专利名称：细胞的识别装置和识别方法
技术领域：
本发明涉及细胞的识别装置和识别方法。特别涉及基于透过光信号的变动来对分散在流过流径内的液体中的循环癌细胞进行识别的细胞的识别装置和识别方法。
背景技术：
提出了按照使样本(被检微小物)分散的液体在毛细管内流过的方式，来自光源的光照射该液体流，从而测量液体流中的样本的光信息(荧光信息)的技术(例如，参照专利文献1)。此外，近年来，作为早期发现癌的方法，检测转移到末梢血(peripheral blood)中的癌细胞即循环癌细胞的方法受到了瞩目。例如，提出了如下的方法禾_细胞表面的抗体 /抗原反应，磁性分离用微细的铁珠标记的乳癌癌细胞，进而用APC(活性化蛋白质C)标记混入了少许的白血球来加以除去，从而仅对存在于末梢血中的乳癌癌细胞进行识别。专利文献1专利第四73387号公报但是，在上述的利用细胞表面的抗体/抗原反应来检测循环癌细胞的方法中，需要开发对应于乳癌、胃癌等癌种类的抗体，虽然当前已开发了对应于乳癌的抗体，但未开发出对应于其他癌的抗体，存在必须开发对应于癌种类的抗体的问题。

发明内容
因此，本发明是为了解决如上所述的问题点而完成的，其目的在于提供一种无须利用细胞表面的抗体/抗原反应就能够识别循环癌细胞细胞的识别装置和识别方法。本发明者在针对上述的问题专心研究的结果，发现了基于对使末梢血中的细胞分散的液体照射光而检测出的、该细胞的透过光信号的变动的极点值，能够识别循环癌细胞， 从而完成了本发明。这里，透过光是指通过了使细胞分散的液体的光、通过了细胞的光、由细胞反射/ 散射/衍射的光等由受光部接收到的光，透过光信号是指将透过光转换为电信号的信号。 在接收透过光的任意区域中，始终接收到光，但在细胞测量时，会在光接收功率(透过光信号)中产生变动。将该变动的峰值、宽度、面积等称为透过光信息。S卩，本发明的第1方式的细胞识别装置识别末梢血中的不同的细胞和细胞种类， 该细胞识别装置的特征在于，具备照射部，其向使末梢血中的所述细胞分散后的液体照射一定功率的单模光来作为照射光；受光部，其使处于所述细胞相对于所述照射光的相对位置勻速变化的状态的所述液体接收基于从所述照射部照射的所述照射光而产生的所述液体的透过光，并作为透过光信号来输出，且该受光部设置在与所述照射部正对的位置上；测量部，其输入从所述受光部输出的所述透过光信号，并测量所述细胞引起的所述透过光信号的变动；以及识别部，其基于由所述测量部测量出的所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极点值，识别末梢血中的所述细胞。这里，末梢血细胞是指存在于末梢血中的细胞即白血球、红血球和血小板，末梢血中的细胞是指末梢血细胞即白血球、红血球、血小板和末梢血细胞以外的细胞(白血球、红血球和血小板以外的细胞)。此外，白血球分为淋巴球、单核细胞、颗粒球。此外，不同的细胞种类是指细胞种类不同的细胞，不同的细胞是指即使是相同种类的细胞，在细胞周期等细胞状态不同时识别为不同的细胞的细胞。本发明的第2方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1方式的细胞识别装置， 其特征在于，在将没有所述细胞的状态下的所述液体的所述透过光信号设为基准值时，所述识别部比较所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极大点的值和所述基准值，在所述极大点的值为所述基准值以上时，识别为该细胞是末梢血细胞以外的细胞。此外，虽然记载为在透过光信号的变动中，在极大点的值为基准值以上时，识别为细胞是末梢血细胞以外的细胞，但由于在测量开始时和测量结束时透过光信号成为基准值，所以并不包括这种情况。此时，也可以通过在极大点的值比基准值大时，识别为细胞是末梢血细胞以外的细胞，从而不识别测量开始时和测量结束时的基准值。本发明的第3方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1或第2方式的细胞识别装置，其特征在于，由所述识别部识别为末梢血细胞以外的细胞的所述细胞是循环癌细胞。此外，循环癌细胞是转移到末梢血中的癌细胞。本发明的第4方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1至第3方式的任一方式所述的细胞识别装置，其特征在于，所述细胞是被实施了包括细胞表面抗体/抗原反应、细胞内的荧光蛋白表达在内的荧光处理的细胞。本发明的第5方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1至第4方式的任一方式所述的细胞识别装置，其特征在于，所述测量部还根据所述透过光信号的变动，测量透过光信息，所述识别部还基于由所述测量部测量出的所述透过光信息，识别末梢血中的所述细胞。本发明的第6方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1至第5方式的任一方式所述的细胞识别装置，其特征在于，还具备第二受光部，该第二受光部接收基于从所述照射部照射的所述照射光而产生的所述细胞的散射光和/或荧光，并作为散射/荧光信号而输出，并且该第二受光部设置在与所述照射部正对的位置以外的位置上，所述测量部还输入从所述第二受光部输出的所述散射/荧光信号，并测量所述细胞引起的所述散射/荧光信号的变动，所述识别部还基于由所述测量部测量出的所述散射/荧光信号的变动，识别末梢血中的所述细胞。本发明的第7方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1至第6方式的任一方式所述的细胞识别装置，其特征在于，所述测量部还根据所述散射/荧光信号的变动，测量散射/荧光信息，所述识别部还基于由所述测量部测量出的所述透过/荧光信息，识别末梢血中的所述细胞。本发明的第8方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1至第7方式的任一方式所述的细胞识别装置，其特征在于，所述照射光是非聚光的单模光。本发明的第9方式的细胞识别装置是上述的本发明的第1至第8方式的任一方式所述的细胞识别装置中，其特征在于，还具备分取部，该分取部将由所述识别部识别出的末梢血中的所述细胞分取到规定的容器中。本发明的第1方式的细胞识别方法识别末梢血中的细胞，并使用了照射部和受光部，所述照射部向使末梢血的细胞分散后的液体照射一定功率的单模光来作为照射光，所述受光部设置在与所述照射部正对的位置上且接收透过光后作为透过光信号而输出给测量部，该细胞识别方法的特征在于，具备(a)从所述照射部向处于所述细胞相对于所述照射光的相对位置勻速变化的状态的所述液体照射所述照射光的步骤；(b)由所述受光部接收基于所述照射光而产生的所述液体的透过光，并作为透过光信号而输出给所述测量部的步骤；(C)在所述测量部中输入由所述步骤(b)输出的所述透过光信号，并在该测量部中测量所述细胞引起的所述透过光信号的变动的步骤；以及(d)基于由所述步骤(C)测量出的所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极点值，识别末梢血中的所述细胞的步骤。本发明的第2方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1方式的细胞识别方法， 其特征在于，在将没有所述细胞的状态下的所述液体的所述透过光信号设为基准值时，所述步骤(d)比较所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极大点的值和所述基准值，在所述极大点的值为所述基准值以上时，识别为该细胞是末梢血细胞以外的细胞。本发明的第3方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1或第2方式的细胞识别方法，其特征在于，由所述步骤(d)识别为末梢血细胞以外的细胞的所述细胞是循环癌细胞。本发明的第4方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1至第3方式的任一方式所述的细胞识别方法，其特征在于，所述细胞是被实施了包括细胞表面抗体/抗原反应、细胞内的荧光蛋白表达在内的荧光处理的细胞。本发明的第5方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1至第4方式的任一方式所述的细胞识别方法，其特征在于，所述步骤(c)还根据所述透过光信号的变动，测量透过光信息，所述步骤(d)还基于由所述步骤(c)测量出的所述透过光信息，识别末梢血中的所述细胞。本发明的第6方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1至第5方式的任一方式所述的细胞识别方法，其特征在于，所述细胞识别方法还使用第二受光部，该第二受光部接收基于从所述照射部照射的所述照射光而产生的所述细胞的散射光和/或荧光，并作为散射/荧光信号而输出给所述测量部，并且该第二受光部设置在与所述照射部正对的位置以外的位置上，所述步骤(b)还通过所述第二受光部接收基于所述照射光而产生的所述细胞的散射光和/或荧光，并作为所述散射/荧光信号而输出给所述测量部，所述步骤(c)还在所述测量部中输入由所述步骤(b)输出的所述散射/荧光信号，并在该测量部中测量所述细胞引起的所述散射/荧光信号的变动，所述步骤(d)还基于由所述步骤(C)测量出的所述散射/荧光信号的变动，识别末梢血中的所述细胞。本发明的第7方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1至第6方式的任一方式所述的细胞识别方法，其特征在于，所述步骤(C)还根据所述散射/荧光信号的变动，测量散射/荧光信息，所述步骤(d)还基于由所述步骤(c)测量出的所述散射/荧光信息，识别末梢血中的所述细胞。本发明的第8方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1至第7方式的任一方式所述的细胞识别方法，其特征在于，所述照射光是非聚光的单模光。本发明的第9方式的细胞识别方法是上述的本发明的第1至第8方式的任一方式所述的细胞识别方法，其特征在于，还具备(e)将由所述步骤(d)识别出的末梢血中的所述细胞分取到规定的容器中的步骤。(发明效果)根据本发明的细胞的识别装置和识别方法，无须利用细胞表面的抗体/抗原反应，能够识别转移到末梢血中的癌细胞，即循环癌细胞。


图1是本发明的一实施方式的细胞识别装置10的示意侧视图。图2是图1的K-K线的剖视图。图3是表示由本发明的一实施方式的细胞识别装置10的测量部40测量出的、透过光信号SGl相对于末梢血中的细胞的变动波形的特征的图。图4是表示由本发明的一实施方式的细胞识别装置10的测量部40测量出的、透过光信号SGl相对于循环癌细胞的变动结果的一例的图。图5是用于说明使用了本发明的一实施方式的细胞识别装置10的细胞的识别处理步骤的流程图。图6是本发明的一实施方式的其他细胞识别装置IOa的示意侧视图。图7是图6的K-K线的剖视图。图8是用于说明使用了本发明的一实施方式的其他细胞识别装置IOa的细胞的识别处理步骤的流程图。图中10、10a-细胞识别装置；11-液体；IlS-样本流；15-毛细管；19-鞘流； 20-照射部；30-受光部；40-测量部；50-识别部；60-分取部；70-供给部；80-第二受光部； S-细胞；L-照射光；SGl-透过光信号；SG2-散射/荧光信号。
具体实施例方式以下，基于附图详细说明本发明的实施方式。图1是本发明的一实施方式的细胞识别装置10的示意侧视图，图2是图1的K-K 线的剖视图。如图1和图2所示，本发明的一实施方式的细胞识别装置10包括毛细管 (capillary) 15，其用于使样本流IlS流过；照射部20，其照射一定功率的单模光作为照射光L ；受光部30，其接收透过光Ll并将其作为透过光信号SGl来输出；测量部40，其输入从受光部30输出的透过光信号SG1，从而测量细胞S引起的透过光信号SGl的变动；识别部 50，其基于细胞S引起的透过光信号SGl的变动，识别该细胞S是否为末梢血细胞；分取部 60，其基于识别部50的识别结果，将细胞S分取到规定的容器中；以及供给部70，其用于对毛细管15提供样本流11S。供给部70对使从末梢血中取出的细胞分散的液体11，执行去除红血球和血小板的处理(以下，称为前处理)。然后，将通过前处理而留下的红血球和血小板以外的末梢血中的细胞设为细胞S。供给部70将使细胞S分散的液体11作为样本流IlS来使其与鞘 (sheath)流19 一同流向Z方向(在图1中是从上侧向下侧的方向)，并经由管(tube) 14提供给毛细管15。此外，供给部70调整样本流IlS和鞘流19的压力，从而调整在毛细管15 内的液体11中分散的细胞S的速度和流量。
此外，分散在上述的液体11中的细胞S是从末梢血中取出的细胞，但也可以是对从末梢血中取出的细胞实施了包括核染色、细胞表面的抗体/抗原反应、细胞内的荧光蛋白表达等在内的荧光处理的细胞。此外，前处理的步骤例如是，首先，利用MilliQ (纯水)将包含溶血剂和固定剂 (甲醛)这两者的人体专用溶血剂(FACS Lysing Solution)稀释10倍，并在15ml的试验管中装入6. 5 7ml。接着，在试验管中加入Iml的全血检体(稳定的人红血球和白血球的悬浮液，且具有典型、正常的人全血所具有的溶血、散射光、抗原发现和抗体染色性)，利用移液管(pipette)平稳地混合，并在室温中保管15 30分钟。之后，以IOOOrpm进行5 分钟的离心分离，吸引上清液，并增加5ml的磷酸盐缓冲液(PBS)后再次进行悬浮。将重复了 3次该离心分离和再次悬浮的样本在室温下保管两个小时，进一步在4°C下保管M小时。 最后，使样本通过40 μ m网眼(mesh)的过滤器后结束前处理。照射部20对毛细管15内的液体11照射一定功率的单模光作为照射光L。例如， 如图1和图2所示，照射部20由激光光源21和照射用的光纤22构成。作为激光光源21， 例如有激光二极管这样的光源。此外，在对毛细管15内的液体11照射照射光L时，供给部 70调整样本流IlS和鞘流19的压力，使得细胞S相对于来自照射部20的照射光L的相对位置勻速地变化。这里，优选照射光L为非聚光的单模光。此外，单模光具有高斯分布的强度模型。受光部30设置在经由毛细管15与照射部20正对的位置，并接收基于照射光L的液体11的透过光Li，并作为透过光信号SGl而输出给测量部40。例如，如图1和图2所示， 受光部30由受光用的光纤31和受光元件32构成。此外，作为受光元件32，例如有光电倍增管、光检测器这样的元件。这里，优选照射部20的第一光轴Dl和受光部30的第二光轴
D2 一致。此外，在对毛细管15内的液体11照射照射光L时，供给部70调整样本流IlS和鞘流19的压力，使得细胞S相对于照射光L的相对位置勻速地变化。由此，受光部30接收细胞S相对于照射光L的相对位置勻速地变化的状态的液体11的透过光Ll，并作为透过光信号SGl而输出给测量部40。测量部40输入从受光部30输出的透过光信号SGl，测量细胞S引起的透过光信号 SGl的变动，并将该测量结果输出给识别部50。这里，细胞S引起的透过光信号SGl的变动是因为构成细胞S的物质(例如，细胞核等)的种类、形状、大小、个数等差异而导致的照射光L透过细胞S时的光的衍射现象、光的干涉现象、光的吸收现象、光的散射现象等所引起的。识别部50基于从测量部40输入的细胞S引起的透过光信号SGl的变动中的极点值，识别细胞S。即，识别细胞S是末梢血细胞(即，白血球)，还是末梢血细胞以外的细胞。 在这里，仅根据透过光信号SGl的变动中的极点值进行细胞S的识别，但也可以组合极点值和极点的个数来进行细胞S的识别。此外，识别处理的细节将在后面叙述。分取部60基于由识别部50识别出的识别结果，在分取末梢血细胞时，将作为末梢血细胞的细胞S分取到规定的容器(未图示)中，而在分取末梢血细胞以外的细胞时，将作为末梢血细胞以外的细胞的细胞S分取到规定的容器(未图示)中。接着，参照图3和图4以及表1说明在本发明的一实施方式的细胞识别装置10的识别部50中执行的细胞S的识别处理的细节。图3是表示由本发明的一实施方式的细胞识别装置10的测量部40测量出的、透过光信号SGl相对于末梢血中的细胞的变动波形的特征的图。如图3所示，能够将透过光信号SGl相对于末梢血中的细胞的变动波形分类为如下的四个波形图案如图3(a)所示的具有一个极小点的第一波形图案；如图3(b)所示的具有两个极小点且极大点的值在基准值A以下的第二波形图案；如图3 (c)所示的具有三个以上的极小点且极大点的值在基准值A以下的第三波形图案；以及如图3(d)所示的极大点的值比基准值A大的第四波形图案。这里，将没有细胞S的状态的液体11的透过光信号 SGl的值设为基准值A。此外，在细胞S引起的透过光信号SGl的变动的极大点中排除如下的变动，即细胞S引起的透过光信号SGl的测量结束时，在附近产生的过冲(overshoot) 所引起的变动。此外，若仅关注极点值，则只有第四波形图案具有极点值比基准值A大的值，在第一波形图案、第二波形图案以及第三波形图案中，极点值全部在基准值A以下。接着，在表1中表示由本发明的一实施方式的细胞识别装置10的测量部40测量出透过光信号SGl相对于末梢血中的白血球的变动波形的结果。表1是表示了对于混有淋巴球、单核细胞、颗粒球的白血球和只有淋巴球的白血球的上述四个波形图案的测量比例 (% )的表。表1
权利要求
1.一种细胞识别装置，其识别末梢血中的不同的细胞和细胞种类，该细胞识别装置的特征在于，具备照射部，其向使末梢血中的所述细胞分散后的液体照射照射光； 受光部，其使处于所述细胞相对于所述照射光的相对位置勻速变化的状态的所述液体接收基于从所述照射部照射的所述照射光而产生的所述液体的透过光，并作为透过光信号来输出，且该受光部设置在与所述照射部正对的位置上；测量部，其输入从所述受光部输出的所述透过光信号，并测量所述细胞引起的所述透过光信号的变动；以及识别部，其基于由所述测量部测量出的所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极点值，识别末梢血中的所述细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞识别装置，其特征在于，在将没有所述细胞的状态下的所述液体的所述透过光信号设为基准值时，所述识别部比较所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极大点的值和所述基准值，在所述极大点的值为所述基准值以上时，识别为该细胞是末梢血细胞以外的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞识别装置，其特征在于，由所述识别部识别为末梢血细胞以外的细胞的所述细胞是循环癌细胞。
4.根据权利要求1至3的任一项所述的细胞识别装置，其特征在于，所述细胞是被实施了包括细胞表面抗体/抗原反应、细胞内的荧光蛋白表达在内的荧光处理的细胞。
5.根据权利要求1至4的任一项所述的细胞识别装置，其特征在于， 所述测量部还根据所述透过光信号的变动，测量透过光信息，所述识别部还基于由所述测量部测量出的所述透过光信息，识别末梢血中的所述细胞。
6.根据权利要求1至5的任一项所述的细胞识别装置，其特征在于，该细胞识别装置还具备第二受光部，该第二受光部接收基于从所述照射部照射的所述照射光而产生的所述细胞的散射光和/或荧光，并作为散射/荧光信号而输出，并且该第二受光部设置在与所述照射部正对的位置以外的位置上，所述测量部还输入从所述第二受光部输出的所述散射/荧光信号，并测量所述细胞引起的所述散射/荧光信号的变动，所述识别部还基于由所述测量部测量出的所述散射/荧光信号的变动，识别末梢血中的所述细胞。
7.根据权利要求1至6的任一项所述的细胞识别装置，其特征在于， 所述测量部还根据所述散射/荧光信号的变动，测量散射/荧光信息，所述识别部还基于由所述测量部测量出的所述透过/荧光信息，识别末梢血中的所述细胞。
8.根据权利要求1至7的任一项所述的细胞识别装置，其特征在于， 所述照射光是非聚光的单模光。
9.根据权利要求1至8的任一项所述的细胞识别装置，其特征在于，该细胞识别装置还具备分取部，该分取部将由所述识别部识别出的末梢血中的所述细胞分取到规定的容器中。
10.一种细胞识别方法，该细胞识别方法识别末梢血中的细胞，并使用了照射部和受光部，所述照射部向使末梢血中的细胞分散后的液体照射照射光，所述受光部设置在与所述照射部正对的位置上且接收透过光后作为透过光信号而输出给测量部，该细胞识别方法的特征在于，具备(a)从所述照射部向处于所述细胞相对于所述照射光的相对位置勻速变化的状态的所述液体照射所述照射光的步骤；(b)由所述受光部接收基于所述照射光而产生的所述液体的透过光，并作为透过光信号而输出给所述测量部的步骤；(c)在所述测量部中输入由所述步骤(b)输出的所述透过光信号，并在该测量部中测量所述细胞引起的所述透过光信号的变动的步骤；以及(d)基于由所述步骤(c)测量出的所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极点值，识别末梢血中的所述细胞的步骤。
11.根据权利要求10所述的细胞识别方法，其特征在于，在将没有所述细胞的状态下的所述液体的所述透过光信号设为基准值时，所述步骤 (d)比较所述细胞引起的所述透过光信号的变动中的极大点的值和所述基准值，在所述极大点的值为所述基准值以上时，识别为该细胞是末梢血细胞以外的细胞。
12.根据权利要求10或11所述的细胞识别方法，其特征在于，由所述步骤(d)识别为末梢血细胞以外的细胞的所述细胞是循环癌细胞。
13.根据权利要求10至12的任一项所述的细胞识别方法，其特征在于，所述细胞是被实施了包括细胞表面抗体/抗原反应、细胞内的荧光蛋白表达在内的荧光处理的细胞。
14.根据权利要求10至13的任一项所述的细胞识别方法，其特征在于，所述步骤(c)还根据所述透过光信号的变动，测量透过光信息，所述步骤(d)还基于由所述步骤(c)测量出的所述透过光信息，识别末梢血中的所述细胞。
15.根据权利要求10至14的任一项所述的细胞识别方法，其特征在于，所述细胞识别方法还使用第二受光部，该第二受光部接收基于从所述照射部照射的所述照射光而产生的所述细胞的散射光和/或荧光，并作为散射/荧光信号而输出给所述测量部，并且该第二受光部设置在与所述照射部正对的位置以外的位置上，所述步骤(b)还通过所述第二受光部接收基于所述照射光而产生的所述细胞的散射光和/或荧光，并作为所述散射/荧光信号而输出给所述测量部，所述步骤(c)还在所述测量部中输入由所述步骤(b)输出的所述散射/荧光信号，并在该测量部中测量所述细胞引起的所述散射/荧光信号的变动，所述步骤(d)还基于由所述步骤(c)测量出的所述散射/荧光信号的变动，识别末梢血中的所述细胞。
16.根据权利要求10至15的任一项所述的细胞识别方法，其特征在于，所述步骤(c)还根据所述散射/荧光信号的变动，测量散射/荧光信息，所述步骤(d)还基于由所述步骤(c)测量出的所述散射/荧光信息，识别末梢血中的所述细胞。
17.根据权利要求10至16的任一项所述的细胞识别方法，其特征在于， 所述照射光是非聚光的单模光。
18.根据权利要求10至17的任一项所述的细胞识别方法，其特征在于，该细胞识别方法还具备(e)将由所述步骤(d)识别出的末梢血中的所述细胞分取到规定的容器中的步骤。
全文摘要
本发明提供一种无须利用细胞表面的抗体/抗原反应就能够识别循环癌细胞的细胞的识别装置和识别方法。细胞识别装置具备毛细管，其用于使样本流流过；照射部，其照射照射光；受光部，其接收透过光并作为透过光信号而输出；测量部，其输入从受光部输出的透过光信号，测量细胞引起的透过光信号的变动；识别部，其基于由测量部测量出的细胞引起的透过光信号的变动中的极点值，识别细胞是否为末梢血细胞；分取部，其基于识别部的识别结果，将细胞分取到规定的容器中；以及供给部，其用于向毛细管提供样本流。
文档编号G01N21/64GK102272581SQ201080001873
公开日2011年12月7日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者徐杰, 月井健, 高桥亨 申请人:古河电气工业株式会社