专利名称：抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法 及其用途。
背景技术：
磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总 称，具有广谱抗菌活性，能抑制大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及原生动物，被广泛地 应用于人和动物细菌性疾病的治疗和预防。在预防动物疾病的同时，SAs还可提高饲料转 化率，促进动物生长，被用作动物饲料添加剂。与此同时SAs具有性质稳定、价格低廉、使用 方便等特点，而广泛地应用于兽药临床、动物饲料添加剂、水产养殖等领域。SAs经各种途径进入动物体内后，可转移到肉、蛋、乳等动物性食品中，如不合理使 用易在动物性食品中残留，对人类的健康产生潜在的危险，如细菌耐药性的增加、对机体产 生毒害作用甚至引发癌变，并适成生态环境污染。近年来随着磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)在临床上的大量广泛使用，其残留 问题也越来越严重。在国内外用于SAs药物残留检测的方法较多，有微生物法、免疫分析测 定法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、液相色谱_质谱_质谱法、薄层色谱法、荧光分 光光度法等。免疫分析测定法适用于大规模检测和筛选。ELISA方法灵敏度较高，特异性较 强，测定方法简单快速，可同时筛选大量样品。目前常将ELISA法作为筛选法，高效液相色 谱_质谱法作为确证方法配套使用。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔子相比于小鼠能识 别更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛 选融合细胞成为可能。本发明通过杂交瘤技术得到抗磺胺大类兔单克隆抗体。

发明内容
本发明的目的是提供一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法的步骤如下1)将IOmg磺胺甲恶唑加入到2ml的lmol/L HCL中，70°C加热溶解，冰浴冷却后， 滴加到0. 4ml的0. 2moVLNaNO2,反应30min，得到重氮化的磺胺甲恶唑；将25mg牛血清白 蛋白溶解于2ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，重氮化的磺胺甲 恶唑滴加到预冷后的牛血清白蛋白溶液中，用2mol/L NaOH调节pH值至9.0，4°C磁力搅拌 6h，用磷酸盐缓冲液4°C搅拌下透析，得到磺胺甲恶唑免疫抗原，-20°C存放；2)将磺胺嘧啶40mg溶解于IM的NaOH中，加入Iml的1 % NaNO2,得到磺胺嘧啶溶 液，冰水浴，磁力搅拌下，将磺胺嘧啶溶液滴加到2. 4mL的lmol/L HCL中，反应lOmin，得到 重氮化的磺胺嘧啶；将IOOmg的牛血清白蛋白，溶解于8mL，0. 05mol/L碳酸盐缓冲液中，得 到牛血清白蛋白溶液，将重氮化的磺胺嘧啶滴加到牛血清白蛋白溶液中，用NaOH调节pH值 到9. 5，4°C磁力搅拌6h，用磷酸盐缓冲液4°C搅拌下透析，得到磺胺嘧啶免疫抗原，_20°C存放；3)将磺胺甲恶唑免疫抗原和磺胺嘧啶免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔 子，免疫前取血2ml，第一次免疫将两种免疫抗原各0. 5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行 免疫，第二次至第五次免疫将两种免疫抗原各0. 25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行 免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4-8周内，将两种免疫抗原各0. 5mg 混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；4)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为在培养皿中去除脾脏周 围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640 培养液悬浮后离心，1400rpm, 5min ；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少 量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2X108个脾淋巴细胞 的悬液备用；5)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传 代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融 合，融合剂为50%的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；6)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细 胞培养板中，置37°C、6% CO2培养箱内培养，2-3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA 法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间 接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细 胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3 块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳 性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分 泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一 份用于扩大培养生产磺胺类兔单克隆抗体；所述的将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为分别取2X IO8个脾淋巴 细胞和IX IO8个240E细胞混勻，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混勻成糊 状，37°C水浴预温，缓缓加入经37°C预温的50%聚乙二醇溶液，再加入经37°C预温的1640 培养液，使聚乙二醇稀释而失去作用。补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉 淀悬浮于HAT培养液中；所述的磺胺嘧啶的分子结构式为所述的磺胺甲恶唑的分子结构式为
权利要求
一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下1)将10mg磺胺甲恶唑加入到2ml的1mol/L HCL中，70℃加热溶解，冰浴冷却后，滴加到0.4ml的0.2mol/L NaNO2，反应30min，得到重氮化的磺胺甲恶唑；将25mg牛血清白蛋白溶解于2ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，重氮化的磺胺甲恶唑滴加到预冷后的牛血清白蛋白溶液中，用2mol/L NaOH调节pH值至9.0，4℃磁力搅拌6h，用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析，得到磺胺甲恶唑免疫抗原， 20℃存放；2)将磺胺嘧啶40mg溶解于1M的NaOH中，加入1ml的1％NaNO2，得到磺胺嘧啶溶液，冰水浴，磁力搅拌下，将磺胺嘧啶溶液滴加到2.4mL的1mol/L HCL中，反应10min，得到重氮化的磺胺嘧啶；将100mg的牛血清白蛋白，溶解于8mL，0.05mol/L碳酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将重氮化的磺胺嘧啶滴加到牛血清白蛋白溶液中，用NaOH调节pH值到9.5，4℃磁力搅拌6h，用磷酸盐缓冲液4℃搅拌下透析，得到磺胺嘧啶免疫抗原， 20℃存放；3)将磺胺甲恶唑免疫抗原和磺胺嘧啶免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将两种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将两种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4 8周内，将两种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；4)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；5)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；6)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2 3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产磺胺类兔单克隆抗体；
2.根据权利要求1所述的一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的 将免疫兔子的脾脏细胞与240E细胞融合步骤为分别取2X IO8个脾淋巴细胞和1 X IO8个 240E细胞混勻，加1640培养液后离心，弃上清，使两种细胞充分混勻成糊状，37°C水浴预 温，缓缓加入经37°C预温的50%聚乙二醇溶液，再加入经37°C预温的1640培养液，使聚乙 二醇稀释而失去作用，补加1640培养液后离心，弃上清，将融合后的细胞沉淀悬浮于HAT培 养液中；
3.根据权利要求1所述的一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的 磺胺嘧啶的分子结构式为确胺_鲅
4.根据权利要求1所述的一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的 磺胺甲恶唑的分子结构式为
5.一种如权利要求1所述的抗磺胺类兔单克隆抗体的用途，其特征在于用于制备检 测磺胺类药物多残留的ELISA检测试剂盒；
6.一种如权利要求1所述的抗磺胺类兔单克隆抗体的用途，其特征在于用于制备检 测磺胺类药物多残留的胶体金检测试剂盒；
7.—种如权利要求1所述的抗磺胺类兔单克隆抗体的用途，其特征在于用于检测食 品、饲料及环境样品中的磺胺类药物的残留；
8.根据权利要求5、6或7所述的一种抗磺胺类兔单克隆抗体的用途，其特征在于所述 的磺胺类药物为磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶或磺胺吡啶。
全文摘要
本发明公开了一种抗磺胺类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。本发明选取磺胺嘧啶与磺胺甲恶唑两种磺胺药物，分别与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，混和两种免疫抗原，采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗磺胺类兔单克隆抗体。本发明制备的抗体为兔单克隆抗体，兔单克隆的制备优于鼠单克隆抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明生产的抗磺胺类兔单克隆抗体对磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶和磺胺吡啶有很好的检测效果，具有一定的广谱性。可用于食品、饲料及环境样品中磺胺类药物的残留检测。
文档编号G01N33/577GK101983972SQ20101051418
公开日2011年3月9日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者倪庚, 刘娜, 郑晓冬, 陆蕾 申请人:浙江大学