专利名称：钾(离子)诊断/测定试剂盒及钾(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾 (离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当
血钾高达7. 5 mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确定适当的治疗 方案。血清钾超过10 ramol/L时，即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高 钾使心脏停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度计 法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、尿 液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为内标 准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主要使用 内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行 测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li的浓度，以 标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大， 血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚， 均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用 电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离 子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行
血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其 他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡在待测 标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极，感应材料 为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由难溶性金属物
质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有cr电极和F—电极；③液
态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的Ca2+电极； 用缬氨霉素膜 制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动
老化，有效期长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂，误 差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法 是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。
酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干扰 性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较好的分 析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分 析项目。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定钾 (离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钾(离子) 诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行钾(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可 以得到切实的推广应用。
本发明钾(离子)浓度测定方法原理如下-
腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷二磷酸+
磷酸烯醇式丙酮酸 腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸甘油激酶舰^+ 甘油+腺苷三磷酸 甘油+辅酶甘油脱氢酶甘油酸+还原型辅酶
这种方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC2.7丄40) 酶(偶)联甘油激酶(Glycerokinase; EC 2.7丄30)、甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase; EC 1丄1.6; EC 1.1.1.72; EC 1.1.1,156; EC 1.1.99.22)酶促反
应速率比色法。在钾离子的激活下，丙酮酸激酶酶解腺苷三磷酸反应产生腺 苷二磷酸，再通过(偶)联合甘油激酶、甘油脱氢酶的作用，最终将辅酶(在 340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得 以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度 上升的速度，可以测算钾(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾(离子)诊断/测定试剂
盒较为理想
缓冲液 lOOmmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
丙酮酸激酶 10000 U/L
甘油激酶 12000 U/L甘油脱氢酶 12000 U/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
丙酮酸 15mmol/L 甘油-3-磷酸 3 mmol/L
氯化镁 1 mmol/L
本发明的钾(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷 三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化
镁。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶。 辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油 -3-磷酸、氯化镁在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状 态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化
试剂2
7缓冲液、稳定剂、甘油激酶、甘油脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。 辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油
-3-磷酸、氯化镁在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是 干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾(离子)浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例-
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液励mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
丙酮酸激酶10000U/L
甘油激酶12000 U/L
甘油脱氢酶12000U/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
丙酮酸15 mmol/L
甘油-3-磷酸3 mmol/L
氯化镁1 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大
实施例二
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
丙酮酸甘油-3-磷酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
丙酮酸激酶
甘油激酶
甘油脱氢酶
15 mmol/L3 mmol/L1 mmol/L
100mmol/L50 mmol/L10000 U/L12000U/L12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用,在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
实施例三 '
本实施例的钾(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 50 mmol/L
3 mmol/L3 mmol/L15 mmol/L3 mmol/L1 mmol/L
腺苷三磷酸丙酮酸甘油-3-磷酸氯化镁试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂甘油激酶甘油脱氢酶试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100 mmol/L500 mmol/L12000U/L12000 U/L
100 mmol/L
10稳定剂 500 mmol/L
丙酮酸激酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定钾(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪
器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.022;吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达llmmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.015 ± 0.007AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种酶比色法及酶联法的钾(离子)的浓度测定方法，其方法原理如下腺苷三磷酸+丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸 <u>甘油激酶/Mg</u><u>2+</u> 甘油+腺苷三磷酸甘油+辅酶 <u>甘油脱氢酶</u> 甘油酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出钾(离子)的浓度大小测定结果。
2 一种钾(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括:缓冲液20—一500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L丙酮酸激酶IOOO———80000 U/L甘油激酶1000———80000 U/L甘油脱氢酶1000———訓OO U/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L丙酮酸1—50 mmol/L甘油-3-磷酸1—50 mmol/L氯化镁1—5 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷三 磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶组成。辅酶、丙 酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、 氯化镁在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺苷三 磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、 稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、甘油激酶、甘油脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳 定剂、丙酮酸激酶组成。辅酶、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶、腺 苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁在试剂l、试剂2或试剂3中的 位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钾(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括 稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油-3-磷酸、氯化镁、丙酮酸激酶、甘油激酶、甘油脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出钾(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464393SQ20071019218
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司