专利名称：梅毒抗体与乙型肝炎表面抗原胶体金法联合检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于药品生物制品类，体外诊断试剂的范畴。用一滴血就可以检测患者是否感染梅毒或乙肝病毒，是一种新组合快速检测试剂。
背景技术：
胶体金标记及检测技术目前已经比较成熟。现有已经商品化的试剂是梅毒或乙肝表面抗原分别检测，但没有联合检测试剂的报道。
众所周知，目前我国梅毒及乙肝发病率呈不断上升的趋势，以及我国献血政策的改革，血液中心街头采血车对义务献血人员的体检显得非常重要，这就要求能够有一种简便、快速、特异性强、准确率高、少量末梢血(50μL)就可以检测几种发病率较高疾病的试剂。我们发明的这种联合检测试剂可以克服单品种检测试剂的局限性，满足血液中心街头采血车对义务献血员筛查以及家庭自助检测等快速检测的需要。

发明内容
本发明通过将梅毒抗原、抗乙肝表面抗原单克隆抗体通过特殊的喷点设备分别喷点固定在购自millipore公司的硝酸纤维素膜上，再将已预先用胶体金标记好的基因重组梅毒抗原及表面抗原单抗按比例混合，选用最佳金标结合物保护液、及金结合物吸收垫，采用双抗原夹心及双抗体夹心法原理(三条线)，分别检测人血液中的梅毒抗体或乙肝表面抗原。本试纸条灵敏度高，特异性好。可以通过中国药品生物制品检定所制定的梅毒抗体及乙肝表面抗原国家标准。
本发明的优势在于两种疾病的联合检测，填补了国内在这方面的空白。由于两种疾病可以同时检测，用肉眼进行结果判读，实验结果简单明了，不需要特殊仪器。为家庭自助检测疾病及血液中心街头义务献血员筛查及其他一些需要快速检测的机构提供了一种方便快捷准确的检测方法。


附图1 试剂条组装示意图附图2本试剂条实验结果模式A试纸条外观模拟图(使用前)，B梅毒阳性检测结果，C乙型肝炎表面抗原阳性检测结果，D梅毒、乙肝表面抗原均阳性检测结果，E阴性检测结果，F无效实验(使用后，出现这样的结果必须重复实验)具体实施方式
由本发明申请单位独家生产该产品制备程序1检测试剂条的制备1.1检测线和对照线包被检测线I包被液配制用0.01MPH8.0磷酸盐缓冲液，将基因工程重组的TP抗原配制成1.0mg/ml待用。
检测线II包被液配制用0.01MPH8.0磷酸盐缓冲液，将已事先纯化合格的鼠抗-HBs抗原配制成3.0mg/ml待用。
对照线包被液配制用0.01MPH8.0磷酸盐缓冲液，将羊抗鼠抗-HBs配制为3.0mg/ml待用。
检测线I、II划线将事先配制好的检测线I包被液、检测线II包被液分别装入分液机的指定装置内(BioDot蛋白微量喷点系统)，在硝酸纤维素膜上按0.1μl/mm的量划上两条检测线I、II。(膜的规格为25mm×310mm)。
对照线划线取事先配制好对照线包被液装入BioDot喷膜机中(蛋白微量喷点系统)，在硝酸纤维素膜上按0.1μl/mm的量划上对照线。(膜的规格为25mm×310mm)。
包被37℃2小时。
封闭将温育后的硝酸纤维素膜放入封闭液中浸泡30分钟，再用蒸馏水洗两次，在37℃真空干燥器内干燥16小时，真空度0.1。
封装在干燥室内(湿度＜20％)，将干燥好的硝酸纤维素膜装入铝箔袋内，封口。外加干燥剂防潮。
1.2胶体金-TP抗原、抗-HBs结合物垫的制备。
原理根据金标技术特性，将胶体溶液中纳米级的金颗粒与纯化的基因重组TP抗原及抗-HBs单克隆抗体分别稳定结合，形成紫红色的金标记TP抗原、抗-HBs抗体结合物，金颗粒的直径为40-50nm。
金标抗原浓度和pH的选择采用交叉配比法，TP抗原最适标记浓度为100μg/ml，pH为8.0。抗-HBs的最适标记浓度为60μg/ml，pH值为8.5。
胶体金的准备取购自SIGMA公司AuCL4产品稀释为0.01％的水溶液，煮沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.7ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积。
偶联将以上事先制备好的胶体金溶液先用0.2MK2CO3调节pH值至最适范围，再按最适标记浓度比例加入TP抗原或抗-HBs抗体，分别标记，室温搅拌30分钟。
封闭加入10％PEG20000使终浓度为1％，搅拌20分钟。
混合将上述已标记合格的TP或抗-HBs金结合物按1∶1的比例混合。
包被取10mm×310mm玻璃纤维在上述混合液中浸泡5~10分钟。
干燥将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，真空度0.1。
封装在干燥室内(湿度＜20％)，将已干燥好的玻璃纤维装入事先装有干燥剂的铝箔袋内，机器封口。
1.3组装(如下图所示)备料在干燥室内(湿度＜20％)，将已划好线的硝酸纤维素膜、胶体金结合物垫、吸水滤纸(样品垫、吸收垫)、带粘合剂的空白塑料卡片等按生产工艺要求裁切成一定的规格和尺寸。
粘贴按生产工艺要求(见附图1)将各组分粘贴在白色塑料板上。
裁切用切条机将组装好的反应板切成3(±0.2)mm宽的试剂条。
装袋取一个铝箔袋，装入1条试纸条和一枚1克重的干燥剂，机器封口。
2.试纸条的检定2.1半成品检定2.1.1外观检查白色包被反应膜平整、干净无污点、无裂缝，胶带无开胶，试纸条宽度在3(±0.2)mm，无切斜现象。
2.1.2物理检查包被反应膜的液体移行速度应大于25mm/分钟。
2.1.3 TP抗体的鉴定2.1.3.1阳性样品符合率用TP抗体诊断试剂用国家参考品中的10份阳性参比血清检定，不得出现假阴性。
2.1.3.2阴性样品符合率用TP抗体诊断试剂用国家参考品中的20份阴性参比血清检定，不得出现假阳性。
2.1.4乙肝表面抗原的鉴定2.1.4.1阳性样品符合率用乙肝表面抗原检测试剂用国家参比品中的3份强阳性参比血清检测，结果不得出现假阴性。
2.1.4.2阴性样品符合率用乙肝表面抗原检测试剂用国家参比品中的20份阴性参比血清检测，结果不得出现假阳性。
2.1.4.3灵敏度检测用HBsAg国家参比品中的灵敏度血清检测，最低检出限量应小于等于1ng/ml
2.1.5稳定性试验37℃放置20天后检测以上各项内容，应符合上述各项标准。
2.2成品检定2.2.1外观检查外观完整、无漏装组份、效期和产品批号清楚准确。
2.2.2物理检查同2.1.2。
2.2.3 TP抗体鉴定同2.1.3。
2.2.4乙肝表面抗原鉴定同2.1.4。
2.2.5稳定性检测同2.1.5。
3.成品的贮存和效期成品贮存在4~25℃干燥条件下(不得冻存)，效期为18个月。
权利要求
申请保护范围梅毒抗体与乙肝表面抗原联合检测试剂，其特征在于两种疾病联合检测，一滴血可以读到两个检测结果。
全文摘要
本发明属于药品生物制品类，体外诊断试剂的范畴。用一滴血就可以检测出患者是否感染梅毒或乙肝病毒，是一种新的检测方法组合。本发明是将目前发病率较高的梅毒抗体和乙肝表面抗原两种疾病的检测手段合并在同一条检测试纸上，利用免疫层析技术，将已纯化的梅毒重组抗原及抗－HBs单克隆抗体利用自动微量喷点设备，固定在已预处理合格的硝酸纤维素膜上，再将已用胶体金标记的梅毒重组抗原及抗－HBs单克隆抗体按一定比例混合，制备成金结合物垫，再辅以恰当的样品处理垫，组合成为试纸条(组装方式见附图)。采用双抗原夹心及双抗体夹心法原理，快速检测人全血或血清、血浆中的梅毒抗体或乙型肝炎表面抗原。克服了以前分开检测方法的很多弊端，一滴血就可以检测两种疾病，3分钟后可以判断结果，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果。准确、快速、操作简单，可单人份使用。适用于家庭自助检测及血液中心街头献血员筛查等需要快速检测的用途。填补了国内空白。
文档编号G01N33/549GK1627073SQ200310112559
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者熊晓云, 耿永尧, 张文, 陈立炎 申请人:深圳益生堂生物企业有限公司