专利名称：一种快速检测egcg的电化学传感器的电聚合制备方法
技术领域：
本发明涉及活性成分分析检测领域技术，具体是一种快速检测EGCG的电化学传感器及其电聚合制备方法。
背景技术：
没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)主要存在与茶属植物中，以绿茶中含量最高，是绿茶茶多酚的主要成分，也是绿茶儿茶素的主成分，占绿茶中儿茶素总量的50 %左右。EGCG具有广泛的生物活性，如清除自由基、抗氧化、抗癌、延迟衰老、预防心血管疾病、抗突变、降脂减肥和防辐射、增强口腔健康等多种保健和药理作用，是茶中的主要活性成分。茶的品质和价格在一定程度上由EGCG的含量决定，因此，建立一种快速便捷的检测茶及其制品中EGCG含量的方法具重要的现实和经济意义。
目前，茶叶成分分析多采用高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)法。2010年，杨志勇等利用毛细管电泳-安培检测法同时测定乌龙茶汤中生理活性成分糖、氨基酸和EGCG的含量；2010年，王琳等用HPLC-DAD同时检测了茶叶中10种儿茶素单体、没食子酸、可可碱、咖啡碱和茶碱等有效生化成分的含量。上述两种方法均有准确、高效的特点。但是这两种检测方法都需要对分析样品进行复杂的前处理，耗费时间长，不适于EGCG成分的现场分析检测。因此，发展建立一种实时检测EGCG含量的方法是十分必要的。分子印迹技术具有优越的预定性、识别性以及实用性，同时因其制备的分子印迹聚合物具有亲和力和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点，使得分子印迹技术在仿生传感器领域形成广泛的应用。但目前用电聚合法制备EGCG分子印迹膜传感器及其应用研究尚未见报道。本发明以邻苯二胺为功能单体，以EGCG为模板分子，基于CHI 660D电化学工作站，用电聚合法，构建了对EGCG具有专一选择特性的分子印迹电化学传感器，并以K3[Fe (CN) ]6为印迹电极和测试液间的探针，实现了对茶汤样品中EGCG含量的快速检测。

发明内容
本发明针对现有EGCG分析检测技术的不足，通过表面分子印迹技术、膜技术与电化学传感器的交叉研究，基于聚邻苯二胺膜修饰电极，采用电化学聚合法制备出EGCG分子印迹传感器。该电化学传感器可以实现快速，实时，现场和在线检测EGCG，具有成本低、灵敏度高、分析速度快、重复性高等优点。本发明涉及一种快速检测EGCG的电化学传感器的电聚合制备方法，按照下述步骤进行
(I)玻碳电极的预处理玻碳电极依次用粒径为O. 3 Mm和O. 05 Mm的氧化铝抛光成镜面，用蒸馏水冲洗掉表面附着的氧化铝粉末后，依次置于超纯水、无水乙醇中超声洗涤3-5min，循环3-6次，洗去电极表面的残留物之后；对电极进行电化学活化，即将电极置于含5mmol/L K3 [Fe (CN)6]和O. 2 mol/L KCl的磷酸缓冲液，(预先充氮气5-10 min以脱除溶液中的氧气)中，于0-0. 8 V电压范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安响应，如得到的循环伏安图具有标准可逆的氧化还原峰(峰电流比约为1:1，峰电流差值小于90 mV),则预处理成功。(2 )电聚合印迹膜修饰电极以玻碳电极为工作电极,邻苯二胺(ο -PD )为功能单体，氯化钾为支持电解质；将三电极体系(玻碳电极为工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极)置于含5-10 mmol/L邻苯二胺、O. 1-0.4 mmol/LEGCG和O. 2 mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 4. 5-5. 5)中，基于CHI 660D电化学工作站，循环伏安扫描聚合速度为25-75 11^/8、电位范围为0-0.8 V时，循环扫描聚合循环10-25圈。当电极表面与邻苯二胺接触，发生氧化还原反应，故有电流响应；当邻苯二胺的氨基与EGCG分子上的酚羟基发生作用，阻碍了邻苯二胺与电极的接触，使电极表面产生的峰电流响应越来越小，直到接近于 O。即得到嵌有EGCG的不导电聚合膜电极。将嵌有EGCG的不导电聚合膜电极作为工作电极、Pt电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极体系分别置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和O. 2 mol/L KCl的测试液(pH 4. 5-5. 5)中，基于CHI 660D电化学工作站，使用循环伏安法(CV)对印迹电极和非印迹电极进行表征。其初始电压范围在-0.2-0. 8V内，扫描速率为100 mV/s，静息时间为2 s,灵敏度为1X10_5 A/V。聚合后的印迹玻碳电极和非印迹玻碳电极均无氧化还原峰，说明聚合后的玻碳电极表面覆盖着紧密的聚合膜，此聚合膜阻止了 K3[Fe(CN)6]探针分子进入其表面发生氧化还原反应，故没有任何氧化还原峰的存在。而单纯的玻碳电极具有明显的一对氧化还原峰。(3)模板分子洗脱将步骤(2)中所得嵌有EGCG的不导电聚合膜电极置于甲醇/乙酸溶液(7:1-10:1，V: V)中,60-200 r/min磁力搅拌下洗脱5_15 min,萃取出模板分子EGCG后，在聚邻苯二胺膜上形成具有特殊识别位点的空穴，即得到EGCG分子印迹膜修饰电极，并用氮气吹干，备用。EGCG的电化学传感器是以EGCG分子印迹膜修饰电极探针为工作电极、Pt电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极体系分别置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0. 2mol/L KCl的测试液(pH 4. 5-5. 5)中，基于CHI 660D电化学工作站，用示差脉冲伏安法(DPV)扫描，K3Fe(CN)6*子可以通过孔穴扩散至传感器表面，并发生电化学反应产生电流响应值。如果测试液中含有EGCG分子，EGCG会特异地与孔穴位点结合，阻止了 K3Fe (CN)6分子进入空穴，导致峰电流响应值变小，所以可通过峰电流响应值的变化反映EGCG分子的浓度。每次检测结束后将分子印迹电极在甲醇/乙酸(7:1-10:1，V:V)溶液中洗脱10-13min，即可进行下一次检测。
本发明的有益效果
(1)本发明将分子印迹聚邻苯二胺膜修饰到玻碳电极表面的方法操作简单，用电化学方法直接将不导电的分子印迹膜修饰到电极表面，减少了其他物质对电化学信号的干扰；
(2)本发明所述分子印迹膜修饰电极由于其表面具有特异性识别EGCG的空穴，大大提高了传感器的检测选择性，有效的避免模板分子的结构类似物对检测结果的影响；
(3)本发明所述分子印迹膜修饰电极表面的分子印迹膜对模板分子EGCG具有预富集作用，有效提高了分析方法的灵敏度，检测范围为5·0Χ10_7-1·0Χ10_4 mol/L，最低检测限为 I. 6 X 10 7 mol/L ；
(4)本发明所述分子印迹膜修饰电极对EGCG响应迅速，检测速度快，完成一个样品的测定只需要10-16 min，可在短时间内完成大量样品的检测；
(5)本发明所述的分子印迹膜修饰电极还具有制备简单、成本低、重复性好等优点；
(6)本发明所述分子印迹膜修饰电极做为感应元件的电化学传感器可用于实时监测茶及其制品的加工过程中EGCG含量的变化情况，并为预测茶及其制品的质量提供参考。


图I EGCG分子印迹膜修饰电极制作图解；
图2 EGCG电化学传感器对不同浓度EGCG样品的PDV响应，(A) DPV响应曲线；(B)标准曲线。
具体实施例方式实施例I
玻碳电极依次用粒径O. 3 Mffl和O. 05 Mffl氧化铝抛光成镜面，用蒸馏水冲洗掉表面附着的氧化铝粉末后，依次置于超纯水、无水乙醇中超声洗涤3 min，循环3次，洗去电极表面的残留物之后，对电极进行电化学活化，即将电极置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和O. 2 mol/LKCl的磷酸缓冲液(预先充氮气8 min去除氧气)中，于0-0. 8 V电压范围内进行循环伏安扫描，直
到获得稳定的循环伏安响应。以玻碳电极为工作电极，邻苯二胺(o-PD)为功能单体，氯化钾为支持电解质。将三电极体系置于含5 mmol/L邻苯二胺，O. I mmol/L EGCG和0.2mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 5. 2)中，基于CHI 660D电化学工作站，在扫描速度为50mV/s、电位范围为0-0. 8 V时，循环扫描电聚合15圈，即得到EGCG为模板的不导电聚合膜电极。将所得电
极置于40 mL甲醇/乙酸(9:1，V: V)中磁力搅拌(120 r/min)洗脱10 min,萃取出EGCG分子后，氮气吹干，即得到EGCG分子印迹膜修饰电极，具体制备过程如图1，其中“ ”代表印迹分子EGCG，“I”代表K3 [Fe (CN) 6]。实际样品检测称取千岛玉茶0.2003 g置于烧杯中，用80°C超纯水100 mL浸泡3h，离心过滤之后用超纯水稀释10倍得茶汤；依次向茶汤中加入浓终度分别为5 mmol/L和
0.2 mol/L的K3 [Fe (CN)6]和KC1。以分子印迹膜修饰电极作为工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。基于CHI 660D电化学工作站，用示差脉冲伏安法(DPV)扫描样品，响应时间为11 min，其峰电流值为7.833 μΑ，根据图2A不同浓度EGCG的PDV响应曲线和图2Β标准曲线计算样品中EGCG的含量为4. 178Χ 1(T2 mmol/L。为了进一步验证方法的准确度，在以上样品中加入EGCG标准溶液，进行加标回收测定，检测方法同上。其加标量为0.01 mmol/L，加标回收率98. 6%。实施例2
玻碳电极依次用粒径0.3 Mffl和0.05 Mffl氧化铝抛光成镜面，用蒸馏水冲洗掉表面附着的氧化铝粉末后，依次置于超纯水、无水乙醇中超声洗涤5 min，循环6次，洗去电极表面的残留物。之后对电极进行电化学活化，即将电极置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0. 2 mol/L KCl的磷酸缓冲液(预先充氮气10 min去除氧气)中，于0-0. 8 V电压范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安响应。以玻碳电极为工作电极，邻苯二胺(o-PD)为功能单体，氯化钾为支持电解质。将三电极体系置于含10 mmol/L邻苯二胺，O. 3 mmol/LEGCG和O. 2 mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 5. 5)中，基于CHI 660D电化学工作站，在扫描速度为50 11^/8、电位范围为0-0.8 V时，循环扫描聚合20圈，即得到EGCG为模板的不导电聚合膜电极。将所得电极置于30 mL甲醇/乙酸(8:1，V:V)中磁力搅拌(100 r/min)洗脱15 min，萃取出EGCG分子后，氮气吹干，即得到EGCG分子印迹膜修饰电极，具体制备过程如图I，其中“ + ”代表印迹分子EGCG，“_，，代表K3[Fe (CN) 6]。实际样品检测称取龙井茶O. 2010 g置于烧杯中，用80°C超纯水100 mL浸泡3 h，离心过滤之后用超纯水稀释10倍得茶汤；依次向茶汤中加入浓终度分别为5 mmol/L和O. 2mol/L的K3[Fe (CN)6]和KC1。以分子印迹膜修饰电极作为工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。基于CHI 660D电化学工作站，用示差脉冲伏安法(DPV)扫描样品，响应时间为11 min，其峰电流值为7. 978 μΑ，根据图2Α不同浓度EGCG的PDV响应曲线和图2Β标准曲线计算样品中EGCG的含量为4. 633 X IO-2 mmol/L。 为了进一步验证方法的准确度，在以上样品中加入EGCG标准溶液，进行加标回收测定，检测方法同上。其加标量为0. 01 mmol/L，加标回收率102. 2%。实施例3
玻碳电极依次用0. 3 Mm和0. 05 Mm氧化招悬池液麂皮上抛光成镜面,用蒸懼水冲洗掉表面附着的氧化铝粉末后，依次置于超纯水、无水乙醇中超声洗涤5 min，循环6次，洗去电极表面的残留物。之后对电极进行电化学活化，即将电极置于含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和
0.2 mol/L KCl的磷酸缓冲液(预先充氮气10 min去除氧气)中，于0-0. 8 V电压范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安响应。以玻碳电极为工作电极，邻苯二胺(o-PD)为功能单体，氯化钾为支持电解质。将三电极体系置于含10 mmol/L邻苯二胺，0.3 mmol/LEGCG和0. 2 mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 5. 5)中，基于CHI 660D电化学工作站，在扫描速度为50 11^/8、电位范围为0-0.8 V时，循环扫描聚合20圈，即得到EGCG为模板的不导电聚合膜电极。将所得电极置于30 mL甲醇/乙酸(8:1，v:v)中磁力搅拌(100 r/min)洗脱15 min，萃取出EGCG分子后，氮气吹干，即得到EGCG分子印迹膜修饰电极，具体制备过程如图I，其中“ ”代表印迹分子EGCG，“_，，代表K3[Fe (CN) 6]。实际样品检测称取白茶0. 2005 g置于烧杯中，用80°C超纯水100 mL浸泡3 h，离心过滤之后用超纯水稀释10倍得茶汤；依次向茶汤中加入浓终度分别为5 mmol/L和0. 2mol/L的K3[Fe (CN)6]和KC1。以分子印迹膜修饰电极作为工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。基于CHI 660D电化学工作站，用示差脉冲伏安法(DPV)扫描样品，响应时间为11 min，其峰电流值为7. 481 μΑ，根据图2Α不同浓度EGCG的TOV响应曲线和2Β图标准曲线计算样品中EGCG的含量为3. 065 X IO-2 mmol/L。为了进一步验证方法的准确度，在以上样品中加入EGCG标准溶液，进行加标回收测定，检测方法同上。其加标量为0.01 mmol/L，加标回收率99. 3%。
权利要求
1.一种快速检测EGCG的电化学传感器的电聚合制备方法，其特征在于按照下述步骤进行 (1)玻碳电极的预处理玻碳电极依次用粒径为0.3 Mm和0. 05 Mm的氧化铝抛光成镜面，用蒸馏水冲洗掉表面附着的氧化铝粉末后，依次置于超纯水、无水乙醇中超声洗涤3-5min，循环3-6次，洗去电极表面的残留物之后；对电极进行电化学活化，即将电极置于预先充氮气5-10 min以脱除溶液中的氧气的含5 mmol/L K3 [Fe (CN) 6]和0. 2 mol/L KCl的磷酸缓冲液中，于0-0. 8 V电压范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安响应，如得到的循环伏安图具有标准可逆的氧化还原峰即峰电流比约为1:1，峰电流差值小于90 mV,则预处理成功； (2)电聚合印迹膜修饰电极以玻碳电极为工作电极，邻苯二胺(o-PD)为功能单体，氯化钾为支持电解质；将玻碳电极为工作电极，Pt电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极的三电极体系置于pH 4. 5-5. 5的含5-10 mmol/L邻苯二胺、0. 1-0. 4 mmol/LEGCG和0. 2mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液中，基于CHI 660D电化学工作站，循环伏安扫描聚合速度为25-75 mV/s、电位范围为0-0. 8 V时，循环扫描聚合循环10-25圈；当电极表面与邻苯二胺接触，发生氧化还原反应，故有电流响应；当邻苯二胺的氨基与EGCG分子上的酚羟基发生作用，阻碍了邻苯二胺与电极的接触，使电极表面产生的峰电流响应越来越小，直到接近于0;即得到嵌有EGCG的不导电聚合膜电极； 将嵌有EGCG的不导电聚合膜电极作为工作电极、Pt电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，将三电极体系分别置于pH 4. 5-5. 5的含5 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0. 2 mol/L KCl的测试液中，基于CHI 660D电化学工作站，使用循环伏安法对印迹电极和非印迹电极进行表征； 其初始电压范围在-0.2-0. 8V内，扫描速率为100 mV/s，静息时间为2 S，灵敏度为1X I (T5 A/V ； (3)模板分子洗脱将步骤(2)中所得嵌有EGCG的不导电聚合膜电极置于体积比为7:1-10:1的甲醇/乙酸溶液中，60-200 r/min磁力搅拌下洗脱5-15 min,萃取出模板分子EGCG后，在聚邻苯二胺膜上形成具有特殊识别位点的空穴，即得到EGCG分子印迹膜修饰电极。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测EGCG的电化学传感器的电聚合制备方法，涉及农产品活性成分分析检测领域技术。该方法主要包括玻碳电极的预处理、玻碳电极表面的电聚合成膜、模板分子的洗脱，即得到EGCG分子印迹膜修饰电极；结合电化学工作站该传感器可用于含有EGCG真实样品的快速检测。本发明具有如下优点选择性高，操作效率高，传感器的稳定性好，可以循环使用，成本低廉、适合快速、实时、现场检测。本发明适用于茶及其制品中主要活性成分EGCG含量的快速检测以及茶或茶制品的品质评价。
文档编号G01N27/30GK102809592SQ20121024154
公开日2012年12月5日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者段玉清, 罗孝平, 张海晖, 秦宇, 蔡健荣, 马海乐 申请人:江苏大学