专利名称：一种快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种对天然成分进行快速检测的方法，特别是涉及一种对含有白黎芦醇及其糖苷成分的天然产品的快速检测的方法。
背景技术：
白藜芦醇(Resveratrol简称Res)，其化学结构是多酚类天然产物芪三酚(3，5，4’-三羟基1，2-二苯基乙烯)。天然白黎芦醇存在反式(trans-)和顺式(cis-)两种构型，白藜芦醇糖苷(Polydatin，PD)也存在顺式和反式两种构型，且具有和白黎芦醇同样的生物活性。
葡萄皮中的Res和PD含量最高，为50-100μg/g，而葡萄栽培品系、生长地点、气候、种植技术等都影响Res的含量，酿造方法对葡萄酒中Res含量的影响尤其显著，葡萄酒或葡萄汁产品中Res单体含量通常高于其糖苷的含量。
研究表明Res和PD具有显著的抗氧化、抗自由基的作用，抗肿瘤作用、心血管保护作用等。其中最引人注目的是其抗氧化和清除自由基的作用，以及影响花生四烯酸代谢的作用，因为这些生理代谢涉及到与人体健康密切相关的许多生理疾病有关。目前，白藜芦醇已经成为葡萄及葡萄酒中对人类健康最为有效、研究最多的多酚类单体物质。因此，白藜芦醇的分析测定方法作为白藜芦醇研究的必要条件得到了很大发展，特别是随着仪器分析技术的进步，分析手段、测定效果和定性定量分析的准确性都在不断提高。
关于白藜芦醇的分析方法上，目前Res的测定工作主要集中在葡萄酒样品上，另外还有一些中药的测定，测定的对象包括反式、顺式白藜芦醇及两者的糖苷。
Res和PD的仪器测定方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、气-质联用(GC/MS)法、液质联用(HPLC/MS)法和毛细管电泳(CE)等方法。另外还有用示波伏安法、电化学发光法和超压硅胶薄层荧光扫描法测定白黎芦醇。
虽然白藜芦醇的定性和定量分析方法虽然在准确度、精密度等方面已经随着分析仪器的进步达到了较高的水平，但需要专门的分析仪器、昂贵的测试费用以及较长的分析时间，这无疑制约了这些分析方法在市场经济下的推广使用，目前，还只是停留在实验室的阶段。因此，为了适应市场需求，还需要开发快速、简便、价廉的分析方法。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，本发明特别适用于葡萄酒质量监测方面，以识别天然酿造葡萄酒和人工用水、色素、香精、糖、酸等配制“葡萄酒”，或天然葡萄汁与配制葡萄汁，为加强食品市场监管提供了一种可靠的快速分析方法。
本发明所述方法，包括如下步骤被测物经固相萃取后得到分析用试样；将此试样直接定量点到聚酰胺薄膜材料上，用指定比例的展开剂进行展开；在紫外灯365nm波长的光线下观察，如果从原点至前沿同时观察到顺式白黎芦醇、顺式白黎芦醇糖苷、反式白黎芦醇、反式白黎芦醇糖苷四个黄色荧光亮点，则认为该被测物为天然产物或含有部分天然产物。
本发明具有方便快速的优点，前处理柱、薄层板、试剂、紫外灯均为市售成品，按本发明提供的操作步骤进行即可得到分析结果。检测白黎芦醇的全过程在1小时(前处理40分钟，展开10分钟)即可以得到结果，而仪器分析需时较长。价格价廉本发明无需大型设备费投入，易于在基层推广使用，特别是作为定性测定有无白黎芦醇时，操作简单；用途广泛除直接观察四个荧光点实现定性测定外，用标样对照法可以实现半定量，用薄层扫描法可以实现定量测定。因此，特别适合对红葡萄酒、红葡萄汁等含有白黎芦醇的样品进行检测。
本发明所述方法可以对浓度为纳克级(μg/L)的白黎芦醇及其糖苷进行检测，而一般葡萄及葡萄酒中的含量为毫克(mg/L)级，因此本发明的灵敏度相当高，检测限与高效液相色谱等仪器分析方法相当。
具体实施例方式
本发明所述方法的原理是被测物经固相萃取(SPE)后得到分析用试样，将此样品直接定量点到聚酰胺薄膜上，用指定比例的展开剂展开后，在紫外灯365nm波长的光线下观察，由原点至前沿可观察到顺式白黎芦醇、顺式白黎芦醇糖苷、反式白黎芦醇、反式白黎芦醇糖苷四个黄色荧光亮点。所述的展开可以采用“上行展开”，是指展开剂的展开方向，即展开剂由上至下运动。
本发明对于红葡萄酒样品的前处理，采用选定的固相萃取柱(柱填料C18，500mg-1000mg)，对特定的样品中杂质和被测物质的分步洗脱处理方法为葡萄酒5～10ml过柱后，依次用水、甲醇、磷酸溶液洗去大部分杂质后，用乙酸乙酯5～10ml洗脱白黎芦醇混合物，被测物溶液可以不经浓缩直接点样。
本发明还首次提出使用聚酰胺薄膜作为白黎芦醇及其衍生物的分析的层析材料，此材料方便易得，展开迅速，展开后的薄层板可以长期保存复查，且可以应用薄层扫描仪进行定量测定。
本发明还对展开剂的配方进行了研究，利用指定配比的展开剂，配比为苯∶甲醇∶甲酸＝10∶5∶1展开，可以完全分离四个目标化合物，且目标化合物与杂质完全分离。因此本发明可以对顺反白黎芦醇及白黎芦醇糖苷四种化合物实现快速同时定性检测，也可以通过对于展开后的薄板扫描实现定量检测。
由于用天然葡萄酿制的红葡萄酒同时含有四种白黎芦醇衍生物(顺反Res和顺反PD)，而完全由人工配制的酒则不含白黎芦醇，即便有条件在配制红酒中人工添加白黎芦醇，市场也只有白黎芦醇出售(100mg/487元人民币)而无白黎芦醇糖苷出售，因此，仍然可以通过四种白黎芦醇衍生物是否能够同时检测到来判定该产品是否为天然葡萄酿造。葡萄汁的判断原理相同。
如果被测产品含有部分天然产物，则可以通过与纯品所含白黎芦醇的量如定量点样，观察颜色深浅，或通过扫描定量来判定。
实施例红葡萄酒5～10ml加入C18固相萃取柱，待吸附完成后，依次用去离子水、10～20％乙醇、10％～15％乙醇磷酸缓冲溶液各10～15ml洗去大部分杂质后，用乙酸乙酯5～10ml洗脱白黎芦醇混合物，所得被测物溶液可以不经浓缩直接点样。
用微量点样器在2×8cm的聚酰胺薄板上点样2～8μl，垂直放入密闭的，装有指定配比(苯∶甲醇∶甲酸＝10∶5∶1)的展开剂中展开，展开距离为5～6cm，可以完全分离四个目标化合物，且目标化合物与杂质完全分离。取出薄板，挥干溶剂，在紫外灯下观察四种化合物的荧光点进行定性检测，必要时可以同时点标准样品作为对照。也可以通过对于展开后的薄板扫描实现定量检测。
最后所应说明的是以上实施例仅是说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤被测物经固相萃取后得到分析用试样；将此试样直接定量点到层析材料上，用指定比例的展开剂进行展开；在紫外灯365nm波长的光线下观察，如果从原点至前沿同时观察到顺式白黎芦醇、顺式白黎芦醇糖苷、反式白黎芦醇、反式白黎芦醇糖苷四个黄色荧光亮点，则认为该被测物为天然产物或含有部分天然产物。
2.根据权利要求1所述的快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，其特征在于，所述固相萃取具体包括将5～10ml的被测物加入C18固相萃取柱，待吸附完成后，依次用去离子水、10～20％乙醇、10％～15％乙醇磷酸缓冲溶液各10～15ml洗去大部分杂质后，用乙酸乙酯5～10ml洗脱白黎芦醇混合物。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，其特征在于，所述将此试样直接定量点到层析材料上进行展开，包括用微量点样器在层析材料上点样2～8μl，垂直放入密闭的装有指定配比的展开剂中展开，展开距离为5～6cm，可以完全分离四个目标化合物，且目标化合物与杂质完全分离。
4.根据权利要求3所述的快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，其特征在于，所述层析材料为聚酰胺薄膜。
5.根据权利要求3所述的快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，其特征在于，所述展开剂的指定比例为苯∶甲醇∶甲酸＝10∶5∶1。
6.根据权利要求1所述的快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，其特征在于，对被测物中的天然成分的含量，可以通过与纯品所含白黎芦醇的标准量相比较或通过扫描定量来判定。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测顺反白黎芦醇及其糖苷的方法，包括被测物经固相萃取后得到分析用试样；将此试样直接定量点到层析材料上，用指定比例的展开剂进行展开；在紫外灯光线下观察，如果从原点至前沿同时观察到顺式白黎芦醇、顺式白黎芦醇糖苷、反式白黎芦醇、反式白黎芦醇糖苷四个黄色荧光亮点，则认为该被测物为天然产物或含有部分天然产物。本发明所述方法检验方便快捷，灵敏度高，用于白黎芦醇的检测的全过程在1小时即可以得到结果；价格价廉，易于推广；用途广泛，特别适合对含有红葡萄酒、红葡萄汁等含有白黎芦醇的样品检测。
文档编号G01N21/64GK1624456SQ20031011717
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月4日 优先权日2003年12月4日
发明者陈敏, 舒友琴, 张绍英, 何计国, 戴蕴青 申请人:中国农业大学