专利名称：一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学特别是糖生物学领域，涉及检测CA125(cancer antigenl25,癌抗原125)表面Tn抗原的试剂盒。具体涉及一种检测CA125表面Tn抗原的的抗体-凝集素ELISA试剂盒。
背景技术：
现有技术公开了癌抗原125是一种高度糖基化的粘蛋白，其中糖链部分约占整个分子质量的20%-70%。有研究表明，约80%的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高，其水平的显示能够很好的反应机体肿瘤负荷，因此，癌抗原1 25 (cancer antigen 125, CA125)成为目前妇科最常用的血清肿瘤标志物以及临床卵巢癌治疗后的主要监测随访指标。据研究显示，除了卵巢癌，血清CA125水平在许多其他良、恶性疾病中也发现有异常升高，如血清CA125水平在1%左右的健康女性中有升高，在6%左右的子宫内膜异位症、盆腔炎、妊娠等妇产科良性疾病中有升高，在肝硬化、慢性活动性肝炎、急性心衰等内科疾病以及部分胰腺癌、肺癌、肝癌等其他系统癌症患者中也有升高。此外，无论良性或恶性腹水患者，其血清CA125水平都显示有异常升高。据临床诊断发现，目前妇科良性疾病出现了较高的发病率，如子宫内膜异位症在育龄妇女中发病率高达15%以上，同时其临床表现如盆腔包块、盆腔积液等与卵巢癌临床表现类似，因此，致使对其的诊疗方案的制定带来了困难，且给有关患者带来不必要的精神负担。大量的研究表明，恶性肿瘤常伴随着糖链合成、降解以及连接相关分子的异常改变，从而导致其合成的蛋白出现异常糖基化状态。生理状况下，所述CA125由苗勒氏管上皮，即输卵管内膜、子宫内膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宫颈内膜，腹膜、胸膜以及心包膜等间皮组织，支气管上皮、支气管粘膜下腺，以及角膜和结膜上皮合成分泌。在卵巢癌患者中，癌组织能表达高水平的CA125，并分泌入血，因此，卵巢癌患者血清中的CA125主要来源于癌组织，且具有特殊的糖基化状态。本领域研究者试图利用上述糖基化状态差异，区分良性或恶性疾病引起的CA125升高，从而进一步提高临床诊断的准确性，但迄今为止，尚未见有关用于CA125表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒的报道。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，尤其是一种用于CA125表面Tn抗原检测的抗体_凝集素ELISA试剂盒；本发明的试剂盒能通过包被在96孔板上的CA125抗体捕获血清中的CA125，继而利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量，可用于判断CA125升高患者是否患有恶性妇科肿瘤。具体而言，本发明的用于CA125表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒，其特征在于，其包被一种抗CA125抗体(克隆号[X325])，通过包被的CA125抗体捕获血清中的CA125，用糖链识别分子检测CA125表面Tn抗原含量。本发明的试剂盒的检测原理采用双抗体夹心法ELISA ；本发明的试剂盒的检测对象为妇科病患者血清；本发明的试剂盒适用人群为血清CA125水平升高的妇科病患者血清，尤其是血清CA125水平大于35U/ml的患者人群；本发明试剂盒的糖链识别分子为特异性识别Tn抗原的凝集素VVA。本发明中，所述的CA125抗体是一种糖蛋白，由于其Fe段的糖链有可能与凝集素发生结合，从而干扰抗原糖链结构的检测，因此，本发明的试剂盒的制备中引入了抗体糖链氧化衍生化处理步骤，其中使用(4-[4-N-马来酰亚胺]盐酸丁酸肼)(4- [4-N-maleimidophenyl] butyric acid hydrazide hydrochlorid, MPBH)作为交连剂，利用其酰肼末端与高碘酸钠氧化糖环产生的醛基结合，利用马来酰亚胺末端与半胱氨酸-甘 氨酸二肽上的巯基结合，从而在结构上破坏Fe段糖链，同时利用空间位阻效应防止凝集素与其结合，最终降低抗体糖链所产生的背景信号。本发明中，所述试剂盒的CA125抗体包被于96孔板后经氧化衍生化处理以清除抗体糖链引起的背景信号；其中，所述的氧化衍生化处理中，氧化液为含20mM NaIO4的O. IM醋酸钠溶液，PH5. 5 ;衍生化试剂为溶于PBS的ImMMPBH ;封闭液为溶于O. IPBST的O. ImMCys-Gly0本发明进一步提供了利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量，以进行判断CA125升高是否为恶性妇科肿瘤的方法。本发明的用于CAl25表面Tn抗原检测的抗体-凝集素ELISA试剂盒，对收集的血清CA125水平升高的90余例妇科病患者的血清进行体外检测，其包括步骤I)收集血清样本，按常规血清分离方法处理；2)抗体糖链衍生化；3)凝集素检测CA125表面Tn抗原；4)计算CA125表面Tn抗原含量X-Log10 (Asample/Ablank)其中，X为CA125表面Tn抗原相对含量，Asample为样品孔的吸光度，Ablank为空白对照孔德吸光度；根据特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量，判断CA125升高患者是否患有恶性妇科肿瘤。结果显示，以O. 2为界值，CA125表面Tn抗原诊断恶性CA125升高的灵敏度和特异度分别为82. 5%和74. 5%。本发明的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒可用于诊断恶性妇科肿瘤。与现有技术比较，本发明的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，具有检测省时，所需血清样本易于取得，用于区分良、恶性CA125升高患者准确度高的优点。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。


图I显示了 CA125表面Tn抗原诊断、CA125升高的灵敏度和特异度。
具体实施例方式本发明将通过具体的实施例进行示例性的说明，其中，如有未尽之处，可参见《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，北京)等实验手册以及市售的试剂和仪器的使用说明。实施例II)收集血清样本收集血清CA125水平升高的妇科病例91例，包括40例恶性妇科肿瘤患者，51例妇 科良性疾病患者；按常规血清分离方法，首先抽取5ml静脉血，促凝管中凝固后2000g离心10分钟，吸出上层血清，-80°C冻存，使用前4°C解冻。2)抗体糖链衍生化(I)包被CA125 抗体(克隆号[X325])以包被液(ρΗ9· 6，O. 05MNa2C03_NaHC03 溶液)稀释至I μ g/ml,加入酶标板,100 μ I/孔，4°C,过夜；(2)洗板0. lPBST,200y I/ 孔，洗板三次；(3)封闭封闭液(含 1%BSA 的 1*PBS)，200 μ I/ 孔，37。。，Ih ；(4)氧化:氧化液(含 20mM NaIO4 的 O. IM 醋酸钠溶液，pH5. 5)，200 μ I/孔，4°C，避光，2. 5h ；(5)洗板0. lPBST，200y I/孔，洗板三次；(6) MPBH :MPBH 工作液(ImM 溶于 PBS)，200 μ I/孔，室温，2h ；(7)洗板0. lPBST,200y I/ 孔，洗板三次；(8) Cys-Gly 0. ImM Cys-Gly 溶于 O. 1PBST，200 μ I/孔，4°C，过夜。3、凝集素检测CA125表面Tn抗原(I)洗板0. lPBST，200y I/孔，洗板三次；(2)抗原血清100 μ I/孔，370C，90分钟，以PBS作为阴性对照；(3)洗板0. lPBST,200y I/ 孔，洗板三次；(4) Biotin-VVA :以 Lectin 稀释液(1%BSA 溶于 O. 1PBST，含 O. ImM Ca2+)稀释 VVA至 10 μ g/ml, 100 μ I/ 孔,室温，Ih ；(5)洗板0. lPBST,200y I/ 孔，洗板六次；(6) Streptavidin-HRP 100μ I/ 孔，室温，30 分钟；(7)洗板0. lPBST，200y I/孔，洗板六次；(8)显色=TMB显色液，100 μ I/孔，室温，避光，10分钟；(9)终止终止液，100 μ I/孔，振荡混匀；(10)检测酶标仪检测各孔A4tl5值。4、计算CA125表面Tn抗原含量X-Log10 (Asample/Ablank)其中，X为CA125表面Tn抗原相对含量，Asample为样品孔的吸光度，Ablank为空白对照孔德吸光度；以O. 2为界值，CA125表面Tn抗原诊断恶性CA125升高的灵敏度和特异度分别为82. 5%和74. 5% (如图I所示)。对于CA125水平处于各个区间的患者，分别计算CA125表面Tn抗原含量取截断值为O. 2时，其用于鉴别良恶性疾病的准确率，结果如表I所示，在各区间内CA125表面Tn抗原的诊断准确率均在70%以上，当CA125水平大于200U/ml时，其诊断准确率达到83. 3%。表1CA125表面Tn抗原用于鉴别良恶性CA125升高的准确性
权利要求
1.一种检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，其包被一种抗CA125抗体，通过包被的CA125抗体捕获血清中的CA125，用糖链识别分子检测CA125表面Tn抗原含量； 所述抗CA125抗体的克隆号为[X325]。
2.按权利要求I所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，其采用双抗体夹心法ELISA。
3.按权利要求I所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，检测对象为妇科病患者血清。
4.按权利要求I或3所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述的血清是CA125水平大于35U/ml的妇科病患者血清。
5.按权利要求I所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述的糖链识别分子是特异性识别Tn抗原的凝集素VVA。
6.制备权利要求I的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒的方法，其特征在于，其包括抗体糖链氧化衍生化处理步骤其中，采用(4-[4-N-马来酰亚胺]盐酸丁酸肼)作为交连剂，用其酰肼末端与高碘酸钠氧化糖环产生的醛基结合，用马来酰亚胺末端与半胱氨酸-甘氨酸二肽上的巯基结合，以在结构上破坏Fe段糖链，和用空间位阻效应防止凝集素与其结合，最终降低抗体糖链所产生的背景信号。
7.按权利要求6的方法，其特征在于，所述氧化衍生化处理中，氧化液为含20mMNaIO4的O. IM醋酸钠溶液，pH5. 5 ;衍生化试剂为溶于PBS的ImMMPBH ;封闭液为溶于O. IPBST的O.ImM Cys-Gly。
8.权利要求I所述的检测CA125表面Tn抗原的试剂盒在诊断恶性妇科肿瘤中的用途。
9.一种利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量，的方法，其特征在于，其包括步骤 O收集妇科病患者血清样本，按常规血清分离方法处理； 2)抗体糖链衍生化； 3)凝集素检测血清样本中CA125表面Tn抗原； 4)计算CA125表面Tn抗原含量 X=Log10 (A sample/Ablank) 其中，X为CA125表面Tn抗原相对含量，Asample为样品孔的吸光度，Ablank为空白对照孔德吸光度。
10.权利要求9的方法在制备判断恶性妇科肿瘤试剂盒中的用途，其中，根据特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量判断血清CA125升高者是否为患恶性妇科肿瘤者。
全文摘要
本发明属分子生物学特别是糖生物学领域，涉及检测CA125表面Tn抗原的试剂盒。具体涉及一种检测CA125表面Tn抗原的的抗体-凝集素ELISA试剂盒。所述试剂盒通过包被在96孔板上的CA125抗体捕获血清中的CA125，继而利用特异性识别Tn抗原的凝集素VVA检测CA125表面Tn抗原含量，可用于判断CA125升高患者是否患有恶性妇科肿瘤。本发明所述的试剂盒检测省时，所需血清样本易于取得，用于区分良恶性CA125升高患者准确度高。
文档编号G01N33/574GK102901827SQ20121028310
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者徐丛剑, 王宜生, 尧良清, 刘晓艳, 李小平, 孙立新, 曹锐, 高迎春, 张蓉, 金志军, 滕银成, 陆佳琦, 程明军, 张晓燕 申请人:复旦大学附属妇产科医院