专利名称：一种基于电化学hairpin DNA生物传感器的9-羟基芴测定方法
技术领域：
本发明属于电化学检测和化学传感器技术领域，涉及一种基于hairpin DNA生物传感器的制备及将所制备的传感器用于检测9-羟基芴。
背景技术：
羟基芳香烃类化合物作为芳烃类化合物的衍生物，因具有较强的生物毒性和环境危害性而备受人们关注，一些芳香酚类污染物已被列入优先监测黑名单中。由于其用途极为广泛，在许多工业领域诸如煤气、焦化、炼油、冶金、机械制造、玻璃、石油化工、木材纤维、化学有机合成工业、塑料、医药、农药、油漆等工业排出的废水中均含有羟基酚，因此预防其污染的工作也很困难，如直接排放则可污染大气、水、土壤和食品，因此对其在环境中的监测具有重要意义。 应用传统的检测手段，如气相色谱、液相色谱、液-质色谱联用、荧光光谱法等可以实现对羟基酚类污染物的离线分析，但是具有设备昂贵、测试费时等缺点。近年来，随着电化学技术的迅速发展，采用电化学DNA生物传感方法对环境污染物的检测已成为研究热点之一。应用DNA生物传感器具有能够特异性识别小分子的特点，可以实现对羟基酚类物质的检测，此外还具有性能稳定、受环境干扰和限制少、操作简单且灵敏度等优点，诸多优势使得电化学DNA生物传感器作为一种新型的检测技术被应用于环境监测领域。Marrazza等采用天然小牛胸腺DNA修饰的石墨丝网印刷电极生物传感器，采用计时溶出伏安法实现了对双酚进行的测定，研究发现采用单链DNA制备的传感器作用的响应信号要比和双链DNA传感器作用的信号强。Prabhakar等应用天然小牛胸腺DNA修饰的聚卩比咯-聚氯乙烯磺酸盐/氧化铟膜修饰电极的传感器实现了对3-氯酚的检测，鸟嘌呤氧化峰电流与浓度具有较好的线性关系，检测限达到亚微摩尔。Yang等采用酸变性的天然小牛胸腺DNA修饰的氧化玻碳电极(GCEtox))传感器实现了对I-萘酚的检测，检测限达到5nM。Zheng等结合纳米技术，将天然鲱鱼精DNA修饰到多壁碳纳米管(MCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)表面制备成DNA/MWNTs/GCE传感器，实现了对苯酚，甲基酚，儿茶酚等酚类污染物的测定，检测限达到微摩尔数量级，此传感器不足之处是对酚类化合物不具有选择性。目前，利用电化学DNA生物传感器对羟基芳香烃类化合物的检测还比较少，且主要是应用天然的DNA序列，虽然这些DNA传感器具有高灵敏性，但是对酚类化合物不具有选择性，且通过吸附作用修饰到电极表面的DNA膜均一性和稳定性较差。到目前为止，应用人工合成的硫修饰的DNA传感器对羟基酚类化合物的检测还未见报道，含硫修饰的DNA通过金-硫键作用自组装修饰到金电极表面，DNA膜结构高度有序，稳定性好，且人工合成的DNA可以对碱基进行调整，设计专一性、灵敏性较高的DNA生物传感器，有利于实现对混合体系中目标物的选择性分析检测，因而开发出一种能对某一种羟基化合物具有特殊选择性的DNA传感检测技术，在完善我国现有检测技术手段具有重要意义。

发明内容
本发明的目的在于提供一种基于通过金-硫键自组装到金电极表面的hairpinDNA传感器从而能快速检测9-羟基芴的方法。本发明所提供的电极的制备方法条件温和，操作简单，稳定性好，且运用此法制备的hairpin DNA电极对9-羟基芴的检测具有高灵敏性，选择性的优点。本发明的第一方面，涉及一种hairpin DNA修饰的金电极的制备方法，具体包括下列步骤I)电极的预处理与活化 将金电极在鹿皮抛光布上用O. 05 μ m的a -Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2 3min，重复三次；然后在O. 5mol/L H2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极；2) Hairpin DNA 溶液的配制将固体hairpin DNA用pH = 7· 4的高离子强度Tris-NaClO4缓冲溶液(Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM)溶解并稀释到一定浓度，并用漩涡振荡器混匀，于室温下静置12h,备用；3) Hairpin DNA修饰电极的制备将上述步骤I)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的hairpin DNA溶液中，于室温下静置4-5天。巯基修饰的hairpin DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，即得到hairpin DNA修饰电极。优选地，上述步骤2)中Tris-NaClO4缓冲溶液中Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM。优选地，上述步骤2)中所述的hairpin DNA为Y端双巯基修饰的含40个碱基的hairpin DNA序列,其中共包含三部分hairpin DNA序列靠近5'端的前9个碱基胸腺喃唳为柔性间隔基团，用以保持hairpin结构的双链部分以及hairpin DNA结构的“环”状部分。优选地，上述步骤2)中所述hairpin DNA的“环”部分碱基为富含鸟嘌呤和胞嘧
啶碱基序列。优选地，上述步骤2)中所述hairpin DNA双链部分匹配碱基数为5对。优选地，上述步骤2)中所述hairpin DNA的浓度为5 μ M，体积为70 90 μ L。本发明中，所使用的hairpin DNA结构是本领域人员所熟悉的，其获得可以通过供
应商获得。本发明的另一方面，涉及应用如上述制备方法得到的hairpin DNA修饰电极对羟基芴检测的方法,其具体检测方法为将上述制备的hairpin DNA修饰的金电极为工作电极，以饱和KCl溶液中的Ag/AgC为参比电极，钼电极为对电极构筑三电极体系，先将hairpin DNA修饰电极在2mM K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，然后置于以PH值为7. 4的O. 02mol/L的Tris-NaClO4缓冲溶液配制的一定浓度的9-羟基芴溶液中，反应30min，然后再进行电化学阻抗测定，比较作用前后阻抗值的变化。
与现有技术相比本专利技术具有以下优点I.本发明所采用的DNA序列为人工合成的hairpin DNA序列，碱基的序列可以根
据实验需要进行调整；2.本发明所采用的hairpin DNA序列的“环”部分的碱基为富鸟嘌呤及胞嘧啶碱基，对9-羟基芴具有较高的亲和性作用；3.本发明是通过金-硫键作用将hairpin DNA自组装于金电极表面,该方法得到的DNA膜表面结构高度有序，稳定性好，受环境干扰和限制少，方法简单易行；4.本发明所制备的hairpin DNA修饰电极对9_轻基荷的检测具有实时、响应速度快、成本较低等特点，而对其它羟基芴化合物如2-羟基芴无电化学响应； 5.本发明所采用的电化学交流阻抗法是研究电极界面现象的ー种重要手段，可灵敏的表征电极表面hairpin DNA修饰膜的变化情况，具有高灵敏度性。


图I为金电极及hairpin DNA修饰电极的阻抗谱图；图2为使用本发明的hairpin DNA修饰电极与9_羟基芴作用前后的尼奎斯特阻抗谱图DNA膜(□)，与9-羟基芴作用；其中，横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω · cm2，纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω · cm2 ;图3为使用本发明的hairpin DNA修饰电极与2_羟基芴作用前后的尼奎斯特阻抗谱图DNA膜(□)，与2-羟基芴作用；其中，横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω · cm2，纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω · cm2 ;图4为使用本发明的hairpin DNA修饰电极测定的电荷传递电阻的变化值(△ Rct)与9-羟基芴浓度关系曲线，为空白对照；其中，横坐标代表9-羟基芴浓度，单位为nM，纵坐标代表电荷传递电阻的变化值，単位为Ω · cm2 ;
具体实施例方式以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。实施例II)将金电极在鹿皮抛光布上用O. 05 μ m的a -Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在こ醇和去离子水中超声清洗，毎次2 3min，重复三次；然后在Imol/L H2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极；2)以pH = 7. 4的高离子强度Tris-NaClO4缓冲溶液将固体hairpin DNA溶解，其中Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM，用漩涡振荡器混匀，并静置于室温下12h，在此条件下形成hairpinDNA结构；3)将活化处理的金电极浸泡在预先配制的5 μ M的hairpin DNA溶液中，静置于室温下4-5天，即得到hairpin DNA修饰电极；4)以此制备的hairpin DNA修饰电极作为工作电极，以Ag/AgCl (饱和KCl溶液)电极为參比电极，钼电极为对电极构筑三电极体系，电解液为pH值7. 4的20mmol/L Tris-NaClO4 缓冲溶液配制的浓度分别为 lnmol/L、5. 5nmol/L、27. 5nmol/L、55nmol/L、110nmol/L、275nmol/L及550nmol/L的9-羟基芴溶液中，应用PARSTAT2273电化学综合测试系统进行电化学阻抗测定，实验表明，此hairpin DNA修饰电极具有优异的性能，响应时间快，灵敏度高，对9-羟基芴的检测线性范围1 275nmol/L。表lhairpin DNA修饰电极与9_羟基芴作用后的电化学阻抗变化(Λ Rct)
权利要求
1.ー种hairpin DNA修饰的金电极的制备方法,其特征在于包括以下步骤 1)电极的预处理与活化 将金电极在鹿皮抛光布上用O. 05 μ m的a -Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在こ醇和去离子水中超声清洗，毎次2 3min，重复三次；然后在O. 5mol/LH2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，得到表面干净的金电极； 2)Hairpin DNA溶液的配制 将固体hairpin DNA药品用pH = 7. 4的高离子强度Tris-NaClO4缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，并用漩涡振荡器混匀，于室温下静置12h以备用； 3)Hairpin DNA修饰电极的制备 将上述步骤I)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的hairpin DNA溶液中，于室温下静置4-5天,其中巯基修饰的hairpin DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面从而得到hairpin DNA修饰电极。
2.根据权利要求I所述的hairpinDNA修饰的金电极的制备方法,其特征在于所述Tris-NaClO4缓冲溶液中Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM。
3.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在干所述的hairpinDNA为5'端双巯基修饰的含40个碱基的hairpin DNA序列，其中共包含三部分hairpin DNA序列靠近5'端的前9个碱基胸腺嘧啶为柔性间隔基团，用以保持hairpin结构的双链部分及hairpin DNA结构的“环”状部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在干所述的hairpinDNA的“环”部分碱基为富含鸟嘌呤和胞嘧啶碱基序列。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于hairpinDNA用以保持hairpin结构的双链部分碱基数为5对。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述hairpinDNA的浓度为5 μ M，体积为70 90 μし
7.—种应用如权利要求1-5中任ー项所述制备方法得到的hairpin DNA修饰电极对羟基芴检测的方法，其特征在于具体步骤为将上述制备的hairpin DNA修饰的金电极为工作电极，以饱和KCl溶液中的Ag/AgC为參比电极，钼电极为对电极构筑三电极体系，先将hairpinDNA修饰电极在2mMK3 [Fe (CN) 6]/K4 [Fe (CN) 6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，然后置于以PH值为7. 4的O. 02mol/L的Tris-NaClO4缓冲溶液配制的一定浓度的9-羟基芴溶液中，反应30min，然后再进行电化学阻抗測定，比较作用前后阻抗值的变化。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于羟基芴为9-羟基芴。
全文摘要
本发明属于基于hairpin DNA修饰的金电极传感器检测9-羟基芴的电化学检测和化学传感器技术领域，涉及一种对9-羟基芴有电化学响应的hairpin DNA修饰的金电极的制备以及运用此电极进行9-羟基芴的检测。具体的以人工合成的巯基修饰的hairpin DNA为原料，通过金-硫键作用自组装到金电极表面制备DNA修饰电极。此固定化DNA电极对9-羟基芴有较高的响应，根据其电化学响应阻抗的变化可以进行9-羟基芴的检测。该DNA传感器制备条件温和，操作简单，稳定性好并具有较的灵敏度等优点。
文档编号G01N27/26GK102680549SQ20121011145
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者刘冠男, 刘新会, 巩文雯, 李晓宏, 梁刚, 陶莉 申请人:北京师范大学