半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，包括基板和基板上由后至前依次黏贴的样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫，NC膜完全贴附在基板上，金标垫的前边缘和吸水垫的后边缘分别搭接贴附在所述NC膜的后边缘和前边缘上，所述样品垫的前边缘搭接贴附在所述金标垫的后边缘上，所述NC膜的中部喷涂有多条由睾酮单克隆抗体溶液形成的条带，所述条带平行间隔设置，所述条带的延伸方向平行于所述NC膜的前/后边缘的延伸方向，所述金标垫上灌注有金标睾酮-BAS溶液。本实用新型具有特异性强、灵敏度高、结构简单、操作简便、检测快速的特点，能有效测出血液中睾酮浓度的大致含量，适用于医院、竞技体育等作为半定量检测工具。
【专利说明】半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种半定量检测血睾酮浓度的装置，具体涉及一种免疫胶体金试纸条。
【背景技术】
[0002]睾酮是一种固醇类激素，是天然存在的雄性激素，男性正常值参考范围为260—1250ng/dL (10一25.5nmol/L),女性 4一 IOOng/dL (1.3一2.8nmol/L)。辜丽的生理作用是控制副性器官的发育，并调节性机能，促进肌纤维和骨骼的生长，加强磷酸肌酸合成，刺激促红细胞生成素分泌等。研究表明，睾酮能显著增加运动员肌肉蛋白质的合成和肌肉力量，提高肌肉对葡萄糖的吸收和肌糖原的储备等。
[0003]竞技体育中，在运动员训练期间，必须维持一定浓度的血睾酮值(男性参考范围为270—1000ng/dL,女性为10 — 100ng/dL)，才能保持训练计划的正常进行，而且要定期对运动员进行血清睾酮值测试并进行纵向比较。
[0004]在进行大强度、大运动量训练后，若没有得到有效的调整，会使运动员处于过度紧张和疲劳状态，内分泌体系下丘脑一垂体一性腺轴功能受到抑制，血清睾酮水平降低，进而导致体能下降，运动能力降低。所以，在训练过程和比赛期间，应定期测试血清睾酮值，当发现大强度负荷训练后安静时血清睾酮值低于训练前20%时，需要跟踪监测，并调整训练计划。
[0005]目前，睾酮的主要检测手段包括免疫学检测和电化学检测。
[0006]较为常用的免疫检测手段有放射免疫、酶联免疫及发光免疫等，但都需要采血、离心取血清、加样、免疫反应等过程，还要上机检测，并运用复杂计算方法。其中仪器较为昂贵，操作复杂，需要专门人员进行操作。
[0007]电化学检测方法包括直接电化学检测方法和电化学免疫传感器检测法,测试速度快，但是目前还存在一些问题，比如电化学免疫传感器检测法需要电子媒介，而电子媒介存在流失、响应速度较慢及生物毒性和生物相容性等问题，而且该方法对实验条件要求极为苛刻。
[0008]可见，现有的睾酮检测手段无法适应运动员训练过程中和比赛期间的频繁检测需要。

【发明内容】

[0009]为了克服现有技术的上述缺陷，本实用新型的目的在于提供一种半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，具有特异性强、灵敏度高、结构简单、操作简便、出结果快速的特点，能有效测出血液中睾酮浓度的大致含量，适用于医院、竞技体育等作为半定量检测工具。
[0010]本实用新型的技术方案是:
[0011]一种半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，设有基板，所述基板上由后至前依次黏贴有样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫。
[0012]所述NC膜完全贴附在所述基板上，所述金标垫的前边缘和所述吸水垫的后边缘可以分别搭接贴附在所述NC膜的后边缘和前边缘上，所述样品垫的前边缘可搭接贴附在所述金标垫的后边缘上。
[0013]所述基板可以为PVC板。
[0014]优选地，所述样品垫的前边缘的上表面与金标垫的前边缘的上表面平齐。
[0015]所述样品垫的上方可对应设有样品孔。
[0016]所述条带的条数可以为10条。
[0017]对于前述任意一种所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，所述NC膜的中部可以喷涂有多条由睾酮单克隆抗体溶液形成的条带，所述条带平行间隔设置，所述条带的延伸方向平行于所述NC膜的前/后边缘的延伸方向。
[0018]所述金标垫上可灌注有金标睾酮-BAS溶液。
[0019]所述睾酮单克隆抗体溶液的浓度优选为5.2ng/mL或0.52ng/mL。
[0020]所述金标睾酮-BAS溶液的浓度优选为4.2ng/mL或0.42ng/mL。
[0021]本实用新型的有益效果为:本实用新型利用待测样品中的睾酮和标记在胶体金表面的睾酮与精确定量呈横条状定于层析膜上的睾酮单克隆抗体发生竞争性结合的原理，实现了通过显示与层析膜上的条纹数量和显色情况，确定待测样品中睾酮的含量的目的，显色条数越多，说明样品中睾酮含量越高。本实用新型结构简单、操作简便、检测速度快，没有了电化学检测方法的苛刻的检测条件，也避开了已有免疫检测手段成本高、操作复杂的缺陷，使用起来具有相当的灵活性和一定的准确度，比已有检测方法更适于运动员训练过程中和比赛期间的血睾酮检测需要，且其精度也完全能够满足要求。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1是本实用新型的一个实施例的结构示意图；
[0023]图2是图1的俯视图。
【具体实施方式】
[0024]参见图1、2，本实用新型公开了一种半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，设有基板I (本实施例中采用PVC板)，所述基板上由后至前依次黏贴有样品垫2、金标垫3、NC膜4和吸水垫5。
[0025]所述NC膜(即硝酸纤维素膜,英文名称为nitrocellulose filter membrane,简称NC膜)，完全贴附在所述基板上，所述金标垫的前边缘和所述吸水垫的后边缘可分别搭接贴附在所述NC膜的后边缘和前边缘上，所述样品垫的前边缘可搭接贴附在所述金标垫的后边缘上。采用这种搭接贴附的结构一方面可以使二者结合牢靠，另一方面可以显著增大二者的接触面积，使液体能充分、快速地透过二者的界面从一个部分渗入到另一个部分，例如样品垫的前边缘搭接贴附在金标垫的后边缘，样品垫与金标垫间界面面积较大，可以使血液更快地渗入到金标垫中，进一步快速溶解金标垫中灌注的金标睾酮抗原。所述样品垫的前边缘的上表面与金标垫的前边缘的上表面优选为平齐设置。所述NC膜的中部喷涂有多条(本实施例中为10条)由睾酮单克隆抗体溶液形成的条带6，所述条带平行间隔设置，所述条带的延伸方向平行于所述NC膜的后边缘或前边缘的延伸方向。所述睾酮单克隆抗体溶液的浓度优选为5.2ng/mL (针对男性)或0.52ng/mL (针对女性)。所述NC膜起到承载所述条带的作用，所述吸水垫具有一定的吸水能力，可以防止样品过多时从前端溢出。
[0026]所述金标垫上可灌注有金标睾酮-BAS溶液。所述金标睾酮-BAS溶液的浓度优选为4.2ng/mL (针对男性)或0.42ng/mL (针对女性)。
[0027]所述样品垫的上方可对应设有样品孔。当通过样品孔滴加血液样品后，血液溶解金标垫中灌注的金标睾酮抗原(金标睾酮-BAS)并推动其在层析膜(即NC膜)上泳动。血液中的睾酮就会和金标睾酮抗原竞争性的与第一条睾酮抗体(即靠近金标垫的第一条条带的睾酮单克隆抗体)结合，使得金标睾酮抗原如果不能完全被第一条单抗条带(即上述第一条条带，由此向前依次为第二条带、第三条带、……)拦截，则继续向前泳动，与第二条单抗条带反应而呈现两条色带，如果不能完全被前两条单抗条带拦截，则将继续向前泳动，进而将有更多的条带显色。血液样品中睾酮含量越高，向前泳动的距离越长，显色的条带数也就越多，从而实现对血液中睾酮固浓度的半定量测试。
[0028]本实用新型的制作方法是:
[0029]1、制备睾酮一BSA金标记:将胶体金与睾酮一BSA按一定比例混匀,使胶体金与睾酮一BSA形成稳定的胶体金颗粒，通过提纯形成睾酮一BSA—胶体金标记物。
[0030]2、确定睾酮一BSA和抗睾酮单克隆抗的最佳包被浓度:通过一系列的正交试验和检测线的显色情况，使检测线能够清晰显色时对应的最低浓度为最适浓度。
[0031]具体可将单克隆抗体和睾酮一BSA金标复合物各稀释一系列等级浓度，包被在处理好的金标垫和层析膜 上，用阴性样品进行测试，通过对上述一系列浓度等级的阴性样品测试的层析膜上检测线的显色程度的对比筛选，选择最佳显色程度对应的睾酮单克隆抗体溶液和金标睾酮-BAS溶液浓度值作为对应的最佳包被浓度，即前文述及的浓度优选值。
[0032]3、试纸条的制备:将筛选好的单克隆抗体用Bio—dot喷膜机喷涂在NC膜上，优选喷涂10个条带，室温干燥。将最适浓度的金标睾酮一BSA灌注到已经裁剪好的金标垫上，4--C冰箱中干燥备用。依次将NC膜、吸水垫、金标垫、样品垫粘贴在PVC底板的相应位置。将粘好的PVC材料切成一定宽度的试纸条，即制成所述半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条。
[0033]其中，睾酮一BSA金标记物可采用如下方法制备:将睾酮一BSA透析除盐，取20nm胶体金溶液IOOmL,用0.01mol/L K2CO3将胶体金溶液pH值调至6.5左右。在磁力搅拌器下将6mL睾酮一BSA溶液(lmg/mL)逐滴缓慢加入到胶体金溶液中，继续搅拌30min。然后低速离心取上清弃沉淀、高速离心弃上清取沉淀，通过纯化浓缩形成睾酮一 BSA—胶体金标记物，冷藏备用。
[0034]可采用以下方法对所制成的上述试纸条进行检验:在检测前先将样本和试纸板放在室温条件下15分钟。然后将试纸条放在操作平台上，往样品孔中滴加20 μ L的样品溶液，5分钟后，根据出现红色条带的数量即可计算出血睾酮的浓度:
[0035]I)阴性标本的检测:将20 μ L蒸馏水滴入样品孔中，5分钟后，只有一条色带为阴性。
[0036]2)阳性样本的检测:将20yL待测液滴入样品孔中，5分钟后，有两条色带，针对男性用试纸条，表示血睾酮浓度>2.6ng/mL (针对女性用试纸条，表示血睾酮浓度>0.04ng/mL);显示三条条带的,针对男性用试纸条,表示血睾酮浓度为3.7ng/mL左右(针对女性用试纸条，表示血睾酮浓度为0.046ng/mL左右)；当显示四条条带时，对于男性用试纸条表示血睾酮浓度约为4.7ng/mL左右(对于女性用试纸条表示血睾酮浓度为0.052ng/mL左右)，依次类推。
[0037]3)对试纸条特异性的检验:试纸与血液中其他成分均无交叉反应。
[0038]采用本实用新型进行血睾酮浓度检测时可参照上述自检项目2)进行。
[0039]本实用新型利用层析法免疫胶体金技术半定量检测血清睾酮浓度，具有使用器具简单、操作便捷、出结果快速和相对准确的特点，测量精度方面，男性可以达到270ng/dL(10nmol/L)以上，女性可以达到4ng/dL(l.3nmol/L)以上。
[0040]本文采用“前、后”这类用语是为了表述上的便利，目的是表达清楚各组成部分间的相对位置关系，并不构成为对本实用新型具体结构的限定。
【权利要求】
1.一种半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，设有基板，其特征在于所述基板上由后至前依次黏贴有样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫。
2.如权利要求1所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述NC膜完全贴附在所述基板上，所述金标垫的前边缘和所述吸水垫的后边缘分别搭接贴附在所述NC膜的后边缘和前边缘上，所述样品垫的前边缘搭接贴附在所述金标垫的后边缘上。
3.如权利要求2所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述基板为PVC板。
4.如权利要求3所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述样品垫的前边缘的上表面与金标垫的前边缘的上表面平齐。
5.如权利要求4所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述样品垫的上方对应设有样品孔。
6.如权利要求5所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述条带的条数为10条。
7.如权利要求1、2、3、4、5或6所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述NC膜的中部喷涂有多条由睾酮单克隆抗体溶液形成的条带，所述条带平行间隔设置，所述条带的延伸方向平行于所述NC膜的后/前边缘的延伸方向。
8.如权利要求7所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述金标垫上灌注有金标睾酮-BAS溶液。
9.如权利要求8所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述睾酮单克隆抗体溶液的浓度为5.2ng/mL或0.52ng/mL。
10.如权利要求9所述的半定量检测血睾酮浓度的免疫胶体金试纸条，其特征在于所述金标睾酮-BAS溶液的浓度为4.2ng/mL或0.42ng/mL。
【文档编号】G01N33/74GK203786125SQ201420024396
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】周越, 杨苗苗, 张俊芬, 李俊平, 何辉, 熊开宇, 王瑞元 申请人:北京体育大学