专利名称：中华鲟实时荧光pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及中华鲟(Acipenser Sinensis)的核酸检测试剂盒及其检测方法，属于 生物技术领域。
背景技术：
中华鲟(Acipenser Sinensis)是中国特有的古老珍稀鱼类和世界现存鱼类中 最原始的种类之一，距今有一亿四千万年的历史，被誉为“水中的大熊猫”、“活化石”，现为 国家一级保护动物，国际自然保护联盟(IUCN)红色名录濒危种，世界野生生物贸易公约 (CITES)附录 II ·鉴于国家对中华鲟捕捞行为的明令禁止，目前，在水产市场上已难见到正宗的中 华鲟，某些餐馆肆意出售所谓的“中华鲟”，相当部分是一些其他鲟类，这会造成对民众的动 物保护意识的严重误导，也是对消费者的恶意欺骗。为了保护中华鲟这一鱼类珍稀品种，防 止不法分子非法捕杀、携带和销售中华鲟，以及对销售假冒中华鲟行为的惩治，必须对中华 鲟有一种快速、准确的鉴定手段或方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速准确地进行中华鲟的检测的中华鲟实时荧光 PCR基因检测试剂盒及用其检测中华鲟的方法。本发明用于中华鲟实时荧光PCR基因检测的试剂盒包括如下试剂(I)PCRMIX反应液由5XFQ PCR buffer、浓度为10 μ M的DL基因引物混合物、浓 度为10 μ M的荧光探针、浓度为IOmM的dNTPS及ddH20 ；其中DL基因引物混合物含有上游 引物和下游引物，所述上游引物DL-F序列为5’ -GATCAAGGTATGTCGATGACA-3’ ；所述下游引物DL-R序列为5， -CAAGAACACAAGATTAATGAG-3，；所述荧光探针DL-P序列为5，-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3 ’，其5 ’端标记荧光报告基团，3，端标记荧光 淬灭基团；(2) Taq 酶；(3)阳性对照浓度为lX107COpieS/mL的中华鲟的DL基因扩增片段重组质粒。上述5XFQ PCR buffer、浓度为10 μ M的DL基因引物混合物、浓度为10 μ M的荧 光探针、浓度为IOmM的dNTPS及ddH20按体积比为10 1 0. 5 1 30. 5。本发明还提供检测中华鲟的方法，包括如下步骤(1)按常规方法提取样品的DNA ；(2)对提取的DNA进行扩增反应；反应体系中含有PCR MIX反应液24 μ L、Taq酶2 μ L，样品DNA提取液4 μ L，阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH20 ；反应程序为93°C反 应2min，93°C反应30s，58°C反应45s，45个循环；(3)结果分析如果Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为阳性，即样品鉴定 为中华鲟。本发明试剂盒由于引入了针对中华鲟的DL基因序列的特异引物和荧光探针，用 于中华鲟实时荧光PCR检测，使中华鲟检测的灵敏度和特异性得到很大程度的提高，具有 较好的重复性和稳定性，实现了快速、高效、准确地检测中华鲟的目的。
具体实施例方式实施例1本发明试剂盒的组成基础试剂盒的构成及配制(或制备)如下(I)PCR MIX 反应液包含5XFQ PCR buffer、浓度为10 μ M的中华鲟DL基因引物混合物、浓度为10 μ M 的荧光探针、浓度为IOmM的dNTPS和ddH20，依次按体积比10 1 0. 5 1 30. 5混 合；上述5XFQ PCR buffer 如下配制按 250mM 的 Tris-HCl (ρΗ8· 0)、35mM 的 MgCl2、 250mM的KCl以及体积浓度为10%的DMSO混合；上述中华鲟DL基因引物混合物包含上游引物和下游引物，该上、下游引物及荧光 探针序列如下上游引物DL-F 5，-GATCAAGGTATGTCGATGACA-3，；下游引物DL-R 5，-CAAGAACACAAGATTAATGAG-3，；荧光探针DL-P :5，-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3，，5，端标记荧光报告基团， 3’端标记荧光淬灭基团。dNTPS和ddH20按照常规方法制备。(2) Taq酶购自大连宝生物有限公司。(3)阳性对照以中华鲟的DL基因为模板，以DL-F与DL-R为引物进行扩增反应；将扩增反应 获得的特异性扩增片段连接到T克隆载体上，构成的重组质粒，经过浓度测定，调整浓度为 107copies/mL。实施例2本发明试剂盒检测中华鲟的方法及其验证反应体系设置为30 μ L，包括PCR ΜΙΧ24 μ L、Taq酶2 μ L以及样品核酸提取液或 者阳性标准品或者阴性标准品分别为4 μ L。(1)依照动物组织的核酸提取方法或商品化的核酸提取试剂盒提取不同样品的核酸。(2)按照如下反应体系进行配置PCR MIX反应液24 μ L、Taq酶2 μ L，样品核酸提 取液4μ L，阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH20。反应程序为93°C反应2min，93°C反应 30s，58°C反应45s，45个循环。(3)结果分析如果Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的样品为阳性，即样品 鉴定为中华鲟。
采用本试剂盒检测中华鲟，不同操作人员采用不同型号的荧光PCR仪器进行反 应，反应结果稳定，重复性较好。实施例3用本发明试剂盒检测中华鲟的灵敏度以中华鲟核酸为模板，以DL-F与DL-R为引物进行扩增反应。将扩增反应获得的 特异性扩增片段，连接到T克隆载体上，构成的重组质粒，经过浓度测定与调整，然后按10 倍进行倍比稀释，分别得到浓度为 IolclCopiesAlLuo9CopiesAlLuo8CopiesAlLuo7Copies/ mL、106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL,将各稀释液 作为阳性模板进行PCR扩增检测，结果显示当重组质粒模板总量大于1000个拷贝时扩增良 好。实验证明该实时荧光PCR方法的检测灵敏度为1000个重组质粒拷贝以上。实施例4用本发明试剂盒检测中华鲟的特异性将各对照物种(史氏鲟、达氏鲟、俄罗斯鲟、河虾、对虾、鲫鱼、螃蟹、黄鳝、带鱼、 昂刺鱼、鲈鱼、鱿鱼、猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、叉尾鮰鱼、河豚、甲鱼、支鱼、牛蛙、桂鱼、 鲳边鱼、黑鱼、黄鱼、鳊鱼、青鱼、海蟹、香螺、蛘仔、毛蛤、文蛤、斑节虾、小青龙虾、海肠、海瓜 子、大间蟹、虾爬、青蟹、江白虾、花蟹、梭子蟹、淡水小龙虾)，用海洋动物组织的核酸提取试 剂盒提取核酸，取4 μ 1核酸提取溶液，用于实时荧光PCR反应，进行特异性试验。结果表明， 只有中华鲟有典型的扩增曲线，而用于实验中的对照物种均没有任何扩增曲线。本发明的试剂盒经过多次的重复实验，证实具有较好的重复性和稳定性。
权利要求
中华鲟实时荧光PCR检测试剂盒，其特征是包含如下试剂(1)PCR MIX反应液含有5×FQ PCR buffer、浓度为10μM的DL基因引物混合物、浓度为10μM的荧光探针、浓度为10mM的dNTPS及ddH2O；其中DL基因引物混合物含有上游引物和下游引物，所述上游引物DL-F序列为5’-GATCAAGGTATGTCGATGACA-3’；所述下游引物DL-R序列为5’-CAAGAACACAAGATTAATGAG-3’；所述荧光探针DL-P序列为5’-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3’，其5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；(2)Taq酶；(3)阳性对照浓度为1×107copies/mL的中华鲟的DL基因扩增片段重组质粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所说的5XFQPCR buffer、浓度为10 μ M 的DL基因引物混合物、浓度为10 μ M的荧光探针、浓度为IOmM的dNTPS及ddH20的体积混 合比为 10 1 0. 5 1 30. 5。
3.一种用权利要求1的试剂盒检测中华鲟的方法，包括如下步骤(1)提取样品的核酸；(2)对提取的DNA进行扩增反应；反应体系中含有PCRMIX反应液24μ L、Taq酶2μ L， 样品DNA提取液4 μ L，阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH20 ；反应程序为93°C反应 2min，93°C反应 30s，58°C反应 45s，45 个循环；(3)结果分析Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的样品为阳性，即样品鉴定为中华鲟。
全文摘要
本发明涉及中华鲟实时荧光PCR检测试剂盒，包括含有5×FQ PCR buffer、浓度为10μM的DL基因引物混合物、浓度为10μM的荧光探针、浓度为10mM的dNTPS及ddH2O的PCRMIX反应液、Taq酶和阳性对照中华鲟DL基因扩增片段重组质粒。DL基因引物混合物含有上游引物和下游引物。用PCR MIX反应液24μL、Taq酶2μL，样品DNA提取液4μL，阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH2O，进行扩增反应；反应程序为93℃反应2min，93℃反应30s，58℃反应45s，45个循环；Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的鉴定为中华鲟，检测快速、高效、准确。
文档编号G01N21/64GK101886128SQ201010216438
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者吴斌, 张晓武, 张睿, 沈崇钰, 祝长青, 蒋原, 邵景东, 黄文胜 申请人:江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心