专利名称：一种猪肺炎支原体多重组抗原elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物传染病检测用试剂盒，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine, Mps又称猪气喘病)的主要病原，也是猪呼吸道疾病综合症的ー种重要的原发性病原。Mhp主要感染猪呼吸道，本身致病カ不强，临床症状主要以咳嗽和气喘为主，病变特征主要是肺的尖叶、心叶、中间叶和隔叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。Mhp感染机体后主要与呼吸道内壁的纤毛黏附，引起纤毛细胞病变和凋亡，导致纤毛断裂和脱落，引起机体发病，并且会严重影响猪的生长发育和饲料转化率，或者破坏粘膜-纤毛屏障，容易继发其他致病菌的感染(特别是对青年猪)，提高致死率，因而给养猪业造成巨大的经济损失。目前猪支原体肺炎的主要防治措施是疫苗和药物，但由于缺乏有效的药物，且疫苗免疫后仅能减轻患猪临床症状的发生，降低死亡率，不能抵御机体对Mhp强毒的感染。因此，建立ー种敏感、稳定的检测方法对本病的检测和监控及流行病学调查具有重要的意义。目前，猪肺炎支原体的诊断技术主要有以下四种临床检查、细菌学检查、分子生物学检查和血清学检查。支原体体外培养比较复杂，Mhp的分离培养具有一定的难度，并且时间较长，容易漏检，不适合于临床应用。已有研究报道，通过PCR扩增特异性片段的方法来检测，具有较好的效果，但通过呼吸道采集样品，势必会对猪只造成不同程度的影响，且PCR法有一定的技术要求，仪器设备要求较高，价格昂贵，不易于在生产实际中推广应用。血清学检测则可避免以上缺点。国内外建立了多种血清学检测方法如免疫琼扩、间接血凝等，免疫琼扩、间接血凝试验虽操作简单，但存在敏感性不高的问题。ELISA方法操作简单，敏感性高，特异性好，可作为检测的有效手段，并可在基层得到广泛应用。目前，国内外均有相关研究报道，国外虽已研制成了 ELISA检测试剂盒，但检出率低，且价格较为昂贵。因此，建立一种适用的、特异性好的、稳定性高的Mhp ELISA检测手段是目前有效控制该病发生的关键。本病全球性分布，国外远领先于国内。Mhp与其他支原体之间存在严重的交叉反应，从而给Mhp的鉴别诊断带来了困难。目前，关于Mhp诊断方法，国内报道甚少，而国外研究较多。常用的ELISA方法，但由于交叉反应等影响，未能达到理想的效果。通过研究Mhp中特异性蛋白而建立诊断方法是目前研究的焦点。由于Mhp缺乏细胞壁，所以菌体的主要抗原物质存在于荚膜和细胞膜。荚膜中含有多种粘附蛋白和粘附相关蛋白等膜分子；细胞膜成分的2/3为蛋白质，分布于细胞膜的内外层，1/3为脂类，分布于细胞膜的中层。猪肺炎支原体的抗原组成成分主要是蛋白质与脂质两类。脂质包括糖脂和脂多糖，它们都是半抗原，与蛋白质结合后具有抗原性。国内外学者已对猪肺炎支原体多种抗原蛋白进行了研究，其中包括乳糖脱氢酶P36蛋白、膜蛋白P46、热休克蛋白DnaK以及黏附素蛋白P97。这些蛋白均特异性好，且分别是猪肺炎支原体感染早中晩期诱导产生抗体的蛋白之一，是已知抗原蛋白中用于检测用抗原较为理想的蛋白。体外表达蛋白经镍柱亲合层析纯化后作为抗原，建立间接ELISA检测方法，并优化ELISA的反应条件形成检测试剂盒，该试剂盒具有高特异性,高稳定性。试剂盒主要供实验室研究和临床诊断使用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，为实验室和临床检测猪肺炎支原体抗体提供快速、准确、简便的检测工具。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下ー种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，试剂盒中设有多重组抗原包被的ELISA板，酶结合物工作液，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，ニ抗稀释液，IOX浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和終止液；其中所述的多重组抗原为猪肺炎支原体蛋 白P36、猪肺炎支原体蛋白P46、猪肺炎支原体蛋白P97R1和猪肺炎支原体蛋白DnaK。其中，本发明所述的猪肺炎支原体蛋白P36、P46、P97R1和DnaK按如下方法获得I、猪肺炎支原体蛋白P36按专利ZL200910027160. 4的方法获得。 2、猪肺炎支原体蛋白P46按文献猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达，江苏农业学报，2008，24(3) : 288-292的方法获得。3、猪肺炎支原体蛋白P97R1按专利ZL200910027159. I的方法获得。4、猪肺炎支原体蛋白DnaK按文献猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立，金陵科技学院学报，2011，27 (4) : 79-84的方法获得。上述猪肺炎支原体蛋白P36和P97R1用分子筛层析发纯化后使用，猪肺炎支原体蛋白P46和DnaK经Ni柱纯化后使用。其中，所述的多重组抗原包被的ELISA板按如下方法制备得到使用pH9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将猪肺炎支原体蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作为抗原分别以O. 5-2 μ g/ml、5_10 μ g/ml、5_10 μ g/ml和5-10 μ g/ml的包被浓度等体积混合,进行包板，每个样孔100 μ L混合抗原，置湿盒，37°C孵育lh，4°c过夜，甩干包被液，用PBST洗涤3次，3-5min/次，加入封闭液10g/L酪蛋白PBST，200 μ I/孔，置湿盒，37°C孵育lh，甩干，加50g/L蔗糖水溶液37°C孵育Ih，甩干后抽空封装，置2-8°C保存。其中，所述的酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。按其使用说明的推荐稀释倍数进行验证试验，按试验结果进行矫正，酶标ニ抗直接加在ニ抗稀释液中，ニ抗稀释液为氯化钠 8. 0g, KH2PO4 O. 3g，Na2HPO4. 12H20 5. 33g，KC10. 2g 加 ddH20 至900ml，加入IOg酪蛋白充分溶解后，调整pH至7. 2-7. 4，加入O. 5mL Tween-20和O. 1-0. 5g硫柳汞，加ddH20定容至1000mL。其中，所述的阳性对照血清为猪肺炎支原体间接血凝和IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测为阳性的猪血清；所述的阴性对照血清为猪肺炎支原体间接血凝和IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测为阴性的猪血清。其中，所述的样品稀释液和ニ抗稀释液按如下方法制备得到氯化钠8.0g，KH2PO4O. 3g,Na2HPO4. 12H205. 33g,KC10. 2g加 ddH20至 900ml，加入 IOg酪蛋白后充分溶解后，调整 pH 至 7. 2-7. 4，加入 0. 5mL/L Tween-20 和 0. 1-0. 5g 硫柳汞，加 ddH20 定容至 IOOOmL0
其中，所述的IOX浓缩洗涤液为10XPBST，含有5mL/L Tween-20和O. 1-0. 5g/L硫柳汞的10 X PBS。其中，所述的显色液A按如下方法配制Na2HP0414. 6g，柠檬酸9. 33g，过氧化氢脲
O.52g，加ddH20至1000ml，调至pH5. O 5. 4 ;所述的显色液B按如下方法配制TMB200mg，无水こ醇100ml，加ddH20定容至1000ml。显色液A与B按如下方法配制工作液底物液A与B液I: I (V: V)混合使用，混匀。其中，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。有益效果本发明具有下列突出的优点I)高特异性因猪肺炎支原体与猪鼻支原体等具有免疫交叉，因此全菌特异性差，本发明使用的4个蛋白均为猪肺炎支原体的特异性蛋白，与猪鼻支原体等其他病原无交 叉，保证了 ELISA的高度特异性。2)高灵敏度猪肺炎支原体4个蛋白的组合提高了 ELISA的灵敏度，其灵敏度高于IDEXX的猪肺炎支原体抗体ELISA检测试剂盒和单蛋白的ELISA。3)简单快速仅需要移液器和酶标仪进行加样和读数，操作仅需约2. 5h。本发明的检测体系快速、方便、高特异性、高灵敏度地检测到猪肺炎支原体抗体，不需要复杂仪器，为兽医安全卫生的检测提供了新的手段，能较好的满足目前对猪场养殖现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。


图1P36蛋白检测不同免疫组。图2P46检测不同免疫组。图3P97R1检测不同免疫组。图4DnaK检测不同免疫组。图5多种抗原共同检测不同免疫组。图6IDEXX试剂盒检测不同免疫组。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、エ艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :ー种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，试剂盒中设有I、多重组抗原包被的ELISA板猪肺炎支原体蛋白P46和DnaK按文献猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达，江苏农业学报，2008，24(3) : 288-292和猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立，金陵科技学院学报，2011，27 (4) : 79-84的方法构建猪肺炎支原体P46和DnaK的表达菌，将菌接入到LB (Amp+/Kan+)液体培养基，震荡培养至OD值为O. 6-1. O时加入IPTG (终浓度为ImM)进行诱导表达5h。同时设未诱导的菌、诱导的空载体菌作为对照进行SDS-PAGE电泳。离心取上清液，用裂解缓冲液洗涤一次后，用裂解缓冲液悬浮。冻融数次后，超声波裂解置于冰浴中的样品，直至样品不再粘稠。超声时间不要太长，避免样品温度升高；若DNA没有被切断，细菌提取物就会粘稠并堵塞柱子，降低流速。14000g离心20min除去碎片，为防止堵塞树脂。采用Protino Ni-TED 2000 PackedColumns试剂盒进行亲和层析分离纯化目的蛋白，检测纯化效果。采用BCA方法检测蛋白浓度。采用不同浓度的重组抗原对ELISA酶标板进行包被，以确定最适包板的抗原浓度。猪肺炎支原体蛋白P36 和 P97R1 按专利 ZL200910027160.4 和 ZL 200910027159. I的方法获得。采用DEAE纤维素等分子筛层析分离纯化目的蛋白，检测纯化效果。采用BCA方法检测蛋白浓度。采用不同浓度的重组抗原对ELISA酶标板进行包被，以确定最适包板的抗原浓度。重组抗原的最适包板浓度，是将提纯后的重组抗原，通过10X、20X、40X、80X、160X和320倍稀释后分别包板，然后分别进行ELISA测定阴、阳性对照，用阴、阳性对照所測定的OD值得比值(P/N)和表达抗原稀释倍数划曲线图，选用曲线的拐点(P/N下降开始加 快)的稀释倍数的前一个稀释倍数作为重组抗原的最适包板浓度。所述的多重组抗原包被的ELISA板按如下方法制备得到使用pH9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将猪肺炎支原体蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作为抗原分别以O. 5-2 μ g/ml、5_10 μ g/ml、5_10 μ g/ml和5_10 μ g/ml的包被浓度等体积混合,进行包板，姆个样孔100 μ L混合抗原，置湿盒，37°C孵育lh，4°C过夜，甩干包被液，用PBST洗涤3次，3_5min/次。加入封闭液10g/L酪蛋白PBST，200y I/孔，置湿盒，37°C孵育lh，甩干，加50g/L蔗糖水溶液37°C孵育Ih，甩干后抽空封装，置2-8°C保存。2、酶结合物工作液所述的酶结合物工作液为市售商品化辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG。按其使用说明的推荐稀释倍数进行验证试验，按试验结果进行矫正。如推荐稀释倍数为10000-100000,则使用5000、10000、15000、20000和250000的工作浓度加入到ニ抗稀释液中，分别进行ELISA測定，测定阴、阳性对照血清，用明、阳性对照血清所測定的OD值得比值(P/N)和ニ抗稀释倍数划曲线图，选用曲线的拐点(P/N下降开始加快)的稀释倍数作为ニ抗的最适使用浓度。按照以下配方配制ニ抗稀释液氯化钠8. 0g, KH2PO4O. 3g,Na2PO4 · 12Η205· 33g，KC10. 2g，加ddH20至900mL,加入IOg酪蛋白充分溶解后，调整至7. 2-7. 4，加入O. 1-0. 5g硫柳汞，加入O. 5ml吐温20，加ddH20定容至IOOOmL03、阳性对照血清临床解剖后肺脏有明显的猪肺炎支原体病变的猪，取其血清，同时通过间接血凝和IDEXX的RLISA检测试剂盒检测为阳性，用样品稀释液进行40倍稀释即为标准阳性血清。4、阴性对照血清取临床通过间接血凝和IDEXX的ELISA检测试剂盒检测为阴性，同时作临床解剖后肺脏无任何猪肺炎支原体病变的猪，取其血清，用样品稀释液进行40倍稀释即为标准阴性血清。5、样品稀释液和ニ抗稀释液所述的样品稀释液和ニ抗稀释液按如下方法制备得到氯化钠8. 0g, KH2PO4O. 3g，Na2HPO4. 12H205. 33g，KC10. 2g加ddH20至900ml，加入IOg酪蛋白后充分溶解后，调整pH至7. 2-7. 4，加入 O. 5mL/L Tween-20 和 O. 1-0. 5g 硫柳汞，加 ddH20 定容至 IOOOmL06、10X浓缩洗涤液所述的IOX浓缩洗涤液为10XPBST (即含有5mL/L Tween-20和O. 1-0. 5g/L硫柳汞的10 X PBS )。7、显色液 A :所述的显色液A按如下方法配制Na2HP0414. 6g，柠檬酸9. 33g，过氧化氢脲O. 52g，加 ddH20 至 1000ml，调至 ρΗ5· O 5. 4 ;8、显色液 B:
所述的显色液B按如下方法配制TMB200mg,无水こ醇100ml,加ddH20定容至IOOOml。显色液A与B按如下方法配制工作液底物液A与B液I: I (V: V)混合使用，混匀。9、终止液；所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。实施例2 I试剂盒检测操作程序实验前的准备将10 X洗涤液加入ddH20稀释成洗涤工作液(IX)。将待检样品用稀释液进行40倍稀释。( I)在重组抗原包被板上分別设定两个阳性对照和阴性对照孔，并加入相应的对照血清样品(已稀释)，每孔100 μ L ; (2)将待检样品加入检测样孔中，100 u L甸孔，直室温60min ；(3)甩去各样孔中的液体，用IX洗涤液，每孔300 μ L，洗涤3-5次，甩干；(4)加入酶标ニ抗工作液，100 μ L每孔，室温30min后重复步骤3 ；(5)加入显色工作液100 μ L，室温避光显色IOmin ；(6)向姆个样孔加入终止液50 μ L终止显色,在450nm下测定其OD45tl值。2结果判断公式S/P=(样品OD45tl值-阴性对照OD450值)/ (阳性对照OD450值-阴性对照OD450值)当阳性对照OD45tl/阴性对照OD450彡3. O时试验成立，血清样品S/P彡O. 4，则判为阳性，S/P ( O. 3判为阴性，介于二者之间为可疑。实施例3 I血清样品猪鼻支原体阳性血清、猪絮状支原体阳性血清、猪圆环病毒阳性血清、副猪嗜血杆菌4型阳性血清、副猪嗜血杆菌5型阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清、猪肺炎支原体阴性血清。2检测方法按照实施例I和2进行P36、P46、P97、DnaK混合蛋白包被试剂盒的制备和检测。3 结果用猪鼻支原体阳性血清、猪絮状支原体阳性血清、猪圆环病毒阳性血清、副猪嗜血杆菌4型阳性血清、副猪嗜血杆菌5型阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清、猪肺炎支原体阴性血清对本发明的试剂盒的特异性进行检测结果见表I。表I猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒
权利要求
1.一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中设有多重组抗原包被的ELISA板，酶结合物工作液，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，二抗稀释液，IOX浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液；其中所述的多重组抗原为猪肺炎支原体蛋白P36、猪肺炎支原体蛋白P46、猪肺炎支原体蛋白P97R1和猪肺炎支原体蛋白DnaK。
2.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的多重组抗原包被的ELISA板按如下方法制备得到使用pH9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将猪肺炎支原体蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作为抗原分别以O. 5-2 μ g/ml,5-10 μ g/ml>5-10 μ g/ml和5_10 μ g/ml的包被浓度等体积混合,进行包板,每个样孔100 μ L混合抗原，置湿盒，37°C孵育Ih，4°C过夜，甩干包被液，用PBST洗涤3次， 3_5min/次，加入封闭液10g/L酪蛋白PBS，200l·! I/孔，置湿盒，37°C孵育lh，甩干，加50g/L蔗糖水溶液37°C孵育lh，甩干后抽空封装，置2-8°C保存。
3.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。
4.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照血清为猪肺炎支原体间接血凝和IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测为阳性的猪血清；所述的阴性对照血清为猪肺炎支原体间接血凝和IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测为阴性的猪血清。
5.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液和二抗稀释液均按如下方法制备得到氯化钠8. 0g, KH2PO4 O. 3g，Na2HPO4. 12H20 5. 33g，KCl O. 2g加ddH20至900ml，加入IOg酪蛋白后充分溶解后，调整pH至 7. 2-7. 4，加入 O. 5mL Tween-20 和 O. 1-0. 5g 硫柳汞，加 ddH20 定容至 IOOOmL0
6.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的IOX浓缩洗涤液为10XPBST，即含有5mL/L Tween-20和O. 1-0. 5g/L硫柳汞的IOXPBSo
7.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的显色液A按如下方法配制Na2HP04 14. 6g,朽1檬酸9. 33g,过氧化氢脲O. 52g,加ddH20至1000ml,调至pH5. O 5. 4 ;所述的显色液B按如下方法配制TMB200mg,无水乙醇100ml,加ddH20定容至IOOOml ;显色液A与B按如下方法配制工作液底物液A与B液I: I (V: V)混合使用，混匀。
8.根据权利要求I所述的猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
全文摘要
本发明属于卫生检验领域，公开了一种猪肺炎支原体多重组抗原ELISA检测试剂盒，试剂盒中设有多重组抗原包被的ELISA板，酶结合物工作液，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，二抗稀释液，10×浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液；其中所述的多重组抗原为猪肺炎支原体蛋白P36、猪肺炎支原体蛋白P46、猪肺炎支原体蛋白P97R1和猪肺炎支原体蛋白DnaK。经检测验证，本发明试剂盒特异性强、敏感性高、具有良好的重复性和可操作性，可应用于猪肺炎支原体抗体的实验室研究和临床检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
文档编号G01N33/68GK102735851SQ201210244908
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者冯志新, 刘茂军, 杜改梅, 熊祺琰, 白方方, 邵国青, 韦艳娜 申请人:江苏省农业科学院