专利名称：利用骨髓细胞生物标记诊断癌症的制作方法
利用骨髓细胞生物标记诊断癌症概述本发明涉及骨髓细胞生物标记用于肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)的鉴别诊断、预后和监测。本发明还涉及对肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)治疗效果的监测，以及确定肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)治疗效果的预后。本发明还涉及在上述方法中使用的细胞生物标记面板，尤其是用于测量上述生物标记的多色面板。考虑到本发明的目的，文中引用的所有参考文献通过引用的方式被完整地并入本文。
背景技术：
在欧洲，肾细胞癌(RCC)是男性中第七大最常见的恶性肿瘤，每年在男性中新增29，600病例(占全部癌症的3.5%)。在女性中，每年有16，700例(在全部癌症中排名第十二位或占全部癌症的2.3%)。RCC在40岁之前很少见。超过这个年龄后，男性患病率是女性的两倍。随着年龄增长，发病率迅速攀升，从每年40岁以下的100，000人中少于两例患者到每年65 - 69岁年龄段的100，000人中有38例患者。此后，每年上升到75岁以上的100，000人中有46例患者。共有25 - 30%的RCC患者在首发症状时出现明显的转移。大约三分之一的肾癌患者会随着时间推移而患转移性疾病。因此，在所有RCC患者中，有将近50 - 60%的患者最终会出现转移性疾病。在转移性疾病患者中，约75%的患者有肺转移瘤，36%的患者有淋巴结和/或软组织受累，20%的患者累及骨骼，18%的患者累及肝脏。与五年存活率分别为82%和100%的膀胱癌或前列腺癌相比，RCC是泌尿生殖系统肿瘤中最致命的癌症，其五年存活率为65% (根据美国1972-2001年的数据)。在欧洲，肾癌诊断(1990-1994)后的平均五年存活率(截至1999年)大约是58%，RCC被几位论文作者归类为仅中度预后的癌症。总的来说，RCC对近80%的患者有致命性。这个数据表明，对有效和早期的临床随访和复发治疗有强烈的医疗需求。美国癌症联合委员会(AJCC)已经根据ITM分类确立了 RCC的分期。(肾脏，《2002年美国癌症联合委员会，肾细胞癌的TNM分类》)。肾细胞癌的分期系统是基于肿瘤在肾脏外的扩散程度。存活率在很大程度上取决于肿瘤是在哪一分期诊断出来的:对于有远处转移病变的患者，其5年存活率仅为12% ;而对于患有局部恶性肿瘤的患者，其5年存活率为80%。在全球，结肠直肠癌(CRC)是第三大常见癌症。结肠直肠癌患者每年大约新增一百万例，与大多数其他肿瘤不同，其男性和女性患者数量并无显著区别(比例为1.2:1)。在欧洲，CRC是第二大常见癌症，也是男性和女性第二大常见癌症相关死因，每年新增约380，000例，疾病相关的死亡约为每年200，000例。2002年，男性和女性的原始发病率分别为 88.3/100，000 和 84.0/100，000，原始死亡率分别为 34.8/100，000 和 35.2/100，000。这些数据清楚地反映了 CRC作为个人和社会负担一大来源的重要性。CRC是一种老年人癌症，因为男性和女性病症表现的平均年龄分别是69和75岁。除了饮食和生活方式因素(如月巴胖、缺乏身体锻炼、吸烟、经常饮酒)外，其他危险因素是CRC的家族性发病、遗传性CRC (家族性腺瘤性息肉病[FAP]、衰减型FAP[衰减型腺瘤性息肉病；AAPC]、遗传性非息肉病性结肠直肠癌[HNPCC]、错构瘤息肉综合症)和炎性肠疾病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩病。CRC主要表现为直肠、乙状结肠、横结肠/降结肠和升结肠/盲肠黏膜上的腺癌。早期结肠直肠癌可以通过一期手术治愈。但是，远处转移扩散到局部淋巴结和肝、肺以及其他器官(如CNS)。因为具有非特异性症状，CRC经常在相对晚期被诊断出来，约有25%的CRC患者会在第一次就医时有转移性疾病(mCRC)。在新诊断出患有局部可切除CRC的患者中，另外有30%的患者随后会出现转移复发。除了 Dukes系统外，通常使用AJCC制定的ITM系统(2002年最新版本)来对CRC进行分期。该系统是根据原发肿瘤浸润深度、是否有区域淋巴结转移以及是否有远处转移来划分癌症的。因为产生的类别数量可能会非常大，所以按照I至IV期对各种类别进行分组。最近，III期被进一步细分为IIIA到IIIC期，因为这些分期被确定为显著的独立预后变量。在过去的三十年里，癌症相关死亡率持续下降。与此同时，男性和女性的总体5年存活率提高到63%。该存活率的提高在很大程度上可能归功于手术治疗的改善、局部高危疾病的辅助治疗和晚期转移性疾病的综合治疗。髓源性抑制细胞(MDSC)是描述具有免疫抑制特性骨髓细胞其几个细胞亚群的术语。经过讨论，这些免疫抑制特性被认为与癌症免疫编辑生物学有关。髓源性抑制细胞(MDSC)在实验模型和患者中促成肿瘤诱导的免疫紊乱。在荷瘤小鼠中，MDSC是表型异质细胞，其表面标记不同，这可能取决于不同肿瘤在不同成熟阶段产生的可溶性因子，以及在癌症患者中非常有效地抑制T细胞功能。众所周知，生长中的肿瘤刺激骨髓细胞生成，并通过产生生长因子和细胞因子来影响细胞分化。Lechner 等，(在:Lechner MG, Liebertz DJ, Epstein AL,正常人外周血单核细胞的细胞因子诱导髓源性抑制细胞的特性研究。《免疫学杂志》，2010年8月15日；185(4): 2273-84。电子版2010年7月19日)中描述癌症患者的MDSC增加与病情更严重和预后差有关。借助于RT-PCR，对MDSC-诱导人实体瘤细胞系15种免疫因子(TGFP、IL_13、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF, M-CSF, IDO、fms-相关酪氨酸激酶 3 配体、c-kit 配体、诱导型NO合酶、精氨酸酶-UTNF-a、环氧合酶2、血管内皮生长因子[VEGF])的表达进行评估。根据这些数据，然后通过测量⑶3/⑶28刺激后细胞因子混合物抑制增殖、IFN-Y产生、新鲜人自体T细胞的能力，来检测它们在体外利用健康供者PBMC产生抑制性CD33 (+)细胞的能力。论文作者认为某些细胞因子是抑制癌症患者体内MDSC诱导的潜在治疗靶点。Allan (在2008年11月的《自然:免疫学综述》第8卷828期中)描述髓源性抑制细胞(MDSC)是异质性免疫细胞群体，它在荷瘤寄主中累积并对炎症产生反应。尽管已经确定MDSC抑制T-细胞反应能够防止肿瘤排斥，但是引起MDSC累积和抑制功能的机制并不清
/E.0尽管在RCC和CRC诊断和治疗方面取得了上述最新进展，但是为了进一步提高存活率和更好地调整患者的治疗，仍然需要能够用来提高诊断、尤其是鉴别诊断、预后、疗效监测、了解肾细胞癌(RCC)和/或结肠直肠癌(CRC)最佳疗程的生物标记。此外，标记也应该考虑到上述对肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)的治疗效果的预后。因此，本发明的目的是提供各自的生物标记以及诊断、预后和预测方法。
本发明的详细说明在本发明的第一个方面，上述目的是通过提供诊断和/或预后癌症的方法来实现的，包括根据至少一个髓源性抑制细胞(MDSC)表型标记，确定样品中MDSC群体至少一个MDSC表型的水平。该样品中含有来源于患者的外周血单核细胞(PBMC)，其中上述标记是从一组 CD15、IL4Ra、CD14、CDllb, HLA-DR, CD33、Lin、FSC、SSC 标记和可选的 CD45、CD18、⑶80、⑶83、⑶86、HLA-1标记以及存活/死亡识别子中选出的，其中与非癌症患者样品进行比较，上述MDSC表型水平升高表明癌症和/或上述癌症治疗的预后指标。上述所有标记都是已知处于先进行列。关于存活/死亡识别子，活细胞有完整的细胞膜，染料如碘化丙啶(PI)不能渗透，只能透入细胞膜受损伤的细胞。噻唑橙*(T0)是一种渗透染料，不同程度地进入所有细胞，包括活细胞和死细胞。对于革兰氏阴性菌，用EDTA去除脂多糖层可以大大促进TO吸收。因此，这两种染料组合为辨别活细胞和死细胞提供了一种快速可靠的方法。如果细菌计数很重要，那么BD液体计数微球(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)，一种流式细胞仪微珠标准，可以用来准确定量样品中活菌、死菌和细菌总数。在文中对其他存活/死亡识别子进行了介绍或已知它们处于先进行列，例如在下面文献中进行描述，Perfetto 等(Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Lamoreaux L, NguyenR, Ambrozak D, Koup RA, Roederer M.胺活性染料:一种在多色流式细胞仪中辨别活细胞和死细胞的有效工具。《免疫学方法杂志》，2006年6月30日:313(1-2): 199-208。电子版2006年5月19日。)Peranzoni等，在“髓源性抑制细胞异质性和亚群定义”，《免疫学新见》，第22卷，第2期，电子版2010年2月，第238-244页中提到的⑶15+/⑶IIB+/⑶14-群体在肾细胞癌患者中观察到。提到健康供者缺少不同群体(⑶14+⑶llb+HLA-Drlo/neg)。此外，疫苗计划监测显示不同群体(⑶IIb+⑶33+⑶15+)。显示了不同群体(Lin-HLA-DR-⑶33+⑶IIb+)在患者中显著增加，以及I到IV期的趋势。S.Kusmartsev等，在“膀胱癌患者⑶Ilb (+)CD33(low)CD15 (高)免疫抑制骨髓细胞群体的扩增”，《美国癌症研究协会会议录》年度会议，第51卷，2010年4月，第1291-1292页中，披露了与健康供者相比，癌症存在不同群体(⑶Ilb+⑶15hi⑶331o)的升高。除此之外，仅显示了在体外有助于免疫抑制。在W02010/055340A1中，据报道与健康供者相比，癌症患者的⑶11+⑶15+群体增加。在Ko等，“舒尼替尼介导逆转肾细胞癌患者中髓源性抑制细胞的累积”，《临床癌症研究》，第15卷，第6期，2009年3月，第2148 - 2157页中，与健康对照供者相比，显示两个MDSC群体(⑶14-⑶15+和⑶33+HLA-DR-)增加。所有这些论文可能仅对MDSC群体有一般性诊断价值，而没有预后或预测价值。刘建迎等，在“晚期非小细胞肺癌患者CDllb(+)/CD14(_)/CD15(+)/CD33(+)髓源性抑制细胞和CD8 (+) T淋巴细胞表达的1-精氨酸酶和诱生型一氧化氮合酶群体改变”，《癌研究与临床肿瘤学杂志》，第136卷，第I期，2010年I月，第35-45页中披露NSCLC患者的⑶Ilb+/⑶14-MDSC水平与健康对照受试者相比升高。如果患者从之前的化疗中受益，那么NSCLC患者的CDllb+/CD14-MDSC水平降低(PR+SD对比I3D:图5A)。但是，该项分析是在临床进展之后进行的，因此不能推断出其预后价值。此外，该细胞群的CD15+和CD33的表达没有用于分析。M Diaz-Monteix)等，在“增加循环的髓源性抑制细胞与临床癌症分期、转移瘤负荷和阿霉素-环磷酰胺化疗相关联”，《肿瘤免疫与免疫治疗》，第58卷，第I期，2009年I月，第49-59页中，显示新诊断(各种)癌症患者的MDSC水平与健康供者相比升高(图2A)。高MDSC水平和较高的肿瘤分期有关(图2B-C)。在IV期患者中，有较高肿瘤负荷的患者具有较高的MDSC水平(图3)。图5表明MDSC水平受不同化疗类型的影响。但是，从这些数据不能推断出治疗反应的预测价值。S Mandruzzato等，在“癌症患者的IL4Ra (+)髓源性抑制细胞扩增”，《免疫学杂志》，第182卷，第10期，2009年5月，第6562-6568页中显示与健康供者相比，以下细胞群体CD14+(图5A)，CD15+(图5B)，IL4Ra+/CD14+(图2A)在患者的PBMC中增加。结肠癌和黑色素瘤组织中的⑶14+细胞显示与肿瘤有关(图5C-D)。这些数据通常只对MDSC群体有诊断价值，没有预后或预测价值。最后，S Kusmartsev等，在“转移性肾细胞癌患者骨髓细胞介导的免疫抑制的逆转”，《临床癌症研究》，第14卷，第24期，2008年12月，第8270 - 8278页中显示与健康供者相比，RCC患者的PBMC中的Lin-HLA-DR-细胞群体增加(

图1B)。文章还显示一个Lin-HLA-DR样品中有⑶33表达。这些数据通常只对MDSC群体有诊断价值，没有预后或预测价值。—般来说，本发明不限于特定的癌症或癌症分期。然而，根据本发明首选的是方法，其中上述癌症是一种可以用免疫疗法治疗的癌症，最好是从肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、胃癌(GC)、黑色素瘤和腺癌中选择。在本发明背景下分析的样品可以是任意含有来自受试者(如患者、非癌症患者或健康个体)的MDSC的生物样品。上述样品最好是血液样品，如全血、冻存全血、外周血或其中的一部分，最好是去除血沉黄层的外周血单核细胞(PBMC)。同样地，从任意这些样品中可以获得RNA。而且，骨髓细胞也可以从肿瘤组织或骨髓中分离出来。本发明是基于一个惊人的发现，那就是治疗前的MDSC水平是癌症治疗患者免疫和/或其他临床反应的一个相关生物标记，诸如用抗癌疫苗，如IMA901-202 (如在2007年6月2日至5日芝加哥举行的美国临床肿瘤学会(ASCO)年度会议上介绍的)或文中所述的其他IMA-疫苗治疗的免疫疗法患者。本发明还公开了在癌症患者尤其是RCC患者中，健康供者与RCC患者之间不同亚组之间治疗前MDSC水平不同(所有患者，+Cy, -Cy,治疗之前细胞因子、TK1、索拉非尼、舒尼替尼)。因此，本发明涉及癌症(尤其是RCC和CRC)的诊断、预后和预测标记，以及测量上述生物标记的多色面板。骨髓细胞来源于骨髓干细胞，其包括红细胞、血小板、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞。在本发明背景下，在PBMC分析之后，对人类MDSC的六个表型(MDSC1-6)进行识别和定义，如表I所示。表1:主要出版物报道的在PBMC中发现的人类MDSC表型
权利要求
1.诊断和/或预测癌症的方法，包括 根据至少一种MDSC表型标记，确定患者生物样品中MDSC群体的至少一种髓源性抑制细胞(MDSC)表型的水平， 其中上述标记是从含有 CD15、IL4Ra、CD14、CDllb、HLA-DR、CD33、Lin、FSC、SSC 和可选的⑶45、⑶18、⑶80、⑶83、⑶86、HLA-1、存活/死亡识别子的一组中选出的。
其中，与非癌症患者样品相比，上述MDSC表型水平升高，表明是癌症和/或上述癌症治疗的预后指标。
2.根据权利要求1的方法，其中上述癌症是从肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、胃癌(GC)、黑色素瘤和腺癌中选出的。
3.根据权利要求1或2的方法中，上述MDSC表型是从基于标记IL4Ra+和⑶14+的MDSC1，基于标记IL4Ra+和CD15+的MDSC2，基于标记IL4Ra+的MDSCl或MDSC2、基于标记Lin-,HLA-DR-和 CD33+及可选的 CD18+和 HLAI+ 的 MDSC3，基于标记 CD14+、HLA_DR(-/lo)、FSChi 和 SSCim 的 MDSC4，基于标记 CDl lb+、CD14-、CD 15+ 及可选的 FSCh1、SSCim, CD80-、CD83-、CD86-和 HLA-DR-的 MDSC5 以及基于 CD15+; FSClo 和 SSChi 的 MDSC6 中选出的。
4.根据权利要求1至3任意一个的方法，其中上述方法包括含有单一多色染色步骤的流式细胞术。
5.根据权利要求1至4中任意一个的方法，进一步包括治疗的预后，其中与上述样品中治疗前MDSC水平相比升高的上述MDSC表型水平和较短的总存活期、肿瘤生长或无进展存活期有关。
6.根据权利要求5的方法，其中上述MDSC表型是从MDSC2、MDSC3、MDSC4、MDSC5和MDSC6中选出的。
7.根据权利要求1至6的任意一个的方法，其中上述MDSC表型是选自RCC或CRC患者的MDSCl和/或MDSC2 ；II1-1V期RCC患者的MDSC3 ；IV期黑色素瘤患者的MDSC4 ;最好是转移性RCC患者的MDSC5 ；以及转移性腺癌患者的MDSC5。
8.根据权利要求1至7的任意一个方法，其中上述生物样品是从含有外周血单核细胞(PBMC)诸如全血、外周血或其中部分、血沉棕黄层、肿瘤组织和骨髓的样品中选出的。
9.检测患者癌症治疗效果的方法，包括根据权利要求1至8中任意一个的方法，确定取自正在接受癌症治疗患者的生物样品中至少一种髓源性抑制细胞(MDSC)表型的水平，其中与非癌症患者样品相比，确定的上述MDSC表型水平降低，表明有效治疗上述患者的上述癌症。
10.根据权利要求9的方法，其中上述患者正在治疗或已经用从细胞因子、索拉菲尼、舒尼替尼、环磷酰胺和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)中选出的抗癌药进行了预先治疗。
11.根据权利要求10的方法，还包括患者癌症治疗效果的预后，其中上述患者正在治疗或已经用环磷酰胺预先治疗过，与未治疗或预先治疗的患者样品相比，MDSC5表型水平下降，表明有效治疗上述患者的上述癌症。
12.根据权利要求9至11任意一个的方法，还包括对上述患者的上述癌症治疗效果的监测，包括至少重复一次上述决定步骤。
13.根据权利要求 9-12任意一个的方法，其中上述癌症治疗是从化疗和/或最好包括抗癌疫苗使用的免疫疗法以及可选的GM-CSF中选出的。
14.根据权利要求13的方法，其中上述抗癌疫苗是从含有致免疫肽混合物的抗癌疫苗中选出的，致免疫肽含有从SEQ编号I至10，SEQ编号11至19及1、5、8和9，SEQ编号20至29和SEQ编号30至37中选出的序列。
15.诊断试剂盒，在一个或分别的容器内，含有用于执行权利要求1至14任意一个的方法的材料，至少含有⑶15、IL4Ra、⑶14、⑶lib、HLA-DR、⑶33、Lin和⑶45，以及可选的⑶18、⑶80、⑶83、⑶86和HLA-1的一种特异性抗体，可选择性地与说明书一起用于执行上述方法。
16.根据权利要求15的诊断试剂盒，其中抗体用从Q605、V450、AF700、APC-H7、Cy7和FITC中选出的血细胞计数标记进行标注。
17.根据权利要求15或16的诊断试剂盒至少包括从CD45Q605、CD15V450、CD124PE、CDllb AF700、CD14APC-H7、CD33PE-Cy7、CD3FITC、CD19FITC、CD56FITC 和 CD14FITC 中选出的一种抗体。
18.在癌症患者中诱导免疫反应的方法，包括 a)给上述癌症患者使用抗癌疫苗， b)在生物样品中执行权利要求1至8任意一个的方法，生物样品取自上述正在接受癌症治疗的患者，其中与患者样品相比，确定的上述MDSC表型水平下降，表明癌症患者的免疫反应诱导。
c)可选的是，根据步骤b)获得的结果重复步骤a)。
19.治疗有需要的癌症患者的癌症治疗的改进方法，其中包括给上述癌症患者进行适当的抗癌治疗，与患者样品在上述治疗之前相比，通过使用权利要求1至8任意一个的方法确定的生物样品中至少一个上述MDSC的表型水平下降，生物样品取自正在接受癌症治疗的患者。
20.治疗有需要的癌症患者的癌症治疗的改进方法,包括 a)给上述癌症患者使用抗癌疫苗， b)在生物样品中执行权利要求1至8任意一个的方法，生物样品取自上述正在接受癌症治疗的患者，其中与患者治疗前的样品相比，确定的上述MDSC表型水平下降，表明治疗上述癌症患者的上述癌症。
c)可选，根据步骤b)获得的结果重复步骤a)。
21.权利要求18至20任意一个的方法还包括对上述癌症患者免疫反应和/或治疗的监测，包括至少重复一次步骤b)和可选的步骤C)。
22.根据权利要求18至21中任意一个的方法，其中上述患者得到进一步治疗或已经用从抗癌药、细胞因子、索拉菲尼、舒尼替尼、环磷酰胺和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)化疗中选出的抗癌药进行过预先治疗。
23.根据权利要求18至22中任意一个的方法，其中上述癌症是从肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、胃癌(GC)、黑色素瘤和腺癌中选出的。
全文摘要
本发明涉及骨髓细胞生物标记用于肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)的鉴别诊断、预后和监测。本发明还涉及对肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)治疗效果的监测以及确定肾细胞癌(RCC)或结肠直肠癌(CRC)治疗效果的预后。本发明还涉及在上述方法中使用的细胞生物标记面板，尤其是用于测量上述生物标记的多色面板。
文档编号G01N33/574GK103180739SQ201180045200
公开日2013年6月26日 申请日期2011年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者哈普利特·辛格, 斯特芬·沃尔特, 蕾吉娜·门德日克, 文森佐·勃朗特, 苏珊娜·曼德鲁扎托 申请人:伊玛提克斯生物技术有限公司