专利名称：用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器。
背景技术：
1992年美国分子器件公司首次提出将活细胞与EIS(电解质/绝缘层/硅)结构的光寻址电位传感器相结合，构成敏感测试仪器，检测胞外微环境酸碱度的变化，在此基础上，又有研究人员改进传感器结构和数据处理方法，使该类传感器可以同时检测几种离子的变化。但是，这些细胞传感器检测的都是细胞群的代谢产物，所以很难确定药物对单个细胞的作用机理，同时，也难以将测量精确定位到离子通道，无法确定药物对细胞的作用靶点，对于实现药物筛选的定量化是个不可回避的难点。

发明内容
本实用新型的目的在于提供一种用于细胞动作电位检测及药物分析测量的单细胞传感器，能够对单个细胞外动作电位进行定性和定量检测。
为了达到上述目的，本实用新型采用的技术方案如下在铝板上固定敷铜板，敷铜板上粘附具有SiO2层的打磨的Si片，聚二甲基硅氧烷作的微型测量腔固定在SiO2层上，微型测量腔上覆盖一层生物兼容性胶，与下表面镀金膜参考电极的光学玻璃粘接，玻璃上两个开口处分别接通药物和培养液的进液乳胶管和出液乳胶管，敷铜板上引出工作电极，对电极与金膜参考电极相连。
所说的微型测量腔为1～2个。
本实用新型具有的优点是该单细胞传感器提高了精度和稳定度，细胞贴附生长状况良好，将测量定位于单个细胞，可以准确测量药物刺激下，单细胞的胞外动作电位变化。本实用新型改善了光源设计，提高了精度和稳定度，可以将测量定位于单个细胞甚至单个离子通道，从而将精确测量药物对单个细胞的作用及作用靶点。这种单细胞传感器，可以实现神经细胞外动作电位的快速、实时监测，定性分析不同浓度不同药物对细胞的兴奋和抑制作用，主要应用于药物筛选、分析和评价。
以下结合附图和实施例对本实用新型作进一步的说明。


图1是单细胞传感器沿图2的I-I方向剖面结构图；图2是单细胞传感器俯视图；图3是采用涂敷法提高器件的灵敏度；图4是单细胞传感器检测实例系统示意图；图5是n型硅衬底LAPS的特性曲线示意图；图6是无药物刺激时，单细胞传感器的基线；图7是低浓度乙酰胆碱刺激时单细胞传感器的响应；图8是中浓度乙酰胆碱刺激时单细胞传感器的响应；图9是高浓度乙酰胆碱刺激时单细胞传感器的响应。
图中，1.铝板，2.敷铜板，3.光可寻址电位传感器，3.1.打磨薄后的Si片，3.2。SiO2层，4.光学玻璃，5.金膜参考电极，6.红光激光器，7.聚二甲基硅氧烷微型腔，8.生物兼容性胶，9.多聚鸟胺酸与层粘素层，10.工作电极，11.对电极，12.进液乳胶管，13.出液乳胶管。
具体实施方式
1、传感器的检测结构如图1、图2所示，本实用新型在铝板1上固定敷铜板2，敷铜板2上粘附具有SiO2层3.2的打磨薄的Si片3.1，聚二甲基硅氧烷作的微型测量腔7固定在SiO2层3.2上，聚二甲基硅氧烷微型测量腔7上覆盖一层生物兼容性胶8，与下表面镀金膜参考电极5的光学玻璃4粘接，微型测量腔7内涂敷一层多聚鸟胺酸与层粘素层9，玻璃上两个开口处分别接通药物和培养液的进液乳胶管12和出液乳胶管13，敷铜板上引出工作电极10，对电极11与金膜参考电极5相连。测量时，微型测量腔上面粘光学玻璃为上盖，形成密封测量腔。红光激光器6选择照射某一细胞正上方，进液乳胶管与蠕动泵连接，通过泵的通断控制药物刺激，工作电极、参考电极、对电极与恒电位/电流仪相连，恒电位/电流仪通过锁相放大器与数字补偿电路相连，接入计算机，与计算机实现双向通讯，控制温度并实现数据采集处理，计算机与数字/模拟转换器相连，控制蠕动泵通断，检测系统框图如图4所示。
2、传感器的制备(1)光寻址电位传感器的制备选用<100>n型单晶硅片作为LAPS的衬底。硅片经抛光清洗后，放入1000℃高温炉中进行热氧化20分钟，使硅片正面生长一层厚度约为30nm的SiO2薄膜，利用打磨技术从背面将硅片的厚度打磨至100μm，然后用导电胶将硅片粘在敷铜板上，160℃高温固化2小时，通过欧姆从敷铜板上接触引出工作电极。
(2)硅器件表面处理本实用新型设计了两种细胞固定的方案一，涂敷法，即在芯片表面做增强贴附性的涂层；二，通过改变芯片表面的粗糙度，做诱导细胞生长的图形。
涂敷法过程如下将100μg/ml多聚鸟氨酸的磷酸盐缓冲液和8μg/ml层粘素的磷酸盐缓冲液按1∶1混合，用0.22μm的微孔滤膜滤菌，将器件浸入该混合溶液(PLOL)中，37℃，5％CO2环境下，浸泡24小时，再用双蒸水冲洗两次，冷冻备用。实验结果证明做了表面处理后的单细胞传感器，斜率明显增大，因此器件敏感性提高，从而提高了测量的灵敏度，如图3所示，而且，细胞形态正常，突触明显，生长情况良好。
改变芯片表面的粗糙度的过程如下用光刻技术在LAPS表面做2×2mm2的微腔图形，改变硅片的表面粗糙度，然后再进行涂层的处理。
(3)参考电极制备热丙酮清洗增透光学玻璃，80℃烘干。在玻璃表面，用坐标纸做掩模，采用磁控溅射技术在玻璃表面按掩模形状镀金，用导电胶将导线与金膜粘接，引出参考电极。
(4)微型测量腔设计用聚二甲基硅氧烷制备一0.2×5×5cm3的薄膜结构，用模具在上刻出与参考金电极类似的两个测量腔，腔的尺寸为0.2×1.4×0.5cm3。用生物兼容性胶将此结构粘着于LAPS传感器表面，在此腔中培养细胞，测量时，上面粘光学玻璃为上盖，形成密封测量腔。
传感器的原理由于要测量的是细胞外液体环境的生理参数，所以采用的是具有EIS结构的LAPS系统。它的基本原理是半导体的内光电效应，即当半导体受到一定波长的光照射时，半导体吸收光子，发生禁带到导带的跃迁，即产生电子空穴对。在一般情况下，电子空穴对很快复合，在外电路中是测不到电流的。如果，给LAPS外加反向偏置电压时(n型硅加负压，P型硅加正压)，半导体中产生耗尽层，这时靠近耗尽层的电子空穴对就被耗尽层拉开。当固定光强时，就会产生光电压，LAPS采用强度调制的光照射在器件的正面或背面，就可以在外电路中测量到电流。电流的大小，与光强、耗尽层的厚度(即外偏压)等有关。
如图5所示是n型硅衬底光寻址电位传感器的特性曲线示意图，该曲线可以分为截止区、过渡区(工作区)和饱和区，这是由硅的特性决定的。特性曲线沿偏压轴的平移就是膜响应值，特性曲线决定了偏压的选择点、LAPS灵敏度、膜响应与测量值的对应关系等。
单细胞传感器检测细胞动作电位实施例选择了1∶10000、1∶100000、1∶1000000(g/ml)三种浓度的乙酰胆碱(Ach)作为神经元的刺激药物，实验结果表明，乙酰胆碱对于大脑皮层的神经元是兴奋作用。
如图6所示，为未加任何药物刺激时，细胞传感器测得的信号，是信号分析的基线，图中可以看出，有很小不规则的扰动，主要是由于测量系统同轴缆线未能起到很好的屏蔽作用以及环境的微小震动所引起的。如图7所示，是在1∶1000000低浓度Ach作用下，细胞传感器的响应，图中曲线与基线相似，几乎没有变化，说明在该浓度下，Ach还未能引起细胞产生动作电位。如图8所示，是在1∶100000中浓度Ach作用下，细胞传感器的响应，由此图可以看出，胞外的电位频度和幅度都发生变化，检测到有一频率约为1Hz幅度约为1.8mV的电信号，初步判定为细胞的动作电位。如图9所示，是在1∶10000高浓度Ach作用下，细胞传感器的响应，该信号频度和幅度都有很大的变化。
该结果说明，当Ach溶液在一定浓度范围内变化，会引起细胞的胞外电位的改变，单细胞传感器可以检测到电信号频度和幅度变化，而且，随Ach浓度增加，电位的幅度增大。
权利要求1.一种用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器，其特征在于在铝板(1)上固定敷铜板(2)，敷铜板(2)上粘附具有SiO2层(3.2)的打磨的Si片(3.1)，聚二甲基硅氧烷作的微型测量腔(7)固定在SiO2层(3.2)上，微型测量腔(7)上覆盖一层生物兼容性胶(8)，与下表面镀金膜参考电极(5)的光学玻璃(4)粘接，玻璃上两个开口处分别接通药物和培养液的进液乳胶管(12)和出液乳胶管(13)，敷铜板上引出工作电极(10)，对电极(11)与金膜参考电极(5)相连。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器，其特征在于所说的微型测量腔(7)为1～2个。
专利摘要本实用新型公开了一种用于细胞胞外动作电位测量的单细胞传感器。在早期多光源细胞微生理计的基础上，利用光寻址电位传感器(LAPS)技术，克服传感器几何特性对细胞培养的限制，采用光源移动寻址，对随机培养的单个细胞跟踪定位测量。本实用新型配套改进的光源系统，提高了精度和稳定度，可以将测量定位于单个细胞甚至单个离子通道，从而将精确测量药物对单个细胞的作用及作用靶点。这种单细胞传感器，可以实现神经细胞外动作电位的快速、实时监测，定性分析不同浓度不同药物对细胞的兴奋和抑制作用，主要应用于药物筛选、分析和评价。
文档编号G01N27/26GK2709979SQ20032012296
公开日2005年7月13日 申请日期2003年12月25日 优先权日2003年12月25日
发明者王平, 许改霞, 秦利锋, 徐莹 申请人:浙江大学