相-缓冲液的PH值为3.08.0，检测波长230240nm，所述的有机相占流动相体积百分比的2070%，其中，有机相为乙腈或甲醇；所述的缓冲液为醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-乙酸铵-醋酸缓冲液中的一种；配制对照品溶液将适量新乌头碱用流动相溶解，制成含新乌头碱70l^g/ml的对照品溶液，新乌头碱的理论塔板数不低于2000。配制供试品溶液A、附子称取不同产地各批号的附子粗粉各10g，置具塞锥形瓶中，以5ml浓氨浸润l小时左右，加入100ml氨水饱和的乙醚，超声震荡10分钟，4'C冷藏过夜，过滤，残渣以氨水饱和的乙醚洗涤3次，过滤，合并滤液，挥干乙醚，以甲醇溶解，过滤至10ml量瓶中，少量多次用甲醇荡洗转移至量瓶中，稀释至刻度，反相高效液相色谱分析前用0.22ym微孔滤膜过滤，备用。B、附子提取物称取不同产地各批号的附子粗粉进行水提，提取物50mg，精密称定，20mL0.01mo1盐酸溶解，50mL无水乙醚萃取，水层用氨试液调pH至910，分别用50mL、30mL、20mL无水乙醚萃取三次，合并乙醚层，35'C挥干乙醚，用流动相溶解配制成不同浓度的供试品溶液，反相高效液相色谱分析前用过0.22um滤膜，备用。测定仪器Waters高效液相色谱仪包括Waters1525双色谱泵，Waters2487DualXAbsorbance紫外检测器，Waters717plus自动进样器，Watersin-line脱气机，WatersBreeze色谱工作站。测定方法分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液20uL注入高效液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。实施例1采用本发明的方法对样品A进行测定时，以C18为填料(Phe隱enexC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-缓冲液为流动相，缓冲液为20mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.3，甲醇与缓冲液的体积比为48:52，检测波长234nm。新乌头碱色谱峰保留时间为48.1248.25min，新乌头碱的理论塔板数不低于2000。实施例2采用本发明的方法对样品B进行测定时，以C18为填料(KromasilC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-缓冲液为流动相，缓冲液为0.2%三乙胺-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.5，甲醇与缓冲液的体积比为38:62，检测波长235nm。新乌头碱色谱峰保留时间为48.9349.01min，理论塔板数不低于2000。实施例3采用本发明的方法对样品C进行测定时，以C18为填料(AlltimaC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-缓冲液为流动相，缓冲液为0.05%三乙胺-10mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为6.0，甲醇与缓冲液的体积比为50:50，检测波长230nm。新乌头碱色谱峰保留时间为47.8947.99min，理论塔板数不低于2000。实施例4采用本发明的方法对样品D进行测定时，以C18为填料(Nucleosil100-5C18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-缓冲液为流动相，缓冲液为0.ly。三乙胺-25ramol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.3，甲醇与缓冲液的体积比为40:60，检测波长235nm。新乌头碱色谱峰保留时间为48.0048"0min，理论塔板数不低于2000。实施例5采用本发明的方法对样品E进行测定时，以C18为填料(ThermoBDSHypersilC18(250mmX4.6mm，5um))，甲醇-缓冲液为流动相，缓冲液为0.1%三乙胺-37mmol/L乙酸铵-醋酸，以醋酸调节pH值为5.3，甲醇与缓冲液的体积比为46:54，检测波长234nm。新乌头碱色谱峰保留时间为47.9548.02min，理论塔板数不低于2000。实施例6采用本发明的方法对样品F进行测定时，以C18为填料(UltimateXB-C18(250iranX4.6mm，5"m))，甲醇-缓冲液为流动相，缓冲液为18mmo1乙酸铵-醋酸，以醋酸调节pH值为5.5，甲醇与缓冲液的体积比为45:55，检测波长235nm。新乌头碱色谱峰保留时间为47.9048.OOmin，理论塔板数不低于2000。实施例7采用同实例1的方法对样品G进行测定。实施例8采用同实例2的方法对样品H进行测定。实施例9采用同实例3的方法对样品I进行测定。实施例10采用同实例4的方法对样品J进行测定。实施例11采用同实例5的方法对样品K进行测定。实施例12采用同实例6的方法对样品L进行测定。实施例13采用同实例6的方法对样品M进行测定。请参阅图1为本发明的附子生物碱指纹图谱，13批附子及其提取物指纹图谱中都存在的共有峰有21个，以对照品新乌头碱的色谱峰为参照色谱峰，其相对保留时间和相对峰面积为1.000，计算其他各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。经过以下实施例测定13批不同产地的附子样品(标示为A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K，L，M)，得到的指纹图谱技术数据见表13。表1为指纹图谱共有峰相对保留时间表。对照品溶液色谱图为标示指纹图谱中共有峰中的几个特征色谱峰，其中，以新乌头碱峰为参照色谱峰，计算其它指纹图谱共有峰的相对保留时间，标定共有指纹峰。表l峰号ABCDEFG10.1200.1180.1180.1190.1180.1170.11720.1490.1470.1490.1480.1470.1470.14630.1600.1580.1570.1580.1580.1570.15740.2300.2280.2270.2280.2280.2270.22650.2640.2620.2610.2620.2610.2600.26060.3190.3160.3160.3160.3160.3150.31570.3400.3370.3360.3370.3370.3360.33580.3940.3920.3900.3920.3910.3910.39190.4490.4410.4390.4400.4380.4350.434100.4640.4610.4600.4610.4600.4600.459110.5220.5160.5150.5160.5150.5130.512120.5490.5460.5460.5470.5460.5460.546130.6060.6020.6020.6030.6020.6010.601140.7030.7000.6990.6990.6990.6980.698150.7840.7810.7790.7800.7790.7770.777160.8240.8190.8170.8170.8170.8150.814170.9090.9040.9030.9030.9020.9000.900180.9390.9350.9330.9340.9340.9320.93219(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000201.0761.0761.0761.0731.0731.0751.073211.1971.1951.2021.1941.1931.1971.191峰号HI了KM均值RSD(%)10.1170.1170.1160.1160.1160.1170.1171.1020.1470.1470.1470.1450.1450.1470.1470.7330.1570.1560.1550.1550.1550.1560.1570.8540.2260.2260.2240.2250.2250.2260.2270.6750.2600.2600.2590.2590.2590.2600.2610.5960.3150.3140.3130.3130.3120.3140.3150.5570.3360.3350.3340.3340.3340.3350.3360.4780.3910.3930.3930.3890.3890.3910.3910.3890.4330.4310.4270.4270.4260,4310.4351.50100.4600.4590.4580.4570.4570.4600.4600.37110.5110.5090.5060.5070.5060.5100.5120.94120.5460.5460.5440.5450.5440.5460.5460.23130.6010.6000.5980.5990.5980.6010.6010.33140.6990.6980.6970.6980.6980.7000.6990.20150.7770.7750.7740.7740.7740.7770.7780.38160.8120.8090.8070.8070.8070.8120.8140.64170.8990.8960.8950.8960.舰0.8980.9000.48180.9310.9290.9270.9280.9260.9290.9310.4119(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000201.0721.0761.0741.0691.0751.0761.0740.19211.1901.2141.1831.1831.2041.2011.1960.71表2为各共有峰的相对峰面积表。表2峰号ABCDEFG10.8430.8750.8550.8230.9921.1020.97621.0951.0100.8500.7311.4843.1821.84731.8870.9341.5261.1561.4561.5571.38840.5950.4640.6090.5640.4940.6570.69250.8681.0100.9650.8790.9691.3360.96960,5710.5340.5280.4950.5230.7370.55870.6110.6120.5990.5720.6000.8440.665820.35420.92124.48620.66622.54228.28822.37590.3090.2390.3010.2510.2280.3470.241104.5624.1644.3233.5734.1655.0104.276110,6180.3990.4800.4820.4280.5840.499126.8736.4196.4255.8316.3427.4156.096131.7061.5241.2821.3601.4121.8891.464141.5861.5551.9151.8531.5331.9371.695150.4030.2940.3790.4450.2790.1970.271160,3730.3360.3230.3400.3050.3870.304175.6036.2127.5355.7406.6948.6598.189180.6600.6700.4500.8290.8120.5200.65619(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000203.0402.7272.4403.3313.4132.9953.457210.1740.2000.1500.2420.2770.2410.279<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如表2所示，在21个共有峰中超过或接近总峰面积10%的色谱峰有4个，这四个色谱峰为8号峰，其平均相对保留时间RT为0.391，平均相对峰面积为24.109;IO号峰，其平均相对保留时间RT为0.460，平均相对峰面积为4.691;12号峰，其平均相对保留时间RT为0.546,平均相对峰面积为7.010;17号峰，其平均相对保留时间RT为0.900，平均相对峰面积为7.395。《技术要求》规定对于单峰面积大于或等于20%的共有峰，与指纹图谱共有模式中该峰面积的差值不得大于20%;单峰面积占总峰面积大于或等于10%，而小于20%的共有峰，其差值不得大于士25%;单峰面积占总峰面积小于10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定，指纹图谱中非共有峰的峰面积不得超过总色谱峰面积的10%。表3为超过或接近总峰面积10%的4个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，采用反相高效液相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机相-缓冲液为流动相，其特征在于所述的有机相-缓冲液的pH值为3.0～8.0，检测波长230～240nm，有机相占流动相体积百分比的20～70％，其中，有机相为乙腈或甲醇；所述的缓冲液为醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-乙酸铵-醋酸缓冲液中的一种；配制对照品溶液将适量乌头碱、新乌头碱或次乌头碱用流动相溶解，制成含乌头碱、新乌头碱或次乌头碱40～80μg/ml的对照品溶液；配制供试品溶液将附子粉末用浓氨浸润30～60分钟，加入氨水饱和过的乙醚，超声震荡5～20分钟，3～8℃冷藏过夜，过滤，残渣用氨水饱和过的乙醚洗涤多次，过滤，合并滤液，挥干乙醚，以甲醇溶解，用流动相稀释制成供试品溶液，过0.22μm微孔膜；或者，将附子提取物用盐酸溶解，无水乙醚萃取，水层用氨液调pH至9～10，用无水乙醚萃取多次，合并乙醚萃取液，挥干乙醚，用流动相配成供试品溶液，过0.22μm微孔膜；测定取上述对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，制定中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱。2、根据权利要求1所述的中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，其特征在于所述醋酸铵或乙酸铵的摩尔浓度为1040mmol/L，所述三乙胺的体积浓度为0.050.2%。3、根据权利要求1或2所述的中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，其特征在于:所述有机相-缓冲液的PH值为5.07.0。4、根据权利要求1或2所述的中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法，其特征在于所述的有机相占流动相体积百分比的3060%。5、利用权利要求1至4之一所述的指纹图谱的建立方法测定中药附子及其提取物中的生物碱，获得21个共有峰，其中，超过或接近总峰面积10%的色谱峰有4个，为8号峰，其平均相对保留时间RT为0.391，平均相对峰面积为24.109;10号峰，其平均相对保留时间RT为0.460，平均相对峰面积为4.691;12号峰，其平均相对保留时间RT为0.546，平均相对峰面积为7.010;17号峰，其平均相对保留时间RT为0.900,平均相对峰面积为7.395。全文摘要本发明涉及一种中药附子或其提取物中生物碱指纹图谱的建立方法。该方法采用反相高效液相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机相-缓冲液为流动相，所述的有机相-缓冲液的pH值为3.0～8.0，检测波长230～240nm，有机相占流动相体积百分比的20～70％，其中，有机相为乙腈或甲醇；所述的缓冲液为醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸缓冲液、三乙胺-醋酸铵-醋酸缓冲液、三乙胺-乙酸铵-醋酸缓冲液中的一种；用适量乌头碱、新乌头碱或次乌头碱配制对照品溶液；配制供试品溶液；精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，制定中药附子及其提取物中生物碱指纹图谱。文档编号G01N30/00GK101433604SQ20081020745公开日2009年5月20日申请日期2008年12月19日优先权日2008年12月19日发明者乔德水,刘跃跃,杨春艳,彬林,成王,高雪芹申请人:江苏万邦生化医药股份有限公司;上海复星医药(集团)股份有限公司