专利名称：空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及用来实现高通量检测蛋白质-蛋白质、蛋白质-效应物、蛋白质-DNA、DNA-DNA、配体-受体等相互作用的检测方法及其专用设备。
背景技术：
生物芯片是二十世纪九十年代初问世的，正在发展成为生命科学的重要技术平台。目前，生物芯片主要包含DNA芯片(又称基因芯片)和蛋白质芯片。DNA芯片是根据互补单链DNA的杂交原理，采用荧光标记法检测；蛋白质芯片是基于蛋白质捕获分子“配件”的特异性反应，现在也主要是采用荧光标记。对DNA来说，相对稳定，标记法对检测精度影响不大，但较麻烦。蛋白质却不然，不仅标记麻烦，而会影响到结合位点，即影响检测精度。因此，需要寻找无标记检测法。基于表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)原理的检测方法，以其无需标记、实时和灵敏而受睐(见中国专利ZL99107780.6，申请日为1999年5月28日)。SPR检测可分为光强法(包括角度扫描和波长扫描)和相位法两大类。理论分析和相关实验证明，相位检测与光强检测相比，灵敏度要高1-2个数量级。尽管相位检测比光强检测相比，技术要求高，但还是越来越受到重视。相位检测主要有外差干涉、剪切干涉、椭偏和Mach-Zehnder干涉等方法。外差干涉法的工作原理已在上述中国专利ZL99107780.6中详细描述，其特点是检测精度高，但只能单点检测或对单元数量不多的线阵进行检测，无法实现面阵列测量。由俄罗斯P.I.Nikitin提出的剪切干涉原理(见图1)是一束会聚的正交线振光透过棱镜2射到棱镜2和金膜1的界面上，接着从该界面反射，又透过棱镜2射到双折射晶体3上。入射光被双折射晶体3分成两束，这两束光通过偏光镜4后在光电检测器5的阵面上产生干涉，干涉条纹被其转换成电信号。当发生表面等离子体共振时，其中一个线偏振分量发生相移，光电检测器5的接收面上的干涉条纹相位随之变化，分析其变化就可获取相关信息。这种方法结构紧凑，但空间分辨率低，实用性差。
由美国Accurio LLC.科学仪器公司开发的SPR成像椭偏仪的工作原理(见图2)是He-Ne激光器6发出的激光通过线性起偏器7和1/4波片8后成椭圆偏振光，再透过棱镜9射到棱镜9与金膜10的界面上。接着，从棱镜9与金膜10的界面反射，反射光完全是线偏振光。反射光透过棱镜9，通过长工作距物镜13和分析器14，成像在CCD(电荷耦合器件)15上。吸附在金膜10上的耦联层11上固定有受体；样本溶液12包含分析物(即配体)。当样本溶液12中的“配体”与固定在耦联层上的“受体”结合时，在SPR的条件下，从棱镜9和金膜10界面反射的光的偏振态就发生变化，由CCD15检测出其变化，经处理后得到相关信息。这种方法精度高，可阵列检测，而且阵列容量可很大，甚至可对应一个CCD像素测量一个检测点，但是检测时间较长，适合静态测量，难能达到实时检测要求。
由俄罗斯P.I.Nikitin等人提出的Mach-Zehuder干涉仪工作原理(见图3)是来自激光器16的p偏振光通过起偏器17后成线偏振光，射到分光镜18上后分成两束。一束通过起偏器19和相位延迟波片20射到反射镜21上，作为参考光；另一束透过棱镜22射到棱镜22和金膜23的界面上，而后反射并透过棱镜22，射到分光镜25上，作为测量光束。在分光镜25上，测量光束与从反射镜21反射的参考光重叠，产生干涉。所产生的干涉光束通过检偏器26和由透镜27与28组成的透镜组后，成像在CCD(电荷耦合器件)29上。当在SPR条件下阵列面24上发生反应，从棱镜22和金膜23界面反射的光就会发生相位变化，干涉条纹的相位也随之变化，由CCD29记录，处理后得到有关信息。这种方法能实现阵列检测，即一次同时读入阵列芯片中各单元的信息，可是该系统的参考光与测量光不共光路，机械振动和温度变化都影响检测精度，难以得到理想的高精度。
为了提高Mach-Zehnder干涉法的检测精度，台湾国立清华大学吴辰明(Chien-Ming Wu)把Mach-Zehnder干涉与外差干涉结合起来，其工作原理(见图4)是由氦氖激光器30发出的激光通过分光镜31后分成两束，一束通过声光调制器32后射到反射镜33上，反射后射到分光镜36上；另一束经反射镜34反射后，再通过声光调制器35射到分光镜36上。在分光镜36上，两束光混合成一束。声光调制器32和35的调制频率分别为40MHz和40.06MHz，合成后的光束是具有60KHz频率的线性正交偏振光。接着，合成的光在通过分光镜37后被分成两束光，一束通过起偏器38后产生干涉，干涉信号由光电接收器39转换成电信号，作为参考信号；另一束进入棱镜41，射到棱镜41与金膜40的界面上，反射后进入全内反射棱镜(Total Inflection，简写为TIR)42。从全内反射棱镜42射出的光通过起偏器43后产生干涉，干涉信号由光电接收器44转换成电信号，作为测量信号。当金膜40的表面发生反应且在SPR共振条件下，从棱镜41和金膜40的界面反射的光就发生相位变化，通过起偏器43后产生的干涉条纹相位随之变化。比较光电接收器39与44输出信号的相位差，就能获得相关信息，很显然，这种方法实现了测量光与参考光共光路，能提高精度。但是，结构复杂了，还要求声光调制器的频率很稳定。
现代生物技术既要求检测精度高，又希望达到高通量，还要求结构简单、可靠。显然，上述方法都存在不足。

发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种新的生物芯片检测方法及系统，可以检测不同容量的DNA芯片和蛋白质芯片，实时获取生物分子相互作用的信息。
本发明提供了一种空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)激光器发出的激光经衰减器后进行空间滤波和准直；准直后的光经起偏器和矩形光栏后成矩形平行线偏振光束；2)所述矩形平行线偏振光束经生物传感单元反射后射入一维放大透镜组；从一维放大透镜射出时，光斑恢复到入射生物传感单元时的形状和大小；3)使一维放大透镜组射出的光射入渥拉斯顿棱镜，入射光中所包含的偏振方向正交的s光和p光被分成两条沿不同方向传播的光线，从而在渥拉斯顿棱镜中实现共光路空间相位调制，产生表面等离子体共振空间干涉；4)上述产生的干涉条纹经起偏器和成像透镜后，成像在CCD(电荷耦合器件)靶面上，由CCD将干涉图像转换成电信号，经处理后存入计算机；计算机对CCD获得的图像进行处理，能同时获得生物传感单元里的阵列芯片中各单元上发生反应的即时相位变化信息，提供给生物学家和医学家进行解析。
本发明还提供了一种空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，包括入射臂、生物传感单元、反射臂和信号处理单元，其特征在于所述反射臂位于生物传感单元反射光射出的一侧，包括依次置于反射光轴上的一维放大透镜组、渥拉斯顿棱镜、检偏器和成像透镜。
本发明所述的一维放大透镜组由共光轴的平-凸柱面镜和平-凹柱面镜组成，所述平-凹柱面镜的凹面为光线入射面，所述平-凸柱面镜的凸面为光线射出面，所述一维放大透镜组的放大倍数为2～4倍。
本发明所述的渥拉斯顿棱镜的分束角为2.5°～10°，通光口径为10×10-20×20mm2。
本发明所述的生物传感单元为表面等离子体共振生物传感器，包括直角或梯形棱镜、折射率油层、阵列芯片以及置于所述阵列芯片下的样本池；所述直角或梯形棱镜、折射率油层和阵列芯片的光学玻璃基片的折射率相同。
本发明所述阵列芯片的光学玻璃基片的材料为火石玻璃。
本发明所述的入射臂包括置于生物传感单元一侧的He-Ne激光器，以及依次设置在所述激光器光轴上的衰减器、空间滤波器、准直器、起偏器和矩形光栏；所述衰减器镀有金属膜，衰减比是20％-50％，所述空间滤波器的小孔的光栏孔径为5-50μm，所述矩形光栏的通光口径为4×4-20×20mm2。
本发明提供的这种空间相位调制阵列检测生物芯片方法以及用于该方法的空间相位调制阵列检测生物芯片系统，能阵列(即同时)检测发生在阵列传感单元上生物分子相互作用时引起的反射光的相位变化，提供给生物学家和医学家解析。本发明可以实现无标记、实时、阵列检测蛋白质-蛋白质、蛋白质-效应物、蛋白质-DNA、DNA-DNA、配体-受体等生物分子的相互作用，获得动力学特性、空间位点、空间效应以及结构与功能等信息，具有灵敏度高和检测效率高等优点。


图1为已有的一种SPR剪切干涉传感检测原理示意图。
图2为已有的一种SPR成像椭偏检测原理示意图。
图3为已有的一种SPR Mach-Zehnder干涉传感检测原理示意图。
图4为已有的一种改进的SPR Mach-Zehnder干涉传感检测原理示意图。
图5为本发明实施例的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统的结构示意图。
图6为本发明实施例的阵列芯片结构示意图。
图7为本发明实施例的一维放大透镜组光学原理图。
图8为本发明实施例的信号处理单元的方框图。
图9为本发明实施例的信号处理流程图。
具体实施例方式
下面结合附图对采用本发明所保护的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法和空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统进行说明。
本发明由基于阵列相位检测的生物传感单元、入射臂、反射臂和信号处理单元四大部分组成，如图5所示。其中，生物传感单元为表面等离子体共振生物传感器，包括直角或梯形棱镜51、置于直角或梯形棱镜51底面的折射率油层52和阵列芯片53、以及置于阵列芯片53下面的样本池54；所述的入射臂位于生物传感单元的一侧，依次包括He-Ne激光器45、衰减器46、小孔光栏47、准直器48、起偏器49和矩形光栏50；所述的反射臂位于与入射臂相对应的生物传感单元的另一侧，依次包括一维放大透镜组55、渥拉斯顿棱镜56、检偏器57和成像透镜58；所述的信号处理单元包括依次连接CCD(电荷耦合器件)59、信号处理电路板60和计算机61，所述信号处理电路板60插在计算机61的主板上，可对CCD59输出的电信号进行处理，转化为数字信号，输入计算机。信号处理电路板60包括计算机接口、单片机、驱动时序电路、存储体、A/D转换电路以及相关双采样电路等。
He-Ne激光器45发出的激光经衰减器46后使光强达到CCD59的接收要求，再通过孔径为φ5-50μm的小孔光栏47和准直器48后扩束成平行光，平行光经过起偏器49后成线偏振光；接着，通过孔径为4×4-20×20mm2的矩形光栏50后成矩形平行线偏振光，保证光斑能覆盖阵列芯片53。棱镜可为直角棱镜和梯形棱镜，图5中所示的为直角棱镜。为了消除直角棱镜51和阵列芯片53玻璃光面之间气隙的影响，两者之间充填与两者折射率一致的折射率油层52。
本发明所述的衰减器为镀有金属膜，衰减比是20％-50％；本发明所述的阵列芯片的玻璃基片的材料为火石玻璃，大小为8×8-20×20mm2，厚度为0.2-1.2mm渥拉斯顿棱镜的分束角为2.5°-10°，通光口径为10×10-20×20mm2。
调整矩形平行光入射棱镜51的入射角，保证光束通过棱镜51和折射率油层52，射到所述阵列芯片53的玻璃基片与金膜的界面上，并使光波转变成倏逝波，激发所述阵列芯片53上的金膜表面的等离子体波，即产生表面等离子体共振，这时的入射角称为共振角。矩形光从所述的阵列芯片53的玻璃基片与金膜的界面上反射，透过所述的阵列芯片53的玻璃基片、折射率油层52和棱镜51，射入到所述的一维放大透镜组55；反射光束通过一维放大透镜组55后，出自所述矩形光栏50的矩形平行偏振光入射到所述的棱镜51和阵列芯片53上，并反射后而造成压缩的光斑被放大复原。接着，复原后的矩形平行偏振光射入渥拉斯顿棱56，入射光中所包含的偏振方向正交的s光和p光在渥拉斯顿棱镜中沿不同方向传播，两光线间的横向位移量随光线离渥拉斯顿棱镜不同而不同；由于矩形入射光中包含无数光线，因而在渥拉斯顿棱镜中产生干涉，干涉条纹位于与棱镜的通光面平行的平面上，实现了共光路空间相位调制，并产生SPR空间干涉。干涉条纹经检偏器57和成像透镜58后成像在CCD59的靶面上，调整成像透镜58，可保证干涉条纹图像完全对应成像在CCD59的靶面上，既不超出靶面，又不小于靶面。所述的信号处理单元60对CCD59接收的信号进行处理，转换成数字信号存入计算机。对CCD获得的一幅或几幅图像进行处理，处理后可同时获得阵列芯片中各单元上发生反应的即时相位变化信息，提供给生物学家和医学家进行解析。
将样本溶液输入所述的样本池54，当固定在阵列芯片各单元上的“受体”与样本溶液中的“配体”结合时，矩形平行光中的p光分量就发生相位变化，在渥拉斯顿棱镜57中产生的对应的干涉条纹的相位随之变化，CCD59实时记录下来，经信号处理电路板60处理后存入计算机61；计算机61实时处理存入的数据，同时得到阵列芯片53中各阵列单元上发生反应的信息。阵列芯片53上各阵列单元的反应不断进行，计算机61实时给出相对应的信息。
图6所示，本发明所述的阵列芯片可采用如下结构它由玻璃基片62，金膜63、耦联层64和传感阵列单元65组成。传感阵列单元65是生物分子探针(亦可称“配体”)，可与所分析的生物分子结合(亦可称与“受体”耦联)，用点样机点在耦联层64上，构成阵列；传感阵列单元65中的各单元可以固定不同的分子探针，从而一次可以分析多种生物分子。
图7所示，本发明的一维放大透镜组可采用如下结构它由共光轴的平-凸柱面镜和平-凹柱面镜组成。平-凹柱面透镜66的凹面对着由棱镜51反射出来的光，为光线入射面，平-凸柱面镜67的平面对着平-凹柱面透镜66的平面，平-凸柱面镜67的凸面为光线射出面。
图8所示，本发明所述的信号处理单元包括CCD、信号处理电路板和计算机，所述信号处理电路板可采用如下结构它由计算机接口、单片机、驱动时序电路、存储体、A/D转换电路和相关双采样电路等部分组成。计算机发出采样指令后，经计算机接口，由单片机接收，单片机接收到计算机的采样指令后，启动驱动时序，产生各种时序脉冲。首先，启动CCD，将干涉条纹图像信号转换成电信号。接着，启动相关双采样工作，依次采集并保持CCD各单元中的电信号，为模数转换创造条件。相关双采样是在同一像素周期内的暗电平参考区间和信号电平区间进行两次采样，并将两次采样值模拟相减后得到相关干涉条纹的电信号的真实成分，达到高保真采样。A/D转换电路的输入与相关双采样电路的输出相连，依次将CCD各单元的模拟电信号转换为数字信号。在驱动时序的控制下，依次将A/D转换电路输出的数字信号存入存储体，存储体可以存一行CCD上各单元的数据，亦可存1帧至5帧甚至更多帧CCD接收的干涉条纹图像数据。计算机可通过接口一次读入存储体中的全部图像数据。
图9所示，信号处理的工作流程是启动计算机，发出指令给信号处理单元；信号处理单元开始工作，进行干涉条纹图像的接收、采集和模数转换，A/D转换电路输出的图像数据存入存储体。完成后，计算机从信号处理单元的存储体中读取图像数据，进行第一幅图像的相位解析。接着，读取下一幅图像，求其相位分布值，并与第一幅图像对应点比较，求出对应点的相位差。紧接着，求出图像中各阵列单元与第一幅图像中各对应阵列单元的相位差的平均值，绘制出相位变化曲线。
权利要求
1.空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)激光器发出的激光经衰减器后进行空间滤波和准直；准直后的光经起偏器和矩形光栏后成矩形平行线偏振光束；2)所述矩形平行线偏振光束经生物传感单元反射后射入一维放大透镜组；从一维放大透镜射出时，光斑恢复到入射生物传感单元时的形状和大小；3)使一维放大透镜组射出的光射入渥拉斯顿棱镜，入射光中所包含的偏振方向正交的s光和p光被分成两条沿不同方向传播的光线，从而在渥拉斯顿棱镜中实现共光路空间相位调制，产生表面等离子体共振空间干涉；4)上述产生的干涉条纹经起偏器和成像透镜后，成像在CCD靶面上，由CCD将干涉图像转换成电信号，经处理后存入计算机；计算机对CCD获得的图像进行处理，能同时获得生物传感单元里的阵列芯片中各单元上发生反应的即时相位变化信息，提供给生物学家和医学家进行解析。
2.空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，包括入射臂、生物传感单元、反射臂和信号处理单元，其特征在于所述反射臂位于生物传感单元反射光射出的一侧，包括依次置于反射光轴上的一维放大透镜组、渥拉斯顿棱镜、检偏器和成像透镜。
3.根据权利要求2所述的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，其特征在于所述一维放大透镜组由共光轴的平一凸柱面镜和平一凹柱面镜组成，所述平一凹柱面镜的凹面为光线入射面，所述平一凸柱面镜的凸面为光线射出面，所述一维放大透镜组的放大倍数为2～4倍。
4.根据权利要求2所述的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，其特征在于所述的渥拉斯顿棱镜的分束角为2.5°～10°，通光口径为10×10-20×20mm2。
5.根据权利要求2所述的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，其特征在于所述生物传感单元为表面等离子体共振生物传感器，包括直角或梯形棱镜、折射率油层、阵列芯片以及置于所述阵列芯片下的样本池；所述直角或梯形棱镜、折射率油层和阵列芯片的光学玻璃基片的折射率相同。
6.根据权利要求5所述的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，其特征在于所述阵列芯片的光学玻璃基片的材料为火石玻璃。
7.根据权利要求2所述的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片系统，其特征在于所述入射臂包括置于生物传感单元一侧的He-Ne激光器，以及依次设置在所述激光器光轴上的衰减器、空间滤波器、准直器、起偏器和矩形光栏；所述衰减器镀有金属膜，衰减比是20％-50％，所述空间滤波器的小孔的光栏孔径为5-50μm，所述矩形光栏的通光口径为4×4-20×20mm2。
全文摘要
空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法及系统，属于生物技术领域，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的生物芯片检测方法及系统，可以无需标记检测不同容量的DNA芯片和蛋白质芯片，实时获取生物分子相互作用的信息。本发明公开的空间相位调制干涉阵列检测生物芯片的方法的原理是从生物传感单元反射的光通过一维放大透镜组后再射入渥拉斯顿棱镜，所包含的偏振方向正交的s光和p光被分成两条沿不同方向传播的光线，在渥拉斯顿棱镜中实现共光路空间相位调制干涉；干涉条纹经起偏器和成像透镜后由CCD转换成电信号，经处理后同时获得阵列芯片中各单元上发生反应的即时相位变化信息，提供给生物学家和医学家进行解析。
文档编号G01N21/25GK1588064SQ20041005732
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者余兴龙, 王鼎新, 魏星, 刘俊峰 申请人:清华大学