专利名称：一种动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法
技术领域：
本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是一种动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，尤其涉及氯氰碘柳胺和雷复尼特种两种兽药残留量的高效液相色谱检测方法。
背景技术：
水杨苯胺类(Salicylanilides)兽药包括氯氰碘柳胺(Closantel)和雷复尼特(Rafoxanide),是广谱抗菌和是一类广谱驱虫药。因其效价高，价格低廉，在国内外畜牧业中得到广泛应用，成为畜禽疾病防治的重要药物。氯氰碘柳胺对与血液循环接触密切或吸血性寄生的一些线虫和节支昆虫，如肝片吸虫、大片吸虫和巨片吸虫的成虫和幼虫，血矛线虫、仰口线虫、胃肠道线虫、食道口线虫、盖格属线虫、夏伯特线虫等均具有高效驱杀作用。 雷复尼特对治疗牛、羊等反刍兽肝片吸虫、片形吸虫病及血矛线虫具有很高的杀虫效力。随着水杨苯胺类兽药的广泛应用和研究，发现其具有毒、副作用。实验证明氯氰碘柳胺在大剂量使用时会对肝、肾造成损害。雷复尼特与蛋白结合率较高，半衰期较长，在组织内能残留较长时间。说明该药可能给受孕动物及其胚胎和胎儿的生长发育带来不良影响。同时，其肉、蛋、乳等动物性食品对人也可产生间接影响。这使水杨苯胺类兽药在动物源食品中的残留引起极大重视。目前，水杨苯胺类兽药残留量的检测方法主要有微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用技术等方法。SN/T1628-2005《进出口肉及肉制品中氯氰碘柳胺残留量测定方法高效液相色谱法》公开了肉及肉制品中氯氰碘柳胺残留量测定方法；SN/T1987-2007《进出口动物源性食品中雷复尼特残留量的检测方法高效液相色谱法》公开了动物源性食品中雷复尼特残留量的检测方法；StoeV G等应用HPLC-荧光检测法定量测定组织、牛乳中氯氰碘柳胺残留量。样品用乙腈提取，C18固相萃取柱萃取净化，最低检测限为10呢/kg。赵英等应用高效液相色谱法测定制剂中氯氰碘柳胺钠含量。
H.A. Benchaoui等应用高效液相法测定羊血中氯氰碘柳胺和雷复尼特残留量。
上述涉及动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量检测方法中，都只限于单个兽药残留量的检测，且前处理方法繁琐。本发明旨在利用高效液相色谱检测技术，建立一种可同时检测动物源食品中氯氰碘柳胺和雷复尼特残留量的检测方法。

发明内容
本发明的目的是克服现有不足问题，提供一种高效液相色谱法检测动物源食品中氯氰碘柳胺和雷复尼特残留量的方法，可方便、准确、高效地同时检测动物源食品中氯氰碘柳胺和雷复尼特两种兽药残留量。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，包括以下步骤
I、样品提取2、固相萃取柱净化
将上述提取液过固相萃取净化柱，待液面接近净化柱填料层上端时再加5 mL乙腈，流速约为I mL/min，收集所有流出液于鸡心瓶中，加5 mL正丙醇，在40 1下旋转浓缩至近干，用流动相溶解并定容至I mL，过0.45 Mm滤膜，供高效液相色谱测定。3、高效液相色谱仪测定
根据试样中氯氰碘柳胺和雷复尼特的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液，对标准工作溶液和样液等体积参插进样，测定标准工作溶液和样液中氯氰碘柳胺和雷复尼特的响应值。根据色谱峰保留时间定性，采用标准曲线法定量。作为优选，在步骤I中所述样品提取剂为乙腈。作为优选，在步骤2中所述固相萃取净化柱为中性氧化铝净化柱，规格100X10 mm (i. d.)填装中性氧化铝2 g，使用前经10 mL乙腈活化。作为优选，在步骤3中所述标准溶液的配置方法为配置单个标准储备液时，氯氰碘柳胺选用乙腈-甲醇溶液体系(9 :1，V/V)为溶剂，雷复尼特选用乙腈为溶剂。配置混合标准储备液时，选用乙腈为溶剂。作为优选，在步骤3中所述液相色谱分析条件为
a)色谱柱Cosmosil 5C18-AR- II (250 mmX4.6 mm, 5 Mm)
b)流动相甲醇-0. 1%甲酸水溶液(93. 5 :6. 5，v/v)。c)流速1.0 mL/min
d)柱温35°C
e)进样量50 ML
f)检测波长282 nm
进一步地，所述动物源食品选自牛肉、牛肝、牛肾。进一步地，所述水杨苯胺类兽药包括氯氰碘柳胺和雷复尼特至少一种。由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于
I、建立了动物组织(肌肉、肝脏、肾脏)中氯氰碘柳胺和雷复尼特兽药残留量的高效液相色谱检测方法。实现了对两种水杨苯胺类兽药的同时检测。2、对动物组织、肝脏、肾脏等富含蛋白质的样品采用乙腈去除蛋白质，结合均质法提取、低温高速离心分离，提取效率高，提取液中杂质溶出少。3、提取液采用中性氧化铝净化柱净化，通过对净化条件的优化，具有较好的净化效果，并保证两种水杨苯胺类兽药都有较高的回收率。4、与以往的方法比较，具有简便，快速、准确，灵敏度高等优点，氯氰碘柳胺和雷复尼特的检测低限均为lOPg/kg，平均回收率分别为氯氰碘柳胺73. 4 84.2%，雷复尼特72. 9 82.6%。变异系数(CV%)分别为氯氰碘柳胺6. 7 14. 7%，雷复尼特5. 7 19. 8%0方法的检测低限满足国内外相关法规的要求，精密度、回收率等技术指标符合相关标准的规定。5、本发明可应用于动物产品中水杨苯胺类兽药残留的检验中，对促进我国动物源食品的进出口贸易，确保食品安全，保障人类身体健康都具有十分重要的意义。


图I氯氰碘柳胺和雷复尼特标准溶液高效液相色谱图；图中保留时间(min):氯氰碘柳胺10. 965，雷复尼特14. 174 ；
图2 空白牛肉添加氯氰碘柳胺和雷复尼特标准溶液(10 u g/kg)高效液相色谱图；图中氯氰碘柳胺10. 966min，雷复尼特14. 175min ；
图3 空白牛肝添加氯氰碘柳胺和雷复尼特标准溶液(10 u g/kg)高效液相色谱图；图中氯氰碘柳胺10. 966min，雷复尼特14. 175min ；
图4空白牛肾添加氯氰碘柳胺和雷复尼特标准溶液(10 U g/kg)高效液相色谱图；图中氯氰碘柳胺10. 967min，雷复尼特14. 175min。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。实施例I牛肉中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法
I、样品提取确称取已切碎的牛肉样品5.0 g于100 mL具帽离心管中，加入20 mL乙腈，以10 000 r/min均质I min后，以8 000 r/min 4°C下离心5 min,取上清液。沉淀物再加入10 mL乙腈，重复提取一次，合并上清液，待净化。2、固相萃取柱净化将上述提取液直接过填装2 g的经10 mL乙腈活化过的中性氧化铝柱，待液面接近氧化铝层上端时再加5 mL乙腈，流速约为I mL/min，收集所有流出液于鸡心瓶中，加5 mL正丙醇，在40 °C下旋转浓缩至近干，用流动相溶解并定容至I mL，过0. 45 Mm滤膜，供高效液相色谱测定。3、高效液相色谱仪测定根据试样中被测物氯氰碘柳胺和雷复尼特的含量情况，选取响应值相近的标准工作溶液一起进行HPLC测定，对标准工作溶液和样液等体积参差进样，测定标准工作溶液和样液中氯氰碘柳胺和雷复尼特的响应值均应在仪器检测的线性范围内。根据峰保留时间定性，根据峰面积采用标准曲线法定量。液相色谱分析条件
色谱柱Cosmosil 5C18-AR- II (250 mmX4.6 mm, 5 Mm)
流动相甲醇0. I %甲酸水溶液=93. 5 :6. 5 (v/v)
流速1. 0 mL/min 柱温35°C 进样量50 ML 检测波长282 nm
4、线性关系试验将标准储备液逐级稀释，制备六个不同浓度的系列混合标准工作液，浓度范围为0. 03 u g/mL 2. 5 u g/mL,按浓度从低到高顺序，依照上述色谱条件和质谱条件测定。每一浓度测定3次，以标准溶液浓度Y (呢/mL)对峰面积平均值X (mAU)作标准曲线，计算回归方程和相关系数。氯氰碘柳胺标准曲线回归方程Y=57. 7572 X + 0. 045，相关系数r = 0. 99993 雷复尼特的标准曲线回归方程Y=42. 9658 X+ 0. 009，相关系数r = 0. 99996
5、回收率和精密度试验准确称取不含氯氰碘柳胺、雷复尼特的牛肉样品，分别添加3个不同含量水平的氯氰碘柳胺和雷复尼特，添加水平见表I。每个浓度进行6个平行样品，按上述依照上述色谱条件进行分析。回收率和变异系数计算结果见表2。表I回收率和精密度试验添加水平(μ g/kg)
权利要求
1.一种动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤 (1)样品提取 加入20 mL提取剂，以10 000 r/min均质I min后，以8 000 r/min 4°C下离心5 min,取上清液，沉淀物再加入10 mL提取剂，重复提取一次，合并上清液，待净化； (2)固相萃取柱净化 将上述提取液过中性氧化铝净化柱，待液面接近氧化铝层上端时再加5 mL乙腈，流速约为I mL/min，收集所有流出液于鸡心瓶中，加5 mL正丙醇，在40 °C下旋转浓缩至近干，用流动相溶解并定容至I mL，过0. 45 Mm滤膜，供高效液相色谱测定； (3)高效液相色谱仪测定 根据试样中氯氰碘柳胺和雷复尼特的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液，对标准工作溶液和样液等体积参插进样，测定标准工作溶液和样液中氯氰碘柳胺和雷复尼特的响应值； 根据色谱峰保留时间定性，采用标准曲线法定量。
2.根据权利要求I所述的动物源食品中动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(I)中样品提取剂为乙腈。
3.根据权利要求I所述的动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述固相萃取净化柱为中性氧化铝净化柱，规格100X10 mm (i.d.)填装中性氧化铝2 g，使用前经10 mL乙腈活化。
4.根据权利要求I所述的动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述所述标准溶液的配置方法为配置单个标准储备液时，氯氰碘柳胺选用乙腈-甲醇溶液体系(9 :1，V/V)为溶剂，雷复尼特选用乙腈为溶剂；配置混合标准储备液时，选用乙腈为溶剂。
5.根据权利要求I所述的动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述液相色谱分析条件为色谱柱Cosmosil 5C18-AR- II (250 mmX4.6 mm, 5 Mm) 流动相甲醇-0. 1%甲酸水溶液(93. 5 6. 5, v/v) 流速1. 0 mL/min 柱温35°C 进样量50 ML 检测波长282 nm。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述动物源食品选自牛肉、牛肝、牛肾的至少一种。
7.根据权利要求I至5中任一项所述的动物源食品中水杨苯胺类类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述水杨苯胺类兽药包括氯氰碘柳胺和雷复尼特至少一种。
全文摘要
本发明涉及分析化学、食品安全领域。一种动物源食品中水杨苯胺类兽药残留量的检测方法，样品经乙腈提取，提取液经中性氧化铝层析柱净化后，采用5C18-AR-Ⅱ(色谱柱，以甲醇－0.1﹪甲酸水溶液体系为流动相，以紫外检测器检测，用高效液相色谱分离与检测两种水杨苯胺类兽药。本发明在0.03μg/mL～2.5μg/mL浓度范围内，氯氰碘柳胺、雷复尼特含量(X)与峰面积(Y)有良好的线性关系。氯氰碘柳胺和雷复尼特的检测低限均为10μg/kg，平均回收率分别为氯氰碘柳胺73.4～84.2％，雷复尼特72.9～82.6％。变异系数(CV%)分别为氯氰碘柳胺6.7～14.7％，雷复尼特5.7～19.8％。方法的检测限、回收率和精密度等技术指标满足国内外对氯氰碘柳胺和雷复尼特兽药残留量检测的有关要求。
文档编号G01N30/88GK102778525SQ20111009674
公开日2012年11月14日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者于灵, 孙兴权, 徐伟, 林维宣 申请人:林维宣