专利名称：利用质谱分析选择施用治疗剂的癌症患者的制作方法
技术领域：
本发明涉及预测癌症患者是否可能受益于或可能不受益于施用某些类型和种类的药物和/或其组合的方法和系统。所述方法和系统涉及使用从所述患者的基于血的样本获得的质谱数据和经配置作为在所述质谱数据上操作的分类器的计算机。
背景技术：
本发明的受让人Biodesix公司已经研发出了一种称为VeriStrat的测试法,该测 试法预测非小细胞肺癌(NSCLC)患者是否可能受益于或可能不受益于表皮生长因子受体(EGFR)途径靶向药物的治疗。该测试方法描述在美国专利7，736，905中，该专利的内容通过引用并入本文。该测试法还描述在Taguchi F. et al. I中，该文献的内容也通过引用并入本文。所述测试法的其他应用还描述在美国专利7，858，390,7, 858，389和7，867，775中，其内容通过引用并入本文。简言之，VeriStrat测试法基于癌症患者的血清和/或血浆样本。通过MALDI-T0F质谱和在计算机中执行的数据分析运算的结合，该测试法对在预定m/z范围的八个积分峰强度的组与来自训练群组(training cohort)的进行比较,从而针对患者样本产生分类标签VeriStrat “好”、VeriStrat “差”或VeriStrat “不定”。在多个临床验证研究中表明，在使用表皮生长因子受体抑制性药物治疗时，预处理血清/血浆为VeriStrat “好”的患者的结果显著好于样本导致VeriStrat “差”标记的患者。在少数情况下(少于2%)，不能作出判断，从而导致VeriStrat “不定”标签。VeriStrat可以从本发明的受让人Biodesix公司商购，并用于非小细胞肺癌患者的治疗选择。多数现代基于生物标记物的测试法对肿瘤类型和组织学、具体的干预治疗和临床病理因素都是非常特异的。例如，基于肿瘤组织的基因测试，如用于EGFR结构域中的突变、KRAS突变和通过荧光原位杂交(FISH)的基因拷贝数分析的测试，似乎仅在非常特异的病症下有作用。虽然EGFR突变可产生腺癌第一系NSCLC中针对吉非替尼响应的指征，但由于这些突变在该类型的NSCLC中的极度罕见，其对鳞状细胞癌并不显示类似的用途。KRAS突变可与结直肠癌中的西妥昔单抗(cetuximab)响应相关联,但企图将其运用在NSCLC中却并不成功。没有有益于头颈鳞状细胞癌(SCCHN)的EGFR-抑制剂(EGFRI)的已知标记物。这些基因测试法的局限性可能与其集中于非常特异的突变有关，而这些突变仅为复杂的致癌机制的小部分。而且，所有这些测试都基于一种还原论观点，即将肿瘤生物学还原至仅为肿瘤细胞，并忽视了肿瘤细胞与由血管支持系统的内皮细胞、细胞外基质和参与与癌症有关的慢性炎症机制的免疫系统组分(例如炎症细胞和各种趋化因子和细胞因子)组成的肿瘤微环境之间重要的相互作用。

发明内容
本发明提供了发明人对于肿瘤细胞中的何种途径与VeriStrat “差”上皮肿瘤的显著特征有关的理解与证据。本发明提供的所述理解的证据基于多个方面，包括临床证据、现象学证据(phenomenological evidence)、文献分析和基于来自癌症患者的血清样本的质谱分析的分子证据。本发明描述的认知的实现可以采用新方法(例如实际测试法)的形式，所述新方法用于预测癌症患者是否可能受益于或可能不受益于某种类型的药物或其组合，这将在下文详述。简言之，对于鉴定为VeriStrat “差”的患者，VeriStrat测试法测定了自生长和存活因子受体(如EGFR)下游的一个或多个途径的活化，可能的候选途径包括经典和非经典MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)、Akt以及PKC(蛋白激酶C)调节的反应(参见图2)。化疗和安慰剂对照的结果的变化表明，这些途径的自身活化可能会导致较差的预后，并可表明NF-k B(活化B细胞的核因子K轻链增强子)的参与，NF-k B是重要的转录因子，调节细胞应答并在炎症和免疫应答以及细胞增殖与存活的调节中起重要作用。还已知其与对化疗的响应相关。 一般地，VeriStrat测试识别具有较差预后的亚群，并预测实体上皮瘤癌症患者对使用治疗剂或治疗剂的组合的治疗的不同收益，所述治疗剂靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC的受体的激动剂、受体或蛋白。此类药剂的实例有EGFR抑制剂。经预测可能受益于抗EGFR药剂的患者以VeriStrat“好”标签标识；相反，经预测可能不受益于抗EGFR药剂的患者以VeriStrat“差”标签标识。本文使用的术语MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)是至少三个相关级联(cascade)的代称，而不是指单个酶(参见图2)。因此，对于VeriStrat “差”标签的患者而言，VeriStrat测试是将“差”患者诊断为具有不良预后的癌症患者亚群的诊断。事实上，VeriStrat “差”患者可以被认为具有不同于VeriStrat “好”患者的疾病状态。另外，具有VeriStrat “好”标签的癌症患者更可能从使用靶向参与MAPK途径的受体的激动剂、受体或蛋白的治疗剂或治疗剂的组合中获得更多的受益；而具有VeriStrat “差”标签的患者则可能不从此类治疗剂中获得临床上的受益。另一方面，VeriStrat “差”患者可能从阻止这些途径的下游的、独立于所述受体的活化的治疗或联合治疗中获益。如所附的权利要求所示，这种理解的实际应用可以采取几种形式。所述方法包括获得癌症患者的基于血的样本的质谱数据，以及使用作为分类器发挥功能的程序式计算机分析所述谱。作为一种形式，本发明公开了鉴定实体上皮瘤癌症患者可能受益于使用治疗剂或治疗剂的组合的治疗，或者可能不受益于所述治疗剂或治疗剂的组合的治疗的方法，其中所述治疗剂靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC (蛋白激酶C)途径或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC途径的受体的拮抗剂、受体或蛋白，所述方法包括以下步骤a)获得实体上皮瘤癌症患者的基于血的样本的质谱；b)对步骤a)获得的质谱进行一个或多个预定的预处理步骤；c)在进行了步骤b)对质谱的预处理步骤后，在所述谱中于一个或多个预定的m/z范围获得所选特征的积分强度值；和d)将步骤c)获得的数值用在分类算法中，所述分类算法使用了包括由其他实体瘤患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，以鉴别所述患者可能受益于或可能不受益于利用所述治疗剂或治疗剂的组合的治疗。在另一实施方式中，描述了用于预测癌症患者是否可能受益于C0X2抑制剂和EGFR抑制剂的联合给药的方法，所述方法包括以下步骤a)获得癌症患者的基于血的样本的质谱；b)对步骤a)获得的质谱进行一个或多个预定的预处理步骤；c)在进行了步骤b)对质谱的预处理步骤后，在所述谱中于一个或多个预定的m/z范围获得所选特征的积分强度值；和d)将步骤c)获得的数值用在分类算法中，所述分类算法使用了包括由其他实体 上皮瘤患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，以鉴别所述患者可能受益于或可能不受益于C0X2抑制剂和EGFR抑制剂的联合给药的治疗。


图I是表示对患者基于血的样本进行VeriStrat测试的步骤的流程图；图2是人细胞中所选信号转导途径的示意图；图3是血清淀粉样蛋白A(SAA)同种型的所选生物活性及其在癌症发展和治疗抗性中的可能作用的示意图；图4是EGFR信号转导途径、其相互作用和SAA活化的可能点的示意图；图5是包括EGFR及其抑制剂的ErbB家族生长因子受体的示意图，出自Yarden Y，Shilo BZ. SnapShot:EGFR signaling pathway. Cell 2007;131:1018 ；图6是所公开的所有VeriStrat分析的治疗组的VeriStrat好患者和VeriStrat差患者之间的危险比(hazard ratio)的森林图；图I是接受不同化疗治疗的患者的整体存活率(OS)与所述患者的VeriStrat标签(“好”和“差”)的Kaplan-Meier图的示意图；图8是在不同浓度吉非替尼存在下吉非替尼敏感细胞系HCC4006和吉非替尼抗性细胞系A549在VeriStrat “差”和VeriStrat “好”血清中的生长曲线。发明详述定义除非本发明的内容中另有明确的说明，否则本发明使用的单数形式“a”、“an”和“ the ”包括复数个指示物。本发明使用的术语“实体上皮瘤”包括但并不必然限于NSCLC、SCCHN、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、黑色素瘤和结直肠癌(CRC)。本发明中使用的术语“靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC的受体的拮抗剂、受体或蛋白的治疗剂或治疗剂的组合”包括但不限于靶向erbB受体家族(包括EGFR(HERl)、HER2、HER3和HER4)，VEGF受体(VEGFR2)，肝细胞生长因子受体(HGFR或MET)，G-蛋白偶联受体，胰岛素样生长因子(IGF)受体，VEGF，诸如TGFa和EGF的生长因子，和自Akt或ERK/JNK/p38MAPK上游或在Akt或ERK/JNK/p38MAPK处或PKC途径的任何其他蛋白的一种或多种治疗剂。此外，本发明使用的术语“靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC途径或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC途径的受体的激动剂、受体或蛋白的治疗剂或治疗剂的组合”包括已知的治疗剂，以及靶向还没有被发现或被公开的这些蛋白的治疗剂。而且，所述的治疗剂的组合包括治疗剂的任意组合，而无论其是否已经用在实体上皮瘤的联合治疗中。应当指出，即便一种药剂被鉴定为特定蛋白或途径的抑制剂，这样的分类并不意在代表对其作用机制的说明，这是因为这些药剂中的很多的作用机制并没有完全弄清。例如但并非旨在穷举，这些治疗剂包括(I)TKI(酪氨酸激酶抑制剂)目前市场上的和处于I-III期临床试验的被归类为小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的药物有很多。TKI可靶向诸如表皮生长因子受体(EGFR)的特异分子受体，也可靶向多个受体(被称为“多重激酶抑制剂”)。这些药物包括但不限于厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、伊马替尼(imatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、拉帕替尼(Iapatinib)。基于抗体的抑制剂包括西妥昔单抗(Cetuximab, anti-EGFR)、潘尼单抗 (Panitumumab, anti-EGFR)和曲妥单抗(Trastuzumab, anti-Her2)。(2) HGFR或MET抑制剂目前处于I-III期临床试验的抑制MET或P13K (自MET下游的信号转导酶)的药物有很多，这些药物正处于不同程度的研究中但目前没有应用于临床。例如，XL880是MET和VEGFR2的潜在抑制剂。本发明使用的术语“MET抑制剂”包括，但不限于AMG 208、AMG102、ARQ 197、AV_299、MetMab、GSK 1363089 (XL880)、EMD 1214063、EMD 1204831、MGCD265、Crizotanib(PF-02341066)、PF-04217903、MP470。(3) C0X2抑制剂本发明使用的术语“C0X2抑制剂”包括，但不限于选择性C0X2抑制剂塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)和罗美昔布(Iumiracoxib)。(4)抑制COXl与C0X2两者的其他非甾体类消炎药(NSAID)，例如布洛芬(ibuprofen),阿司匹林(aspirin)、卩引哚美辛(indomethacin)和舒林酸(sulindac)。已证明此类药物也抑制NF- K B活化。(5)其他NF- K B抑制剂。本发明使用的术语“NF_ k B抑制剂”包括，但不限于三氧化二砷(ATO)、萨立多胺(thalidomide)及其类似物、白藜芦醇(resveratrol)。此外,还认为C0X2抑制剂也对NF-k B途径有抑制作用。因此，诸如布洛芬、阿司匹林、吲哚美辛和舒林酸的NSAID也显示抑制NF- K B活化，并因此被视为NF- k B抑制剂。本发明使用的术语“VEGF抑制剂”包括，但不限于贝伐单抗(Bevacizumab)、西地尼布(Cedaranib),阿西替尼(Axitinib)、莫替沙尼(Motesanib)、BIBF 1120、拉木西单抗(Ramucirumab)、VEGF Trap、Linifanib (ABT869)，Tivozanib、BMS 690514、XL880、舒尼替尼、索拉非尼、Brivanib、XL-184、帕唑帕尼。本发明使用的术语“靶向治疗”是指使用诸如特定酶的单克隆抗体或小分子抑制剂的药物或其他物质，用以识别和攻击诸如受体的特定分子的一类治疗。这样的实例有EGFR-TKI (厄洛替尼、吉非替尼)、西妥昔单抗、贝伐单抗等。本发明使用的术语“非靶向化疗”或“化疗”是指通过干扰DNA(例如，诸如顺钼(cisplatin)、卡钼(carboplatin)、奥沙利钼(oxaliplatin)的烧化剂,诸如5_氟尿卩密唳或培美曲塞(pemetrexed)的抗代谢物,或诸如依立替康(irinotecan)的拓扑异构酶抑制齐Li )或通过干扰细胞分裂(诸如长春瑞滨(vinorelbine)、多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel))来干扰细胞迅速分裂的治疗。本发明使用的术语“预后”是指在缺少治疗或应用标准治疗下与临床结果相关的因子或测定，其可以被认为是疾病自然史的测定。术语“预测”是与受益或不能受益于特定治 疗相关的因子或测定。一个预测因子表明一种依赖于预测标志的治疗的不同受益2。本发明使用的术语“疾病状况”是指可以通过不同预后和/或对治疗和/或特定分子和/或代谢特征的不同响应而表征的诊断病况的具体亚类。讨论本发明人已发现，由于VeriStrat测试是基于由血清样本的质谱数据获得的标记，因此其能够对目前基于生物标记物的大多数测试法都不能测定的与癌症相关的一般因子进行测定。该事实促成了利用VeriStrat测试法进行治疗选择的新的实际应用，这将在下文进行讨论。特别地，所述VeriStrat测试导致了鉴定为VeriStrat “好”的患者与鉴定为VeriStrat “差”的患者之间生存曲线的类似分离，而无论EGFR抑制的作用机制如何。在本发明人之前的工作中，VeriStrat测试使用了用小分子EGFR-酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Iressa)和厄洛替尼(Tarceva)治疗的患者样本组，所述抑制剂通过阻断酶的ATP-结合位点而抑制所述受体、对于另一种在NSCLC和结肠直肠癌(CRC)中均靶向EGFR的治疗剂西妥昔单抗(Erbitux)3，发明人观测到在鉴定为VeriStrat “好”的患者与鉴定为VeriStrat “差”的患者之间的类似分离。西妥昔单抗是直接阻断EGF受体的抗体。此外，VeriStrat测试跨临床病理特征(across clinico-pathologicalcharacteristics)地显示在鉴定为VeriStrat “好”的患者与鉴定为VeriStrat “差”的患者之间的类似分离。例如，VeriStrat测试可以应用于胰腺癌患者，也可以用于鳞状细胞癌患者。而且,VeriStrat测试在多种实体上皮瘤中均显示在鉴定为VeriStrat“好”的患者与鉴定为VeriStrat“差”的患者之间的分离。本发明人在NSCLC、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)与CRC中均观测到该结果3。此外，本发明人发现，通过使用非靶向化疗治疗的住院病人的VeriStrat测试分类的生存曲线分离根据群体、干预类型和肿瘤类型而变化。在某些非靶向化疗治疗的组中有分离的证据，而在其他组则没有分离。在安慰剂组(即无干预组)中也观察到强分离，这表明VeriStrat测试具有预后部分。图6的森林图汇总了对目前公开的或出现的VeriStrat测试的全部分析的数据。该数据显示，对于所研究的每个治疗组，VeriStrat “好”与VeriStrat “差”的患者之间的整体存活率的危险比(HR)。可以看出数据根据治疗类型而分组。获得的危险比的范围表明，VeriStrat的确表示作为特定类型治疗的结果的较好或较差结果，并因此具有预测效力。在图6中，B为贝伐单抗，C为西妥昔单抗，CT为化疗，E为厄洛替尼，G为吉非替尼的治疗。文献或简报为[1].D. Carbone，《第二届欧洲肺癌会议》，2010年4月；[2]Biodesix的数据档案，更新自F. Taguchi等，《J Natl CancerInst)), 2007 年 6 月 6 日，99(11) :838-8461 ；C. Chung et al. , Cancer EpidemiolBiomarkers Prev. 2010Feb ; 19 (2) : 358-653, [4] D. Carbone et al. , Lung Cancer2010Sept;69 (3):337-3404 o对非靶向化疗治疗群的再分析表明，虽然在用紫杉烷(taxanes)治疗的亚群中没有观察到明显分离，但在使用不含紫衫烷的化疗方案治疗的VeriStrat “好”与VeriStrat “差”之间存在分离(参见图7)。一种测试方法具有如此广泛的应用范围是非常罕见的。总之，以下结论来自上述讨论以及图6和7 :I. VeriStrat测试显示，对于EGFR抑制剂(EGFRI)单治疗，在VeriStrat好与VeriStrat差亚组之间约.45的危险比的分离，-不依赖于EGFRI作用机制，例如，对于小分子TKI(厄洛替尼、吉非替尼)和基于 EGFRI的抗体(受体)抑制剂，如西妥昔单抗。-不依赖于组织学类型，例如腺癌和鳞状细胞癌，和-不依赖于器官，例如NSCLC、SCCHN和CRC。2.没有观察到与其他群体特征的显著关联-不与遗传标记物，例如EGFR突变状态或KRAS状态；-不与诸如性别和种族的群体的特征。3. VeriStrat具有显示为在没有治疗时VeriStrat差与VeriStrat好亚组之间的分离的强预后部分。-但是，在VeriStrat“差”亚组中没有EGFRI单治疗的可测治疗受益，即在VeriStrat差亚组中使用厄洛替尼的治疗与用安慰剂的治疗基本相当；而在VeriStrat “好”亚组中有可测的EGFRI治疗受益。-联合治疗的效果取决于特定的药物组合及其对互相作用的途径的影响。所有这些事实和仅在VeriStrat“差”组中的样本质谱中观察到特异峰的观察结果一起得出以下结论VeriStrat在实体上皮瘤中界定了具有临床意义(较差的结果)的新的疾病状态。所观察到的现象可以对VeriStrat “差”肿瘤的分子状态进行初步推论由于EGFRI对这类患者没有效，并且由于TKI和基于抗体的治疗的效果相同，在VeriStrat “差”受试者中在所述受体和酪氨酸激酶结构域以下的通路可能与VeriStrat “好”受试者的不同，即其被上调。由于本发明人没有观察到与KRAS突变状态的关联，本发明人进而得出结论受影响的途径在RAS以下。基于上述观察结果、文献分析与其他证据，本发明人在此提供了关于何种肿瘤细胞的途径参与VeriStrat “差”上皮肿瘤的独特特征的理解。简言之，本发明人认为，在鉴定为VeriStrat “差”的患者中，VeriStrat测定法测量了自EGF的受体下游的一个或多个途径的活化；可能的候选途径包括典型和非典型的MAPK、PI3K/AKty以及由PKC调节的反应(参见图2的200A和200B)。化疗和安慰剂对照的结果的变化表明，这些途径的自身活化可能会导致较差的预后，并可表明NF-k B转录因子的参与，NF-K B为一种重要的细胞存活调节因子，在炎症过程和癌症进程中起重要作用并与化疗响应有关。一般地，VeriStrat测试鉴别出具有较差预后的亚群(Veristrat “差”)，并将预测实体上皮瘤癌症患者从使用治疗剂或治疗剂的组合的受益，所述治疗剂靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK JNK/p38或PKC上游的PKC (蛋白激酶C)或在Akt或ERK JNK/p38或PKC处的PKC的受体的激动剂、受体或蛋白。此类药剂的实例有EGFR抑制剂。将预测可能受益
于抗-EGFR药剂的患者以VeriStrat “好”标签鉴别；相反，将预测可能不受益于抗-EGFR
药剂的患者以VeriStrat “差”标签鉴别。具有VeriStrat “差”标签的患者可能不从用靶
向活化MAPK途径的受体的所述治疗剂的治疗获得临床受益；另一方面，VeriStrat “差”患
者可能从阻止这些途径的下游的、独立于所述受体的活化的治疗或联合治疗中获得临床受.、
Mo术语MAPK(有丝分裂原激活蛋白激酶)在本文用于指至少三个相关级联，而不是单个酶(参见图2)。
因此，对于VeriStrat “差”标签的患者，VeriStrat测试是将“差”患者诊断为具有差预后的癌症患者亚组的诊断。所述认知的实现可以采用新方法(例如实际测试法)的形式，所述新方法用于预测癌症患者是否可能受益于或可能不受益于某种类型的药物。在一个实际应用中，本发明可被认为是鉴定实体上皮瘤癌症患者可能受益于使用治疗剂或治疗剂的组合的治疗，或者可能不受益于所述治疗剂或治疗剂的组合的治疗的方法，其中所述治疗剂靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC的受体的拮抗剂、受体或蛋白，所述方法包括以下步骤a)获得实体上皮瘤癌症患者的基于血的样本的质谱；b)对步骤a)获得的质谱进行一个或多个预定的预处理步骤(例如背景减除、噪声估计、标准化和质谱比对)；c)在进行了步骤b)对质谱的预处理步骤后，在所述谱中于一个或多个预定的m/z范围(且优选下文描述的与下表I列出的m/z峰对应的m/z范围)获得所选特征的积分强度值；和d)将步骤c)获得的数值用在分类算法(例如k_最近邻法)中，所述分类算法使用了包括由其他实体瘤患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，以鉴别所述患者可能受益于或可能不受益于利用所述治疗剂或所述治疗剂的组合的治疗。作为克服VeriStrat “差”患者对靶向疗法的抗性的一个具体实例，将诸如塞来昔布或罗非昔布的C0X2抑制剂加入至EGFR-I中的治疗方案可以克服具有VeriStrat“差”标记的患者对EGFR-I的抗性。因此，VeriStrat测试可用于作为包含C0X2抑制剂和EGFR-I的联合治疗的处方的指标。作为另一个具体实例,认为所述VeriStrat “差”标记与NF_k B的特定活化作用相关，因此所述测试可以用于选择最受益于NF-K B抑制剂的患者，并因此减少了不必要的治疗和相关的发病。作为另一个具体实例，认为VeriStrat “差”标记与在临床上少受益于特定的非靶向化疗相关，具体地，所述药剂干扰DNA复制和基因表达，其为例如顺钼、吉西他滨(gemcitabine)或培美曲塞(pemetrexed),这可能是因为NF_k B因子参与该过程。对于分类为VeriStrat “差”的患者，加入I)阻止MAPK途径的下游的、独立于所述受体的活化的药剂，如C0X2抑制剂；或2)将炎症性宿主反应减少至最低的药剂，或加入阻止串话(cross-talk)途径活化的其他靶向药剂，可以克服对所述靶向药剂的抗性。VeriStrat 测试
根据本发明公开的内容对实体上皮瘤癌症患者基于血的样本进行测试以选择出使用特定治疗剂或治疗剂的组合(例如靶向参与MAPK途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC途径或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC途径的受体的拮抗剂、受体或蛋白的药剂)治疗的患者的方法，以流程图的形式作为方法100例示在图I中。在步骤102中，从患者获得了血清或血浆样本。在一个实施方式中，将所述血清样本分为三等份(三个试样)，对每份样本独立地进行质谱分析和接下来的步骤104、106 (包括分步骤108、110和112)、114、116和118。所述试样的数量可以变化，如可以有4、5或10个试样，而每个试样都进行下面的处理步骤。在步骤104中，将所述样本(试样)进行质谱。优选的质谱方法为基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱法，但也可以使用其他方法。如本领域公知的,质谱产生代表在多个质量/电荷(m/z)值的强度值的数据点。在一个实施方式中，解冻样本并在1500rpm下于4°C离心5分钟。然后，使用MilliQ水以1:10或1:5稀释血清样本。将稀释的样本以一式三份的方式点样在MALDI平板上三个随机分布的位置(即在三个不同的 MALDI目标上)。将0. 75ul稀释的血清点样至MALDI平板上后，加入0. 75ul 35mg/ml的芥子酸(sinapinic acid,用50%乙腈和0. 1%的三氟乙酸(TFA)配制)，然后用移液器上下混合5次。可以在室温下干燥平板。应当理解，在本发明的原则下也可以使用其他的方法和程序用于制备和处理血清。 使用自动或手动采集谱的Voyager DE-PRO或DE-STR MALDI TOF质谱仪在线性模式下获得阳离子的质谱。从每个MALDI点的7或5个位置上收集75或100个谱，以针对每份血清样本产生平均525或500个谱。使用蛋白标准品(胰岛素(牛)、硫氧还蛋白(大肠杆菌)和脱辅基红蛋白(Apomyglobin,马))的混合物从外部校正所述谱。在步骤106中，将步骤104获得的谱进行一个或多个预定的预处理步骤。使用在步骤104获得的质谱数据上运行的软件指令在通用计算机中执行预处理步骤106。所述预处理步骤106包括背景减除(步骤108)、标准化(步骤110)和比对(步骤112)。所述背景减除的步骤优选包括在谱中产生强力且不对称的背景估计和从所述谱中减去所述背景。步骤108使用了美国专利7，736，905B2和美国专利申请公开2005/0267689 (其通过弓I用并入本文)描述的背景减除技术。标准化步骤110包括减去背景的谱的标准化。所述标准化步骤110可以采用如美国专利7，736，905描述的部分离子流标准化或全部离子流标准化的形式。如美国专利7，736，905描述的，步骤112将标准化的、减去背景的谱与预定的质量标度进行比对，其可以通过对分类器所使用的训练组的研究获得。一旦完成了所述预处理步骤106，方法100继续进行步骤114，以在所述谱中于预定m/z范围内获得所选特征的数据(峰)。使用峰查找算法的峰宽设定，可以在这些m/z范围内对标准化且减去背景的幅度(amplitude)进行积分，并将该积分值(即，在特征宽度间的曲线下面积)分配给(assign)特征。对在该m/z范围内没有检测到峰的谱，积分范围可设定为该特征的平均m/z位置附近的间隔，所述特征的宽度对应于当前m/z位置的峰宽。该步骤的具体内容也可以参考美国专利7，736，905。在步骤114中，如美国专利7，736，905所描述的，在以下一个或多个m/z范围获得谱中特征的积分值5732 至 5795
5811 至 58756398 至 646911376 至 1151511459 至 1159911614 至 1175611687 至 1183111830 至 11976
12375 至 1252923183 至 2352523279 至 23622 和65902 至 67502。在优选的实施方式中，在下表I显示的这些m/z范围中的8个，而且任选在所述所有12个范围获得数值。在美国专利7，736，905中阐述了这些峰的意义和发现方法。在步骤116中，将步骤114获得的数值提供给分类器，在示例性实施方式中的分类器是K最近邻(KNN)分类器。所述分类器使用来自大量其他患者(其可以是NSCLC癌症患者，或其他实体上皮癌症患者，例如HNSCC、乳癌)的分类标记谱的训练组。将KNN分类算法应用于114的数值和训练组阐述于美国专利7，736，905中。也可以使用其他分类器(classifier)，包括概率KNN分类器或其他分类器。在步骤118中，分类器针对质谱产生“好”、“差”或“不确定”的标签。如以上所述，步骤104至118是在来自给定患者样本的三个独立试样(或使用其他任意个试样)上平行进行的。在步骤120中，进行检验以确定是否所有试样都产生了相同的分类标签。如果没有，在步骤122得到如所示的不确定的结果。如果所有试样都产生了相同的标签，在步骤124报告如所示的标签。如本文所述，公开了在步骤124报告的分类标签的新的、预料不到的应用。应当理解，通常在一种程序式通用计算机中通过使用编码预处理步骤106、在步骤114中获得谱值、在步骤116中应用K-NN分类算法和在步骤118中产生分类标签的软件，进行步骤106、114、116和118。在步骤116中使用的有分类标签的谱的训练组储存在计算机的存储器中或存储在所述计算机可以访问的存储器中。如在本申请人在先的专利申请文献美国专利7，736，905中所描述的，所述方法和程序式计算机可以优选地在实验室测试处理中心完成。对VeriStrat测试的作用机制及其实际影响的理解来自几个方面，这将在下面的部分作进一步描述。来自蛋白ID的直接证据VeriStrat测定了来自血清或血浆的MALDI-TOF MS峰的强度。在一个实施方式中，VeriStrat标记由下表I中的8个质谱峰组成。所述分类是通过估测强度(即特征值，通过在预定的m/z范围内(参见以上所列和表I)对样本的质谱进行积分)并使用7最近邻分类算法将所观察到的8个特征值的组与来自训练组的进行关联而进行的。该程序使用了非线性组合中的特征值，并且不能获得一维得分的定义。从特征值的线性组合产生分值函数的尝试一直没能成功，而且总是导致更差的结果。看来这8个特征中所有或大多数都可以用于产生临床上的用途。人们认为，确定所使用特征值的肽含量可能提供了对VeriStrat测试作用机制的理解。但是，由于仪器的m/z分辨率不够确保在给定的m/z范围内仅有一个蛋白或肽链这一事实，从而使这种理解复杂化。而且看来，多于8个肽组成了 8个峰标记，其中一些可能是相同氨基酸序列的转译后修饰形式或氧化形式，而其他的肽可能仍为不明肽。此外，所述特征值(即估测的峰强度)不简单地与样本中给定分析物的丰度相对应。这是由于MALDI电离过程的复杂性，在该过程中击中检测器的离子数量为分析物的丰度与电离概率两者的函数。这种半定量方式对峰(特征值)的比较使得与蛋白ID的标准方法(LC-MS/MS)的比较变得困难。表I:VeriStrat中使用的峰。
峰m/z
15843
211445
311529
411685
511759
611903
712452
812579尽管存在上述困难，本申请人有关于表I的3个峰与血清淀粉样蛋白A(SAA)同种型相关的有力证据。申请人在合并的VeriStrat “好”和VeriStrat “差”样本间进行了差异凝胶(DIGE)分析，并成功地分离了具有足够序列覆盖的m/z 11529和11685处的峰，从而将其鉴定为SAA19-122和SAA20-122。理论质量与所观察到的m/z值很好地相吻合。在凝胶上观察到的0.4的PI移动也与理论上的预测很好地相吻合。申请人还认为，在m/z 5843处的峰是在m/z 11685处的峰的双倍带电荷形式。这些峰已经被其他文献所报道 5(Ducet，et al. Electrophoresis 1996, 17, 866-876 Kiernan et al. FEBS Letters2003，537，166-170)。还有可能在11445处的峰是与母本SAA蛋白的C末端截断序列相关的另一种SAA同种型。虽然清楚VeriStrat标记中存在其他蛋白或蛋白同种型，可能SAA同种型在VeriStrat测试的作用机制中具有重要的作用。在下面的部分，申请人将基于以下发现提供一种VeriStrat测试作用机制的可能理论SAA是VeriStrat “差”标记中至少三个峰的主要部分，SAA与某些受体的相互作用以及这些相互作用的生物学结果的已知信息，以及多种癌细胞中都存在功能性结合SAA的这些受体的信息。但是，本发明并不是必然基于该理论，而且该理论也不是用于限制本发明。关于SAA作为癌症生物标志的现有技术参见文献6_16。SAA :生物学功能和在肿瘤发病机理中的作用
功能SAA是进化中高度保守的序列17以及SAA表达在响应感染、外伤或病理中的明显提高这些事实说明了 SAA家族的重要作用。但至今还未完全弄清SAA家族的确切生物学功能。SAA作为HDL的组分而参与脂质转运和代谢，而且可能在疾病的急性期具有保护作用18，而在慢性病况下SAA可能成为有害因素。在诸如类风湿性关节炎的一些疾病中，SAA的持续高表达会导致淀粉样蛋白A淀粉样变性19。但是，SAA蛋白在临床上的重要功能的范围更加广泛，并包括参与慢性炎症和癌症发生。后两个作用紧密相关并在Vlasova和Moshkovskii2°以及Malle等人21的综述中进行了详细讨论。SAA在癌症发生中的作用可归因于其多方面的生物学活性参与炎症，包括通过促炎症基因表达活化和细胞因子调节来支持慢性过程，参与细胞外基质降解，抗凋亡特性，以及包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)(其与癌症发生有错综复杂的关系)在内的特定途径的活化。
已证明SAA能够用作细胞外基质(ECM)粘合蛋白22并能诱导基质金属蛋白酶(MMP)18，23，其在ECM降解和重模建中起重要作用，并与癌症发生、转移和肿瘤扩散有关24’25。SAA的免疫相关功能由其细胞因子样活性确定，其可以刺激IL-8、TNF-a和IL-I P26’27 (其可能诱导用于SAA表达的正反馈)以及IL-12和IL-23(其在细胞介导的免疫应答中起重要作用28)的产生。而且已经表明，SAA可以活化PI3K和p38MAPK。SAA参与调节炎症可能与其诱导C0X2表达的能力有关，与此同时也与NF- k B和MAPK途径的活化有关29，3°。癌症与炎症的主要相互关系是无数研究和综述的主题31_37。最近的大部分数据表明，SAA可能作为二个过程之间的传递质之一而发挥重要作用，这是因为其活化关键炎症和癌症发生途径(例如典型的和非典型的MAPK途径和转录因子NF- K B)，并且可能参与它们的串话。与VeriStrat标记关联的SAA水平的提高，可以被用于测定所述途径的活化的有用方法。与SAA生物学活性有关的受体和途径已知NF-k B转录因子在大量的表皮和血液恶性病中被组成型地活化，并且认为其通过调节抗-和促-凋亡靶基因、基质金属蛋白酶表达、血管生成和细胞周期41而对促进炎症相关癌症38，39，4°至关重要。另一方面，NF- K B还可以发挥促-凋亡基因活性并能与肿瘤抑制基因P53协作以诱导细胞凋亡。实际作用依赖于涉及的刺激物、细胞型和亚基43。Rel/NF- K B因子的抗-和促-细胞凋亡效应并不一定是非此即彼的，但可以通过相同靶基因的上调而在同一细胞中相继出现44。NF-kB可能是炎症和癌症间的主要联系之一，这是因为其与诸如IL-6、TNF-a和趋化因子(包括MMP和C0X-2)的促炎症细胞因子的诱导相关3MM60 NF-kB的活化可以被EGF诱导EGF刺激通过NF- k B的活化而防止死亡受体诱导的细胞凋亡。在包括肺癌48在内的多种潜在恶性、恶性和转移性人表皮细胞癌47中都观测到了C0X-2的过表达48。C0X2通过前列腺素E2(PGE2)介导细胞增殖、血管发生、细胞凋亡和细胞迁移，还反式活化丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联的瘤性信号传导49，5°。COX通过Erk活化而反式活化MAPK49’92。该关系是相互的通过MAPK途径作用的表皮生长因子(EGF)在一些表皮细胞中大幅引导C0X2的活化作用51。已表明EGFR通过TGF a的活化刺激了 C0X2，从而导致PGE2释放的增加和有丝分裂的增加52。
丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联在正常的细胞生物学中以及癌症的发展中有重要作用，因为其转导来自活化的生长因子受体的生长刺激信号。通常通过生长因子之一结合至膜受体酪氨酸激酶受体(RTK)而起始MAPK信号转导，从而导致Raf、MEK和胞外信号调节激酶(ERk)的参与。最近的研究表明，从RTK到ERK的信号传导比仅为线性的Ras依赖型途径更加复杂，而且已经鉴定出了在确定ETK-介导的ERK信号传导的强度、持续时间和细胞定位中发挥关键作用的大量信号传导调节子。SAA在很多表皮细胞中功能性地与一些受体结合，而且这种结合可以引起NF-kB和MAPK两个途径的下游活化，这在上文进行了描述并可导致VeriStrat “差”患者对特定治疗的抗性(也参见上文的描述)。对一些所述受体的概述如下FPRL 受体FPRL受体在包括肝细胞53、肠表皮细胞54和肺细胞55在内的多种细胞中均有表达。SAA与FPRL-I (经典的G-蛋白耦合受体之一)相互作用，并触发对细胞功能和表皮细胞增殖和/或凋亡的调节至关重要的信号传导网络。SAA与FPRLl的结合导致了白介素的活化 和诱导。FPRL的参与活化了与细胞凋亡和癌症的发展有关56’57’41的蛋白激酶C(PKC)和转录因子NF-kB途径3°。还表明，SAA与FPRLl的结合导致中性粒细胞和类风湿滑膜细胞的细胞凋亡营救(其由MAPK ERKI/2的磷酸化、PI3K/Akt信号传导和STAT3活化介导)和细胞内Ca2+的释放58’59’6°，因而促进细胞增殖和存活。SR-BI 受体清道夫受体B-I (SR-BI)被鉴定为高密度脂蛋白受体，介导选择性的胆固醇摄取61O SR-BI在类固醇组织和肝中有大量表达，但还在炎症过程中在巨噬细胞和单核细胞中被上调；SR-BI高表达已经在人动脉粥样硬化损害中在充满脂质的巨噬细胞中得到证明，而且也以SAA存在为特征。亦表明SAA促进由SR-BI介导的细胞胆固醇的流出62。Baranova等63证明了在与ERK1/2和p38MAPK的磷酸化以及11-8分泌有关的HeLa和THPl (人急性单细胞性白血病细胞系)细胞中SAA与SR-BI的特异性结合。SR-BI受体的表达出现在包括人肺癌细胞系在内的不同细胞中64。RAGE晚期糖基化终产物受体(RAGE)只在肺中以容易测定的水平恒定表达，但在炎症位点增长很快，主要在炎症和上皮细胞上。发现在上皮细胞中，RAGE(膜结合或可溶性蛋白)通过应激显著上调。通过RAGE的持久信号传导诱导了存活途径并减少了细胞凋亡和坏死(伴随着ATP的消耗)。这导致了在很多情况下产生出现上皮细胞恶性的环境的慢性炎症'RAGE过表达与前列腺、结肠和胃肿瘤有关；而肺和食道癌的晚期阶段是以RAGE的下调为特征的66。在口腔鳞状细胞癌中，RAGE的表达与肿瘤进程和复发极度相关，而且RAGE-阳性患者表现出明显更短的无病存活期。在其他多个配体中发现SAA与晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合并通过ERK1/2和p38MAPK途径诱导NF_kB (没有诱导COX途径)67。TLR最近的研究表明，SAA可能作为类toll受体(TLR)TLR4和TLR2的内在拮抗剂21。发现TLR4在许多人类癌症细胞中都有表达68’69。在肺癌中，显示TLR4的活化促进免疫抑制细胞因子TGF-P、促血管生成趋化因子IL-8和VEGF的产生。提高的VEGF和IL-8分泌与P38MAPK活化有关7°。SAA对TLR4的活化需要p42/44和p38MAPK的磷酸化71.
TLR2也显示作为SAA的功能性受体。表达TLR2的HeLa细胞通过NF_kB的有力激活而响应 SAA ；SAA 刺激导致 TLR2-HeLa 细胞中 ERK1/2 (P-ERK1/2)、p38MAPK (P-p38)和JNK (P-JNK)MAPKs的磷酸化的增强，以及I k B a (NF k B抑制剂)降解的加速72。在巨噬细胞中证明了作为SAA的特异活化结果的NF-k B的刺激'图3给出了 SAA的可能相互作用及其在癌症发展和治疗抗性中的生物学作用的简化示意图。可以看出，可以根据多个途径的串话考察SAA的生物学功能，其中所述途径通过SAA与多种受体的相互作用而触发，其最终会聚于至少一种主要MAPK途径(ERK、p38和JNK)的活化21’41，和/或会聚于NF-kB的活化。这些相互作用中的一些例示于图4的EGFR转导途径图中。EGFR是一种活化包括Ras-Raf-Mek以及由3_磷酸肌醇激酶(PI3K)、Akt和PKC组成的途径在内的几个主要下游信号传导途径的酪氨酸激酶受体(TKR)。这反过来可对通过与NF-kB转录活化途径和与炎症途径(例如由C0X2诱导的途径)的多种串话联系而相互 作用的增殖、存活、侵入、转移性扩散和肿瘤血管生成产生影响。SAA可能能够活化独立于酪氨酸激酶受体的这些途径(如宽箭头所示)。EGFR的过表达和/或组成型活化与包括脑、胸、肠和肺在内的多种癌症有关。级联中成分的改变引起所述途径的活化，并被认为与癌症诱导和进展相关，例如活化EGFR激酶结构域(在非吸烟者中)或KRAS (在吸烟者中)的突变与肺癌的早期发展有关74’75。Ras蛋白在约25%的癌症中被组成型地活化，引起独立于上游调节的有丝分裂信号传导。最近收集的大部分数据表明，非线性信号传导和反式活化在癌症发展和进程中起重要作用。SAA相互作用和抗癌症治疗的抗性化疗、放射和抗炎治疗如上文所描述的和图3、4所示，SAA与大量受体的相互作用导致与癌症治疗抗性相关的途径的活化。前面讨论了 NF-kB在化学和放射抗性中的作用41。NF-kB的抑制通过增强细胞凋亡应答而产生对放疗78和死亡细胞因子的敏感。同时，暴露于放射和某些化疗药物导致NF-kB的活化和随后对细胞凋亡的抗性81’79。已经证明，抑制化疗(吉西他滨)诱导的NF-kB活化恢复了 NSCLC细胞系对化疗诱导凋亡的敏感性82’81。另一方面，在某些情况下，显示NF-K B与化疗的敏感性有关，如曾经提出NF-k B是紫杉醇诱导的细胞死亡所必须的82。考虑到这一信息，由血浆或血清中提高的SAA浓度(VeriStrat “差”的患者的特征)得出的一个可能结论是，增加的SAA可引起NF-B转录因子和MAPK途径的活化。这可能与癌症对放疗的初步抗性有关，并可影响到患者对化疗的响应。然而，存在多个因素，应该针对各类型的治疗和患者组群单独对其进行评估。NF-KB抑制剂，如三氧化二砷、姜黄素、萨立多胺均经过大量的临床试验。然而，由于NF- K B抑制剂也增强了化疗诱导的正常造血母细胞的细胞凋亡，在化疗中使用NF- K B抑制剂作为辅助剂可能会延缓骨髓恢复。应当认为，由于NF-K B在激活固有免疫应答和适应免疫应答中起着关键作用，长期使用抑制剂可能与免疫缺陷的风险相关41。事实上，如果VeriStrat “差”标记与特定的NF-k B活化有关，这个标记可以用来选择从NF- K B抑制剂中获益最多的患者，并可减少不必要的治疗和相关发病。受体酪氨酸激酶-靶向治疗
erbB受体和MAPK途径EGFR和HER2属于表皮生长因子受体(EGFR)家族，这一家族由四个成员(EGFR(HERl)、erbB4(HER4)、erbB3(HER3)和 erbB2 (HER2 基因))组成。由于大多数上皮癌表现异常活化的表皮生长因子受体(EGFR)和HER2受体，这些受体的特异性抑制成为癌症靶向治疗的策略，并成为许多研究的课题。在没有配体的情况下，EGFR受体以抑制激酶活性的构象存在。配体结合启动了暴露出“二聚环”的构象改变，引发受体二聚化。这些转变被传达跨细胞膜，从而活化激酶结构域。对该活化方案的改变发现于ErbB家族中。ErbB-3不是一个功能激酶,但能够反式活化二聚体配偶体，而HER2/ErbB-2是“锁定”于活性构象中的不需要配体(ligand-less)的致癌受体。这种二聚化导致酪氨酸激酶功能的活化，通过三个主要信号传导途径导致信号转导，并最终导致逃避凋亡、持续的血管生成、抗生长信号的抗性、生长信号的自足和转移 83
O级联成分的改变导致途径的活化，并被认为与癌症的诱发和进展相关，例如活化EGFR激酶结构域(在非吸烟者中)或KRAS基因(在吸烟者中)的突变与肺癌的早期发展相关74’72。Ras蛋白在约25%的肿瘤中被组成型地活化，引起独立于上游调控的有丝分裂信
号传导76’77。目前在临床实践中用于多种实体瘤的有几种酪氨酸激酶抑制剂，其中包括两个小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂-厄洛替尼和吉非替尼，以及EGFR和HER2双重抑制剂拉帕替尼。批准临床应用还有抗-HER2人源化单克隆抗体曲妥单抗和两个抗-EGFR抗体-西妥昔单抗和潘尼单抗。在多个出版物中综述的固有和获得性酪氨酸激酶抑制剂(小分子以及单克隆抗体)抗性归因于多个因素，例如激活KRAS突变，met-原癌基因的扩增84和T790M突变。癌症及其显示响应靶向药剂的数个抗性途径的多样性使得通过单个药剂的治愈性治疗的前景更加暗淡，除其他原因之外是因为独立于配体与其受体的正常上游相互作用的信号传导的活化的可能性84。越来越多的证据显示了多个酪氨酸激酶共表达、自受体下游的途径的串话和传导级联的下游激活的重要性。多个研究均表明，途径的反式活化是抗性机理之一。例如，胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)信号传导显示能够弥补人类乳腺癌和前列腺癌细胞系中吉非替尼引起的EGFR阻断85。可选的下游信号传导，特别是通过Akt活化，如通过致癌基因PIK3CA或其他的RTK，已作为NSCLC中的TKI抗性机制之一 86。Cappuzzo88等人观察到，如果Akt被激活而EGFR表达呈阴性，非小细胞肺癌患者对吉非替尼的敏感性非常低，这证实EGFR独立性活化可导致吉非替尼抗性。本发明人通过VeriStrat测试测定提出，SAA的相互作用可引起MAPK级联的RTK独立性激活，进而产生TKI抗性。这种SAA作用机制可能是直接或间接的。SAA的直接作用可由其与RAGE或TLR2和TLR4受体的结合介导，导致典型MAPK途径的活化(通过活化JNK和p38)。Malle等人21综述了这些受体在各种癌细胞表面以及癌相关细胞中的存在以及它们的相互作用。有直接证据表明，EGFR途径的活化是TLR受体活化的结果66。SAA的间接作用可通过以下来解释通过FPRL受体发挥作用，导致白细胞介素116和118的释放，其反过来与G蛋白偶联受体发生反应，激活PKC。(PKC的活化导致细胞增殖和血管通透性增加，进而导致MAPK途径中MEK的活化)。此外，它还诱导VEGF表达。SAA是肺内皮细胞和巨噬细胞中TRL4的配体。据报道，在肿瘤细胞中表达的TLR的连接还提高了 VEGF水平7(1。该信息为负责SAA对所有三个主要MAPK途径的下游活化的机制的存在提供了证据。下游活化MAPK途径独立于RTK并可导致自“交互”检测点上游的靶向抑制的抗性。综上，利用VeriStrat测试法选择最适合包括联合治疗在内的特定治疗的患者可能有助于克服某些类型的耐药性。联合治疗和VeriStrat标记TKI 和 C0X2 抑制剂
如以上所讨论的，SAA能诱导C0X2的表达。Huang等人87首次报道了 C0X2在肺癌中的过表达，在大约70%的腺癌中都观察到了 COX的过表达88，并在其他多个研究中均得到了证实。多个实验已经证实，C0X2和EGFR信号传导途径之间的串话。如以上所讨论的，通过MAPK途径发挥作用的表皮生长因子(EGF)在一些上皮细胞中大幅诱导C0X2活性'TGFa对EGFR的活化刺激了 C0X2，并导致前列腺素E2 (PGE2)的释放和有丝分裂的增加48。另一方面，C0X-2的产物前列腺素E2 (PGE2)可以反式活化EGF受体45。在NSCLC中，证明PEG2以独立于EGFR的方式通过细胞内串话活化MAPK/ERK途径；这种作用通过G-蛋白偶联受体和蛋白激酶C(PKC)介导，并可能有助于EGFR-TKI抗性。另一方面，显示C0X2抑制剂抑制NF-K B途径塞来昔布通过抑制Akt和IKK而发挥其作用。在人非小细胞肺癌中，显示塞来昔布通过抑制IKK和Akt活化而抑制NF-k B和TNF诱导的JNK、p38MAPK和ERK活化，导致C0X-2以及炎症、增殖和癌症发生所需的其它基因的合成下降46’9°。包括阿司匹林和布洛芬在内的其他NSAID，显示通过抑制IKK活化和I K Ba降解而发挥作用。结合以上，这些考虑为向标准癌症治疗中加入C0X2提供了强有力的证据。在NSCLC中联合抗炎和酪氨酸激酶受体靶向治疗的研究以及其克服EGFR-TKI抗性的潜能在之前已有综述9°’91。所述试验结果均为阴性，发现吉非替尼和塞来昔布联合治疗的患者的应答率和存活率，以及用罗非昔布和厄洛替尼治疗的患者的疾病控制率92，93，与单药剂治疗中观察到的相似。可能由于SAA对该途径的上调作用，加入COX抑制剂的作用可能在VeriStrat“差”的患者中更为明显。然而，由于C0X2途径抑制对下游MAPK活性和对NF- k B以及对其相互作用的作用幅度未知，所以所述作用幅度难以预测。这个假设值得进一步研究。细胞系的证据(图8)本发明人已经证明，VeriStrat “差”的血清可在肿瘤细胞中引起生物学效应，特别地，它可以提高药物敏感细胞系中细胞对吉非替尼的抗性。对吉非替尼敏感细胞系HCC4006 (其具有EGFR外显子19的缺失)和抗性细胞系A549 (EGFR野生型)进行了实验。人血清来自IIIB/IV期NSCLC患者并且以VS “好”或“差”表征。通过合并每个分类相的血清构成库，并用在生长抑制实验中。使用两种培养基组成接种细胞(每个药剂浓度10个重复；2000细胞/孔)；添加有10%好血清的RPMI或添加有10%差血清的RPMI。24小时后，加入吉非替尼，并将平板温育培养6天。用MTT实验测定生长抑制率。结果见下表2和图8。表权利要求
1.鉴定实体上皮瘤癌症患者可能受益于利用治疗剂或治疗剂的组合的治疗或者可能不受益于利用所述治疗剂或治疗剂的组合的治疗的方法，其中，所述治疗剂靶向参与MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)途径或者自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC(蛋白激酶C)途径或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC途径的受体的激动剂、受体或蛋白，所述方法包括以下步骤 a)获得所述实体上皮瘤癌症患者的基于血的样本的质谱； b)在步骤a)获得的质谱上进行一个或者多个预定的预处理步骤； c)在进行了步骤b)在所述质谱上的预处理步骤后，在所述谱中于一个或者多个预定的m/z范围获得所选特征的积分强度值； d)将步骤c)获得的数值用在分类算法中，所述分类算法使用了包括由其他实体瘤患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，以鉴别所述患者可能受益于或可能不受益于利用所述治疗剂或治疗剂的组合的治疗。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合靶向EGFR和VEGF0
3.根据权利要求I所述的方法，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合靶向HER2。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合包含曲妥单抗。
5.根据权利要求I所述的方法，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合靶向EGFR，且其中所述分类算法产生分类标签，所述分类标签鉴定所述患者可能受益于利用C0X2抑制剂和靶向EGFR的治疗剂的联合治疗，并可能不受益于仅靶向EGFR的治疗剂的治疗。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述C0X2抑制剂包括塞来昔布。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述C0X2抑制剂包括罗非昔布。
8.根据权利要求I所述的方法，其中，通过分类标签进一步鉴定所述患者可能受益于利用NF-K B抑制剂的治疗。
9.根据权利要求I所述的方法，其中，所述一个或者多个预定的m/z范围选自由以下m/z范围组成的组5732 至 57955811 至 58756398 至 646911376 至 1151511459 至 1159911614 至 1175611687 至 1183111830 至 1197612375 至 1252923183 至 2352523279 至 23622，和65902 至 67502。
10.仪器，其经配置用以鉴定实体上皮瘤癌症患者可能受益于利用治疗剂或治疗剂的组合的治疗或者可能不受益于利用所述治疗剂或治疗剂的组合的治疗，其中，所述治疗剂靶向参与MAPK (丝裂原活化蛋白激酶)途径或者自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC (蛋白激酶C)途径或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC途径的受体的激动剂、受体或蛋白 储存装置，用于储存所述实体上皮瘤癌症患者的基于血的样本的质谱； 执行软件指令的处理器，其经 配置用以a)在所述质谱上进行一个或者多个预定的预处理步骤；b)在所述质谱中于一个或多个预定的m/z范围获得特征的积分强度值；和c)将步骤b)获得的数值用在分类算法中，所述算法使用了包括由其他实体上皮瘤癌症患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，以鉴别所述患者可能受益于或可能不受益于所述治疗剂或治疗剂的组合。
11.根据权利要求10所述的仪器，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合靶向HER2。
12.根据权利要求10所述的仪器，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合靶向EGFR和VEGF0
13.根据权利要求10中所述的仪器，其中，所述治疗剂或者治疗剂的组合包含曲妥单抗。
14.根据权利要求10中所述的仪器，其中，所述治疗剂靶向EGFR，且其中所述分类算法产生分类标签，所述分类标签鉴定患者可能受益于C0X2抑制剂和靶向EGFR的治疗剂的联合治疗并可能不受益于仅靶向EGFR的治疗剂的治疗。
15.根据权利要求14所述的仪器，其中，所述C0X2抑制剂包括塞来昔布。
16.根据权利要求14所述的仪器，其中，所述C0X2抑制剂包括罗非昔布。
17.根据权利要求10所述的仪器，其中，所述患者被进一步鉴定可能受益于利用NF-K B抑制剂的治疗。
18.根据权利要求10所述的仪器，其中，所述预定m/z范围选自由以下m/z范围组成的组5732 至 57955811 至 58756398 至 646911376 至 1151511459 至 1159911614 至 1175611687 至 1183111830 至 1197612375 至 1252923183 至 2352523279 至 23622，和65902 至 67502。
19.预测癌症患者是否可能受益于C0X2抑制剂和EGFR抑制剂联合给药的方法，所述方法包括以下步骤 a)获取所述癌症患者的基于血的样本的质谱； b)在步骤a)获得的质谱上进行一个或者多个预定的预处理步骤；c)在进行了步骤b)在质谱数据上的预处理步骤后，在所述谱中于一个或者多个预定m/z范围获得所选特征的积分强度值； d)将步骤c)获得的数值用在分类算法中，所述分类算法使用了包括由其他实体上皮瘤癌症患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，用以鉴定所述患者可能受益于或者可能不受益于C0X2抑制剂和EGFR抑制剂联合给药的治疗。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述预定的m/z范围选自由以下m/z范围组成的组5732 至 57955811 至 58756398 至 646911376 至 1151511459 至 1159911614 至 1175611687 至 1183111830 至 1197612375 至 1252923183 至 2352523279 至 23622，和65902 至 67502。
21.根据权利要求I所述的方法，其中，所述方法在实验室测试中心实施。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法在实验室测试中心实施。
23.仪器，其经配置用于预测癌症患者是否可能受益于COX2抑制剂和EGFR抑制剂联合给药，所述仪器包括 储存装置，用于储存所述癌症患者的基于血的样本的质谱； 执行软件指令的处理器，其经配置用以a)在所述质谱上进行一个或者多个预定的预处理步骤；b)在进行了步骤a)在所述质谱上的预处理步骤后，在所述谱中于一个或多个预定的m/z范围获得特征的积分强度值；和c)将步骤b)获得的数值用在分类算法中，所述算法使用了包括由其他癌症患者的基于血的样本产生的带分类标签的谱的训练组，以鉴定所述患者可能受益于或者可能不受益于COX2抑制剂和EGFR抑制剂联合给药的治疗。
全文摘要
利用质谱数据分析和分类算法的方法提供了测定实体上皮瘤癌症患者是否可能受益于治疗剂或治疗剂的组合的能力，其中所述治疗剂靶向参与MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)途径或自Akt或ERK/JNK/p38或PKC上游的PKC(蛋白激酶C)途径或在Akt或ERK/JNK/p38或PKC处的PKC途径的受体的拮抗剂、受体或蛋白，例如靶向EGFR和/或HER2的治疗剂。所述方法还提供了测定癌症患者是否可能受益于靶向EFGR的治疗剂和靶向COX2的治疗剂的组合的能力，或者测定癌症患者是否可能受益于用NF-κB抑制剂治疗的能力。
文档编号G01N33/48GK102770760SQ201180011032
公开日2012年11月7日 申请日期2011年2月22日 优先权日2010年2月24日
发明者朱莉娅·格里戈里耶沃, 海因里希·罗德, 马克西姆·齐平 申请人:佰欧迪塞克斯公司