专利名称：集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的制备方法
技术领域：
本发明属于集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的制备方法。
背景技术：
近年，微全分析系统越来越受到人们的重视。它是利用微加工技术在芯片上制造微孔道、微反应池、微反应器等功能单元构成的分析系统，在此系统中可以进行样品的浓缩、分离、反应和检测等化学实验操作，即将整个化学分析过程从进样到检测集成到一个微型系统，进行自动快速分析。芯片毛细管电泳作为微分析系统的一个重要部分具有分析速度快、信息量高、操作费用低、样品消耗小等突出优点一直为人们所关注。但是，适用于芯片毛细管电泳的微型检测系统的进展比较缓慢。目前主要使用激光诱导荧光(LIF)检测(Anal.Chem.1997，69，3407-3412)，但这种检测方式所需的检测装置体积大、成本高，尚难以与微芯片匹配。而且在大量的被分析物中，很多物质不带有荧光基团，必须经过操作繁琐的衍生后才能进行LIF检测。三联吡啶钌电化学发光检测是一种基于电化学和光谱技术的非常灵敏的检测技术，可用于药物分子、氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等多种物质的检测。其优点在于检测灵敏度高，线性范围宽，重现性好，所需仪器设备简单经济。Manz曾经报道芯片毛细管电泳间接电化学发光检测(Anal.Chem.2001，73，3282-3288)，采用玻璃做为芯片材料，铂为工作电极。但此种芯片和电极制作过程复杂，对设备要求高，系统稳定性差，加之是间接检测，都限制了该系统在实际中的应用。Fang也曾报道过短距离石英毛细管电泳电化学发光检测(Anal.Chim.Acta2002，456，167-175)，但此系统还不能算真正意义的毛细管电泳芯片，其工作电极为外加的铂电极，光信号通过外加的光导纤维传送到光电倍增管再进行检测，操作过程繁琐、费时，整个系统复杂而且没有做到集成化。

发明内容
本发明的目的是提供一种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片。
本发明的另一目的是提供这种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的制备方法。
本发明的第三个目的是提供这种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的应用。
为实现上述目的，本发明采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)/玻璃作为芯片材料，带有铟锡氧化物(ITO)涂层的导电玻璃为工作电极。整个芯片放置于暗盒中，暗盒底部有透光窗，光信号可通过透光窗被光电倍增管捕获，并输出到计算机上处理。
制备过程如下制作PDMS通道的玻璃模板由光刻法制作，采用涂有光刻胶的铬版玻璃为原材料，光刻所需的掩膜为打印的带有通道图案的透明胶片，通过光刻将图案投影到光胶层上，然后用显影液显影并除去铬层，用1.7％∶1.3％的HF/NH4F玻璃腐蚀液，对玻璃腐蚀15-30分钟，制作出玻璃模板；将PDMS单体与固化剂按10∶1的比例混合，经真空泵脱气，然后倾倒于玻璃模板上，在60-80℃烘箱中加热1-2小时固化；待完全固化后，将PDMS层从玻璃模板上剥下；芯片的液体池用不锈钢管在PDMS层上打孔制得，所得的芯片电泳通道10-20μm深，顶部20-50μm宽，底部30-60μm宽。
芯片底片采用ITO导电玻璃制得，首先在切割好的导电玻璃上涂上光胶，光胶量为3-10μL，光胶可以以滚涂或旋涂方式进行涂敷，然后在1000-4000转/分下旋转50-100秒，以打印好的带有电极图案的胶片为掩膜进行光刻，然后用显影液显影，以摩尔比＞1∶3的FeCl3/HCl或摩尔比＜1∶2的HNO3/HCl混合溶液对玻璃表面的ITO进行腐蚀30-60秒，最后除去多余的光胶，ITO工作电极及芯片底片就制作完成了，工作电极有效部分宽度为50-200μm。
依次用清洁剂、去离子水、无水乙醇对做好的电极板和PDMS层超声清洗3-10分钟，然后在吹风机下吹干并保持电极板和PDMS层的表面清洁，在显微镜下将电极板和PDMS层以可逆键合的方式粘合在一起，并使电极和分离通道的出口相距20-40μm。整个芯片如图1所示。
芯片毛细管电泳电化学发光检测采用三电极体系，以集成在芯片底片上的ITO电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl/饱和KCl溶液为参比电极，其中对电极、参比电极和芯片电泳所需的接地极采用聚苯乙烯塑料管集成为整体，以柱端检测方式检测。工作电极电压1.2V。毛细管电泳分离采用场强为200-300V/cm，硼酸或磷酸为缓冲液，检测池中的三联吡啶钌溶液浓度1-5mM。
本发明设计的这种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片具有制作简单、使用方便、系统稳定、费用低廉等特点。很多物质可以直接检测分离而不需要衍生，它们包括各种烷基胺、氨基酸、草酸及其盐、NADH以及多种含氮药物等。
本发明是利用电化学发光作为检测技术与芯片毛细管电泳技术相结合而设计的集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片。PDMS属于一种聚合物材料，它能重复可逆形变，很容易用模塑法进行精密加工且无需超净环境。PDMS还具有良好的透光性，能透过300nm以上的紫外光。PDMS还可以与平整的表面可逆或不可逆的粘合在一起。如采用可逆方式，当电泳的通道发生阻塞时，整个芯片可以拆开清洗，十分方便。ITO是一种透明的导电材料，由于具有良好的导电性、透光性及稳定性被广泛应用于液晶显示行业。工作电极采用标准的光刻技术、化学腐蚀等方法制作在玻璃片上并作为芯片的底片。整个芯片由带有微沟道的PDMS层和电极底片可逆键合而成。由于ITO是一种透光材料，作为工作电极集成到芯片的底片上大大简化了操作，提高了电化学发光信号的采集效率。电化学发光检测采用柱端模式。


附图一为集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的示意图。图中1)PDMS层；2)底板；3)样品池；4)缓冲液池；5)检测池；6)工作电极；7)分离通道；8)光电倍增管。
附图二为对氧氟沙星连续六次进样检测电泳图，纵坐标为信号强度，横坐标为时间。
附图三为对脯胺酸连续六次进样检测的电泳图，纵坐标为信号强度，横坐标为时间。
附图四为对三丙胺(a)和脯胺酸(b)的分离检测的电泳图，纵坐标为信号强度，横坐标为时间。
具体实施例方式
实施例1光刻所需的掩膜是由高清晰度3000dpi的激光打印机输出的带有通道图案的透明胶片。覆盖在涂覆有光胶的铬版玻璃上，经紫外灯曝光，然后用显影液显影并除去铬层，清洗干净，置于1.7％∶1.3％的HF/NH4F玻璃腐蚀液中，对暴露的玻璃部分进行腐蚀15分钟，腐蚀完毕，用2％氢氧化钠溶液去除多余的光胶并除去铬层。玻璃模板洗净，晾干。将PDMS单体与固化剂按10∶1的比例混合，经真空泵脱气，然后倾倒于玻璃模板上，在60℃烘箱中加热2小时固化。待完全固化后，将PDMS层从玻璃模板上剥下，然后用刀片将PDMS切割成所需的芯片形状。芯片的液体池用不锈钢管在PDMS层上打孔制得。所得的芯片电泳通道10μm深，顶部约20μm宽，底部约30μm宽。
芯片底片采用ITO导电玻璃制得。将导电玻璃切割成7×2cm的长方形小块，固定在旋涂机上，在250转/分钟下于一端距离边缘1.5cm处涂上光胶，光胶量为3μL。涂完后，在4000转/分下旋转50秒，以打印好的带有电极图案的胶片为掩膜进行光刻，其中电极宽度为50μm。然后用显影液显影，之后以摩尔比为1∶3的FeCl3/HCl混合溶液对玻璃表面的ITO进行腐蚀30秒，最后除去多余的光胶，ITO工作电极及芯片底片就制作完成了。工作电极有效部分宽度为50μm。
依次用清洁剂、去离子水、无水乙醇对做好的电极板和PDMS层超声清洗10分钟，然后在吹风机下吹干并保持电极板和PDMS层的表面清洁。在显微镜下将电极板和PDMS层以可逆键合的方式粘合在一起，并使电极和分离通道的出口相距20μm。
芯片毛细管电泳电化学发光检测采用三电极体系，以集成在芯片底片上的ITO电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl/饱和KCl溶液为参比电极。其中对电极、参比电极和芯片电泳所需的接地极采用聚苯乙烯塑料管集成为整体，以柱端检测方式检测。工作电极电压1.2V。毛细管电泳分离采用场强为200V/cm，10mM pH8.0的磷酸为缓冲液，检测池中的三联吡啶钌溶液浓度1mM，缓冲液为pH8.0的50mM磷酸。检测电位1.2V。进样时间5秒，进样场强为250V/cm。对100μg/mL氧氟沙星连续六次进样检测如图2所示，相对标准偏差RSD＜3.0％。对氧氟沙星的检测限为0.1μg/mL，质量检出限为10-17g。由此可见，该集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片对药物分子的检测具有很好的灵敏度和重现性。
实施例2光刻所需的掩膜是由高清晰度3000dpi的激光打印机输出的带有通道图案的透明胶片。覆盖在涂覆有光胶的铬版玻璃上，经紫外灯曝光，然后用显影液显影并除去铬层，清洗干净，置于1.7％∶1.3％的HF/NH4F玻璃腐蚀液中，对暴露的玻璃部分进行腐蚀20分钟，腐蚀完毕，用2％氢氧化钠溶液去除多余的光胶并除去铬层。玻璃模板洗净，晾干。将PDMS单体与固化剂按10∶1的比例混合，经真空泵脱气，然后倾倒于玻璃模板上，在70℃烘箱中加热1.5小时固化。待完全固化后，将PDMS层从玻璃模板上剥下，然后用刀片将PDMS切割成所需的芯片形状。芯片的液体池用不锈钢管在PDMS层上打孔制得。所得的芯片电泳通道15μm深，顶部约30μm宽，底部约45μm宽。
芯片底片采用ITO导电玻璃制得。将导电玻璃切割成7×2cm的长方形小块，固定在旋涂机上，在250转/分钟下于一端距离边缘1.5cm处涂上光胶，光胶量为10μL。涂完后，在3000转/分钟下旋转100秒，以打印好的带有电极图案宽度为200μm的胶片为掩膜进行光刻，然后用显影液显影，之后以摩尔比为1∶2的HNO3/HCl混合溶液对玻璃表面的ITO进行腐蚀30秒，最后除去多余的光胶，ITO工作电极及芯片底片就制作完成了。工作电极有效部分宽度为200μm。
依次用洗洁剂、去离子水、无水乙醇对做好的电极板和PDMS层超声清洗5分钟，然后在吹风机下吹干并保持电极板和PDMS层的表面清洁。在显微镜下将电极板和PDMS层以可逆键合的方式粘合在一起，并使电极和分离通道的出口相距40μm。
芯片毛细管电泳电化学发光检测采用三电极体系，以集成在芯片底片上的ITO电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl/饱和KCl溶液为参比电极。其中对电极、参比电极和芯片电泳所需的接地极采用聚苯乙烯塑料管集成为整体，以柱端检测方式检测。工作电极电压1.2V。毛细管电泳分离采用场强为300V/cm，10mM pH9.2的硼酸为缓冲液，检测池中的三联吡啶钌溶液浓度5mM，缓冲液为50mM pH9.2的硼酸，检测电位1.2V。进样时间5秒，进样场强为200V/cm。对100μM脯胺酸连续六次进样检测如图3所示，相对标准偏差RSD＜2.2％。对脯胺酸的检测限为1.2μM/L，绝对检出限为10-19M。由此可见，该集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片对氨基酸分子的检测具有很好的灵敏度和重现性。
实施例3光刻所需的掩膜是由高清晰度3000dpi的激光打印机输出的带有通道图案的透明胶片。覆盖在涂覆有光胶的铬版玻璃上，经紫外灯曝光，然后用显影液显影并除去铬层，清洗干净，置于1.7％∶1.3％的HF/NH4F玻璃腐蚀液中，对暴露的玻璃部分进行腐蚀30分钟，腐蚀完毕，用2％氢氧化钠溶液去除多余的光胶并除去铬层。玻璃模板洗净，晾干。将PDMS单体与固化剂按10∶1的比例混合，经真空泵脱气，然后倾倒于玻璃模板上，在80℃烘箱中加热1小时固化。待完全固化后，将PDMS层从玻璃模板上剥下，然后用刀片将PDMS切割成所需的芯片形状。芯片的液体池用不锈钢管在PDMS层上打孔制得。所得的芯片电泳通道20μm深，顶部约50μm宽，底部约60μm宽。
芯片底片采用ITO导电玻璃制得。将导电玻璃切割成7×2cm长方形小块，固定在旋涂机上，取5μL光胶滚涂在一端距离边缘1.5cm处。涂完后，在1000转/分钟下旋转80秒，以打印好的带有电极图案宽度为100μm的胶片为掩膜进行光刻，然后用显影液显影，之后以摩尔比为2∶1的FeCl3/HCl混合溶液对玻璃表面的ITO进行腐蚀60秒，最后除去多余的光胶，ITO工作电极及芯片底片就制作完成了。工作电极有效部分宽度为100μm。
依次用清洁剂、去离子水、无水乙醇对做好的电极板和PDMS层超声清洗3分钟，然后在吹风机下吹干并保持电极板和PDMS层的表面清洁。在显微镜下将电极板和PDMS层以可逆键合的方式粘合在一起，并使电极和分离通道的出口相距30μm。
芯片毛细管电泳电化学发光检测采用三电极体系，以集成在芯片底片上的ITO电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl/饱和KCl溶液为参比电极。其中对电极、参比电极和芯片电泳所需的接地极采用聚苯乙烯塑料管集成为整体，以柱端检测方式检测。工作电极电压1.2V。毛细管电泳分离采用场强为250V/cm，10mM pH9.2的硼酸为缓冲液，检测池中的三联吡啶钌溶液浓度5mM，缓冲液为50mM pH9.2的硼酸.检测电位1.2V。进样时间5秒，进样场强为200V/cm。对25μM三丙胺(a)和50μM脯胺酸(b)的分离检测如图4所示，说明此芯片可以在短时间内完成不同种物质的分离检测。
权利要求
1.一种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片，采用聚二甲基硅氧烷/玻璃作为芯片材料，带有铟锡氧化物涂层的导电玻璃为工作电极，工作电极采用光刻法加工而成并作为芯片底板和聚二甲基硅氧烷层可逆键合在一起组成整个芯片，芯片结构1)聚二甲基硅氧烷层；2)底板；3)样品池；4)缓冲液池；5)检测池；6)工作电极；7)分离通道。
2.一种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的制备方法，其特征在于芯片底片采用带有铟锡氧化物涂层的导电玻璃制得，首先在切割好的导电玻璃上涂上光胶，光胶量为3-10μL，光胶可以以滚涂或旋涂方式进行涂敷，然后在1000-4000转/分下旋转50-100秒，以打印好的带有电极图案的胶片为掩膜进行光刻，然后用显影液显影，以摩尔比＞1∶3的FeCl3/HCl或摩尔比＜1∶2的HNO3/HCl混合溶液对玻璃表面的铟锡氧化物涂层进行腐蚀30-60秒，最后除去多余的光胶，工作电极有效部分宽度为50-200μm。
3.权利要求1所述集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片，应用于含胺类药物分子的检测或用于对多种氨基酸、烷基胺、草酸及其盐或NADH的检测分析。
全文摘要
本发明属于集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的制备，采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)/玻璃作为芯片材料，带有铟锡氧化物(ITO)涂层的导电玻璃为工作电极，工作电极采用光刻法加工而成并作为芯片底板和PDMS层可逆键合在一起组成整个芯片。这种集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片的制作过程简单，容易操作，降低了芯片的成本。该集成化毛细管电泳电化学发光检测芯片可广泛应用于含胺类药物分子、多种氨基酸、烷基胺、草酸及其盐、NADH的检测分析。
文档编号G01N21/62GK1544923SQ20031011582
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月27日 优先权日2003年11月27日
发明者汪尔康, 杨秀荣, 邱海波, 严吉林 申请人:中国科学院长春应用化学研究所