专利名称：一种检测中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法， 特别是涉及采用高效液相色谱-紫外检测法测定，液相色谱-质谱联用确证中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法。
背景技术：
雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol， DON)毒素是两种最主要的B类单端孢霉烯族毒素，属镰刀菌毒素，是镰刀菌属中多种真菌所产生的次生代谢产物，在自然界中分布极为广泛，是自然发生的最危险的食品、农产品污染物，对人畜健康危害十分严重。DON是摄食与生长抑制剂，其毒性作用表现为厌食，恶心呕吐，腹泻，代谢紊乱等，研究发现DON还具有很强的细胞毒性，并对免疫系统和造血系统有损害。NIV常与DON共存，其在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON 强10倍。由于镰刀菌为土壤习居菌，很多中药易受到镰刀菌的侵染，是很多根和根茎类药材根腐病的主要致病菌，而上述镰刀菌中部分为产毒菌，可产生NIV和DON毒素，因此，很有必要对中药中NIV和DON毒素进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。

发明内容
到目前为止，国内外报道的方法大多仅限于对食品、农产品以及饲料NIV和DON毒素的分析，对中药中NIV和DON的分析，目前还是空白。因此对中药中NIV和DON毒素测定方法的建立研究迫在眉睫。现有的测定食品、农产品以及饲料中的NIV和DON毒素的方法， 由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都较容易测定。本发明克服现有技术不足，选择了适用于中药中NIV和DON毒素的提取、净化方法，优化了高效液相，液质条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好，故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的NIV和DON毒素进行测定。本发明是通过采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药中的NIV和DON毒素的方法，同时建立了中药中NIV和DON毒素的液相色谱-质谱联用确证法。具体的不同基质中药中NIV和DON毒素测定的方法，可以通过以下步骤实现仪器、药品及材料仪器Waters 600高效液相色谱系统，美国Waters公司，包括Waters 600 控制器；Waters 600 色谱泵；Waters 486紫外可见光检测器；
Empower色谱工作站；CBL Model 100 型柱温箱，美国 Photoelectron iTechnologyag ；AgelaVenusilMPCIS色谱柱，北京艾杰尔科技有限公司；RE-52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GF-I型高速均质器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Puri ToxSR TC-T200呕吐毒素(DON)专用净化柱，美国Trilogy分析实验室。对照品DON和NIV标准品都购自日本WAKO公司，纯度彡99% ；色谱分析用乙腈、甲醇均为为色谱纯，美国Thermo Fisher科技公司；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。。样品所测中药样品均为市场上随机购买而来，经北京协和医学院药用植物研究所张本刚教授鉴定，低温干燥后备用。1、高效液相色谱检测法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器，检测波长 218士2nm，以水-乙腈-甲醇为流动相，流速0. 8-1. OmL/min ；柱温20-300C0b.溶液配制对照品溶液的制备取NIV和DON标准品适量，加流动相或乙腈制成溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加乙腈-水混合溶剂，提取，静置，过滤， 滤液备用。样品净化吸取上述滤液到呕吐毒素专用净化柱顶端，过柱，收集纯化液到梨形瓶中，加乙腈-水(80:20，V/V)洗柱两次，收集至上述梨形瓶中，减压蒸干。残渣加甲醇或流动相溶解，过滤后备用。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。2、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-醋酸铵水为流动相；柱温 20-30 0C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择负离子监测模式；全扫描模式扫描。c.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用系统， 测定。上述的中药中NIV和DON毒素的测定方法，优选以下步骤1、高效液相色谱检测法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器，检测波长 218士2nm，以水-乙腈-甲醇(88-90 5-6 5-6,V/V/V)为流动相，流速0. 8-1. OmL/min ； 柱温 20-30°C。b.溶液配制
对照品溶液的制备取NIV和DON毒素标准品适量，加乙腈或流动相制成每mL含 80-120 μ g/mL 溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末20_30g(精确至0. lg)，置具塞锥形瓶中，加80_120mL乙腈-水(80 20，V/V)混合溶剂，用高速均质器提取aiiin，静置，过滤，滤液备用。样品净化吸取上述滤液4mL到呕吐毒素专用净化柱顶端，过柱，收集纯化液到 25mL梨形瓶中，加4-6mL乙腈-水(80 20，V/V)洗柱两次，收集至上述梨形瓶中，减压蒸干。残渣加1. 0-1. 2mL流动相溶解，0. 45 μ m滤膜过滤后备用。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液40-50 μ L，注入液相色谱仪，测定。2、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%醋酸铵水 (15-25 75-85，V/V)为流动相；柱温 20-30 °C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择负离子监测模式；干燥气流速 2. 5士0. 5L/min ；干燥气温度380-400°C ；碎裂电压140-160V ；全扫描模式扫描。c.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液5-10μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。本发明中药中NIV和DON毒素的测定方法，更优选的技术方案可以按下列测定步骤进行1、高效液相色谱检测法测定中药中的NIV和DON毒素a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，紫外检测器，检测波长218nm， 以水-乙腈-甲醇(90 5 5，V/V/V)为流动相，流速:0. 8mL/min ；柱温25°C。b.溶液配制对照品溶液的制备取NIV和DON标准品适量，加乙腈制成每ml含100 μ g/mL溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末25. Og (精确至0. Ig)，置具塞锥形瓶中，加IOOmL乙腈-水 (80 20，V/V)混合溶剂，用高速均质器提取aiiin，静置，过滤，滤液备用。样品净化吸取上述滤液4mL到呕吐毒素专用净化柱顶端，过柱，收集纯化液到 25mL梨形瓶中，加4mL乙腈-水(80 20，V/V)洗柱两次，收集至上述梨形瓶中，60°C减压蒸干。残渣加ImL流动相水-乙腈-甲醇(90 5 5，V/V/V)溶解，0.45μπι滤膜过滤后d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液50 μ L，注入液相色谱仪，测定。2、采用高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果进行确证。a.液相条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%醋酸铵水 (20 80，V/V)；柱温 25 0C ；b.质谱条件用大气压化学电离方式电离；选择负离子监测模式；干燥气流速 2. 5L/min ；干燥气温度400°C ；碎裂电压150V ；全扫描模式扫描，扫描范围200-400m/z。c.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，测定。
经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为中药中NIV和DON毒素的测定方法。本发明提供了不同中药中NIV和DON毒素的高效液相-紫外检测法；不同中药中 NIV和DON毒素的液相色谱-质谱确证法。结果准确，重现性好，可作为不同基质中药中NIV 和DON毒素的测定方法。1、高效液相色谱检测法测定中药中的NIV和DON毒素(1)净化方法的选择中药中成分复杂，样品提取液中含有大量杂质，选用合适的净化柱处理样品是很重要的，试验以三七为代表性样品，以其加样回收率为指标，对几种常用的净化柱进行了比较优选，结果如表1-1。实验最终选择T200呕吐毒素(DON)专用净化柱为前处理小柱。表1-1净化方法筛选结果
、
净化柱NIV平均冋收率(％)DON平均冋收率(％)Mycosep 225多功能净化柱56.094.8Bond Elut Mycotoxin-SPE 柱60.190.5M160多功能净化柱82.297.4T220单端孢霉烯族毒素专用净化柱68.893.1T200呕吐毒素(DON)专用净化柱83.898.4(2)提取溶剂体系的选择在样品的提取阶段，选择适当极性的提取溶剂对提高回收率十分重要。我们比较了甲醇-水(80 20，V/V)、甲醇-水(70 30，V/V)、乙腈-水(84 16，V/V)、乙腈-水 (80 20, V/V)和乙腈-水(70 30, V/V)这几种不同提取溶剂的回收率情况。结果见表1-2。当采用甲醇-水(70 30，V/V)做为提取溶剂时的回收率最低。而采用乙腈-水 (80 20，V/V)做为提取溶剂时，回收率最高，因此我们确定了最佳的提取溶剂为乙腈-水 (80 20，V/V)。表1-2提取溶剂筛选结果
权利要求
1.一种检测中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用高效液相色谱-紫外检测法法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；(2)用液相色谱-质谱联用检测法确证中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；
2.根据权利要求1的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法， 其特征在于该方法包括下列步骤(1)用高效液相色谱-紫外检测法法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；a.色谱条件用反相色谱柱分离，以水-乙腈-甲醇为流动相，流速0.6-1. OmL/min，柱温20-30°C，紫外检测器检测，检测波长218士2nm。b.溶液配制对照品溶液的配制分别称取对照品适量，加流动相或乙腈制成溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末，置具塞锥形瓶中，加乙腈-水混合溶剂，用高速均质器提取，过滤O样品净化吸取上述滤液到净化柱顶端，过柱，收集纯化液到梨形瓶中，取出活塞，加乙腈/水到柱子顶端。将所有溶液彻底过柱，收集到梨形瓶中，在60°c蒸干。残渣加水-乙腈-甲醇混合溶剂溶解，过滤。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱仪，测定。(2)用液相色谱-质谱联用检测法确证中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；a.色谱条件用反相色谱柱分离，甲醇-醋酸铵水为流动相，柱温20-30°C，流速为 0. 1-0. 3mL/min。b.质谱条件大气压化学电离，负离子模式，干燥气流速2-3L/min，干燥气温度 380-420°C，碎裂电压 140-160V。c.分别精密吸取对照品和样品溶液，注入液相色谱-质谱联用仪，确证。
3.根据权利要求2的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法， 其特征在于该方法包括下列步骤(1)用高效液相色谱-紫外检测法法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；a.色谱条件用C18反相色谱柱分离，以水-乙腈-甲醇(80-90 5-10 5-10，V/V/ V)为流动相，流速0. 8-1. OmL/min，柱温25_30°C，紫外检测器检测，检测波长218士2nm。b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取对照品适量，加乙腈制成溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末20-30g(精确到0. Ig)，置250mL具塞锥形瓶中，加乙腈-水 (80 20，V/V)混合溶剂，用高速均质器提取l-^iiin，静置过滤。样品净化吸取上述滤液4mL到净化柱顶端，向下推活塞，使溶液完全过柱，收集纯化液到梨形瓶中，取出活塞，加2X4mL乙腈/水到柱子顶端。将所有溶液彻底过柱，收集到梨形瓶中，在60°C蒸干。残渣加水-乙腈-甲醇(90 5 5，V/V/V)混合溶剂溶解，过滤。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液40-60 μ L，注入液相色谱仪，测定。(2)用液相色谱-质谱联用检测法确证中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；a.色谱条件用反相C18色谱柱分离，甲醇-0.醋酸铵水为流动相，柱温20-30°C， 流速为 0. 2mL/min0b.质谱条件大气压化学电离，负离子模式，干燥气流速2.5L/min，干燥气温度400°C， 碎裂电压150V，全扫描模式。c.分别精密吸取对照品和样品溶液5-15μ L，注入液相色谱-质谱联用仪，确证。
4.根据权利要求3的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法， 其特征在于该方法包括下列步骤(1)用高效液相色谱-紫外检测法法测定中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；a.色谱条件用C18反相色谱柱分离，以水-乙腈-甲醇(90 5 5，V/V/V)为流动相，流速0. 8mL/min,柱温25°C，紫外检测器检测，检测波长218nm。b.溶液配制对照品溶液的配制分别精密称取对照品适量，加乙腈制成质量浓度为100μ g/mL的混合标准储备溶液；c.样品溶液的制备样品提取取药材粉末25g(精确到0. lg)，置250mL具塞锥形瓶中，加乙腈-水 (80 20，V/V)混合溶剂IOOmL,用高速均质器提取aiiin，静置过滤。样品净化吸取上述滤液4mL到净化柱顶端，向下推活塞，使溶液完全过柱，收集纯化液到梨形瓶中，取出活塞，加2X4mL乙腈/水(90 20，V/V)到柱子顶端。将所有溶液彻底过柱，收集到梨形瓶中，在60°C减压蒸干。残渣加ImL水-乙腈-甲醇(90 5 5，V/ V/V)混合溶剂溶解，0. 45 μ m的一次性针头过滤器过滤。d.测定法分别精密吸取对照品和样品溶液50μ L，注入液相色谱仪，测定。(2)用液相色谱-质谱联用检测法确证中药中的雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素；a.色谱条件用反相C18色谱柱分离，甲醇-0.1%醋酸铵水QO 80，V/V)为流动相， 柱温25 °C，流速为0. 2mL/min。b.质谱条件大气压化学电离，负离子模式，干燥气流速2.5L/min，干燥气温度400°C， 碎裂电压150V，全扫描模式，扫描范围200-400m/z。c.分别精密吸取对照品和样品溶液10μ L，注入液相色谱-质谱联用仪，确证。
5.根据权利要求2-4的任一种所述的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法，其特征在于该方法的样品提取过程为采用乙腈水高速勻质提取。
6.根据权利要求5的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法， 其特征在于该方法的样品提取过程为采用乙腈水(80 10，V/V)高速勻质提取。
7.根据权利要求2-4的任一种所述的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法，其特征在于该方法的液相分析条件为以水-乙腈-甲醇(90 5 5， V/V/V)为流动相，流速0. 8mL/min,柱温25°C，紫外检测器检测，检测波长218nm。
8.根据权利要求2-4的任一种所述的中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的检测方法，其特征在于该方法的液相色谱-质谱联用检测法确证以甲醇-0. 醋酸铵水OO 80，V/V)为流动相，柱温25°C，流速为0.2mL/min。大气压化学电离，负离子模式，全扫描模式。
全文摘要
一种检测中药中雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的方法，包括样品的提取，纯化及检测，所述的样品采用乙腈-水(80∶20，V/V)高速匀质提取，过滤，滤液过DON专用净化柱进行纯化，乙腈-水(80∶20，V/V)清洗柱子两次，合并过柱液，减压浓缩至干，加流动相溶解残渣，过滤后制成样品溶液。所述样品测定方法包括高效液相色谱-紫外检测法测定，检测波长218nm，用C18色谱柱分离，水-乙腈-甲醇(90∶5∶5，V/V/V)为流动相，进样量50μL。液-质联用确证，用C18柱分离，大气压化学电离方式电离，负离子监测模式，全扫描，扫描范围200-400m/z，进样量10μL。
文档编号G01N30/02GK102297902SQ201010209190
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者岳延涛, 张晓飞, 杨美华 申请人:中国医学科学院药用植物研究所