专利名称：测定烟草中芥子酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及烟草的种植与栽培，具体来说，涉及测定烟草中芥子酸含量的方法。
背景技术：
芥子酸，又称白芥酸，即3，5- ニ甲氧基-4-羟基肉桂酸(A-Hydroxy-
3,b-dimethoxycinnamic acid ),淡黄色针状结晶，熔点203°C _205°C,天然存在于十字花科芸苔属植物白芥[Brassi ca alba(L. )Boiss]及黄芥子[B. juncea(L. ) coss.]的种子中，是烟草中苯丙烷代谢途径的中间产物，也是木质素合成途径代谢产物，它与对逆境的抗性以及烟草的特色形成等生理活动有着密切的关系，因此，測定烟草中的芥子酸含量对于判断烟叶的质量和风味有着重要的意义。经过检索，中国专利数据库中未发现关于烟草中芥子酸測定方法的专利，而现有的技术文献也没有相关的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供测定烟草中芥子酸含量的方法，以解决鉴定烟草品质的问题。本发明提供的测定烟草中芥子酸含量的方法包括以下步骤
第一歩制备芥子酸标准品
准确称取芥子酸标准品IOmg,用こ腈定容至IOmL,然后吸I mL用こ腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用；
第二步制备供试样品溶液
(O制备鲜烟叶样品液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉备用。(2)制备烤后烟叶样品烤后烟叶粉碎过40目筛备用。(3)提取芥子酸取烟叶粉末O. 6g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入6mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mLこ醚萃取3次，合并有机相并加入适量无水Na2SO4过夜,再有旋转蒸发仪蒸干，最后用流动相定容后过O. 22 μ m的滤膜后进样。第三步測定芥子酸含量
分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出芥子酸含量。上述芥子酸标准品购自Sigma公司，纯度彡99% ;上述こ臆、こ酸为天地公司生产的色谱纯试剂。上述检测烟叶色谱的色谱条件是色谱柱用Waters C18色谱柱(4. 6mmX 150mm, 5 μ m);流动相为A :水，B :こ腈，C 10%的こ酸，梯度洗脱，柱温35°C，流速
I.OmT,. mirf1，检测波长310nm,进样量10 μし
上述各步骤所用的仪器设备是Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，Waters2996 ニ极阵列管检测器(DAD)检测，Empower色谱工作站,万分之ー电子天平、旋转蒸发仪、恒温摇床、冷冻干燥仪和真空泵等。本发明的测定烟叶中芥子酸含量的方法具有測定快速、灵敏度高和重复性好等诸多优点，可用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中芥子酸含量的測定。


图I为标准品与烟叶样品HPLC 图2为标准品标准曲线 图3为芥子酸含量与峰面积的关系图。
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明进ー步说明，但不作为对本发明的限制。实施例I测定方法实施例
首先进行标准品溶液的制备准确称取芥子酸标准品10mg，用こ腈定容至10mL，然后吸I mL用こ腈定容至IOmL制成标准品溶液,备用；
(O制备鲜烟叶样品液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉备用。(2)制备烤后烟叶样品烤后烟叶粉碎过40目筛备用。(3)提取芥子酸取烟叶粉末O. 6g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入6mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mLこ醚萃取3次，合并有机相并加入适量无水Na2SO4过夜,再有旋转蒸发仪蒸干，最后用流动相定容后过O. 22 μ m的滤膜后进样。最后进行芥子酸含量的測定分别取标准品溶液配成浓度分别为O. 5、1、2、3、5、10、20、30、50 μ m/mL的溶液取2 μ L注入超高效液相色谱仪，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出芥子酸含量；
其中，所述色谱条件为色谱柱Waters C18色谱柱(4. 6mmX 150mm, 5 μ m);流动相A(含
2.5%こ酸的水)-B (こ腈)，柱温350C，流速I. OmL. min—1，检测波长310nm,进样量10 μし梯度洗脱(表I)，
表I梯度洗脱条件
时间 P [B IC 初始 75% 5% 20%
40min 50% 15% 20%
45min ]75%]5% J20%
实施例2线性关系考察
分别取上述标准品溶液O. 5、I、2、3、5、10、20、30、50 μ L，按实施例I中色谱条件测定，记录色谱图及峰面积。以各标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标计算，得芥子酸的回归方程为 y=5. 13 X IO3 x-6. 42 X IO2，R2=O. 9993，线性范围为 I. 0215 51. 075μ g/mL。精密度试验精密吸取供试样品溶液按上述色谱条件连续进样10次，进样量10μ L，记录色谱图，测得芥子酸峰面积的RSD为O. 47%，结果表明仪器精密度良好。重复性试验取同一批样品，按供试品制备方法平行6次样品，连续进样，进样量10 μ L，记录色谱图，计算芥子酸含量的的RSD为4. 16%，结果表明该实验重复性良好。稳定性试验取同一份供试样品溶液，在0，4，12，24h进样，在上述色谱条件下测定，芥子酸峰面积的RSD为I. 56%，结果表明样品在24h内稳定性良好。实施例3 检测波长的选择
在对供试样品溶液进行色谱条件摸索时，在19(T400nm进行全波长扫描，其中在233和324nm处有最大吸收，在320nm处分离度可以到达到指纹图谱要求的标准，因此选320nm为最大检测波长。实施例4流动相选择
本试验比较了こ腈-水、こ腈-水-5%こ酸水溶液和こ腈-水-10%こ酸水溶液3中不同的梯度洗脱溶剂系统，以こ臆-水-10%こ酸水溶液梯度洗脱溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，所以选用こ腈-水-10%こ酸水溶液梯度洗脱溶剂系统为本试验的流动相系 统。
权利要求
1.测定烟草中芥子酸含量的方法，其特征包括 第一步制备芥子酸标准品 准确称取芥子酸标准品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用； 第二步制备供试样品溶液 (O制备鲜烟叶样品液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉备用； (2)制备烤后烟叶样品烤后烟叶粉碎过40目筛备用； (3)提取芥子酸取烟叶粉末O.6g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入6mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙醚萃取3次，合并有机相并加入适量无水Na2SO4过夜，再有旋转蒸发仪蒸干，最后用流动相定容后过O. 22 μ m的滤膜后进样； 第三步测定芥子酸含量 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出芥子酸含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述芥子酸标准品的纯度>99%。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述检测烟叶色谱的色谱条件是色谱柱用 Waters C18 0DS2 色谱柱(4. 6mmX 150mm, 5 μ m);流动相为 A (水)-B (乙腈)-C (10% 乙酸)，梯度洗脱，柱温35°C，流速I. OmL. min—1，检测波长310nm，进样量10 μ L。
全文摘要
本发明公开了测定烟草中芥子酸含量的方法，包括第一步，制备芥子酸标准品准确称取芥子酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸1mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液，备用；第二步，制备供试样品溶液包括制备鲜烟叶样品、制备烤后烟叶样品、提取芥子酸;第三步，测定芥子酸含量分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出芥子酸含量。本发明的方法具有测定快递、灵敏度高、准确性强、等诸多优点，适用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中芥子酸含量的测定。
文档编号G01N30/02GK102841149SQ20121025638
公开日2012年12月26日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者雷波, 丁福章, 赵会纳, 任竹, 张捷, 潘文杰, 罗宝昌 申请人:贵州省烟草科学研究所