专利名称：一种胶体金属定量检测技术及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胶体金属定量检测技术及其用途。
背景技术：
柱层析技术是利用层析柱对生物分子进行分离和检测的技术，其中层析柱是其常用的主体结构。层析技术按层析的机理分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、疏水层析等。吸附层析是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析是利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析是利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，使之分离。凝胶层析是利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同，使之分离。亲和层析是在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质，常见 的亲和对有酶和抑制剂、抗原和抗体、配体和受体等。柱层析技术是一中分离效率很高的分析分离手段与方法，它能够将各种性质极极其类似的物质分离开，它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。目前这种技术已广泛应用于科学研究与工业生产的多个领域，在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。胶体金属，尤其是胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标记物应用于免疫检测，有其独特的优点，尤其是以简单、快速和无污染为著称。常用的免疫胶体金检测技术有免疫胶体金光镜染色法、免疫胶体金电镜染色法、斑点免疫金渗滤法、胶体金免疫纸层析法，其中以胶体金免疫纸层析法，又称试纸条法，最为常用，即将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。但这些方法只能进行定性和半定量分析，无法进行全定量分析。因此，开发一种采用全定量分析检测技术，不仅使用方便，同时也可显著提高工作效率，在检测和分析、分离的诸多领域具有重要的实用意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种胶体金属定量检测技术及其用途，特别是以胶体金属标记物作为检测相的柱层析结构的胶体金属定量检测技术。为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案。—种胶体金属定量检测技术，以胶体金属标记物作为检测相的柱层析结构，由层析柱、捕获相、待检物样品、检测相和检测器组成。所述的检测技术，具有如下特征1)用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相；2)捕获相装载于层析柱内使用；3)检测相由胶体金属标记待检物特异性结合物而制成；4)用检测器检测被捕获的检测相的量进而计算待检物的含量和/或用检测器检测未被捕获而流出的检测相的量进而计算待检物的含量。待检物特异性结合物常用的有酶和抑制剂、抗原和抗体、配体和受体等。常用的捕获载体有凝胶颗粒和磁微粒，凝胶颗粒有葡聚糖凝胶系列的凝胶过滤填料和琼脂糖凝胶系列的凝胶过滤填料、葡聚糖凝胶系列的离子交换填料和琼脂糖凝胶系列的离子交换填料、疏水层析填料、亲和层析填料、纤维素类填料等，其中亲和层析填料在本发明技术中最为常用，有溴化氰活化琼脂糖凝胶介质(CNBr Sepharose FF)、NHS活化琼脂糖凝胶介质等。所述的层析柱的结构包括下列一种或一种以上的特性1)刚性管道结构；2)非刚性管道结构；3)为预装柱；4)为使用前装载的柱状结构；5)为加有开关控制装置的管道结构；6)为出样端易于去除过滤截留出口而使柱内固相填料易于转离柱层析结构进行下一级分析的柱状结构。刚性管道结构常见为实验室常用的两端接有接口或不接有接口的玻璃、有机玻璃、不锈钢等材质的层析柱，也包括为某些分析特制的硬质材料的柱状结构。非刚性管道结构多指塑料、橡胶、硅胶等材料制成的可以随意圈曲的管道结构，两端接有接口或不接有接口。本发明技术所采用的层析柱包括预装柱和使用前进行装载的层析柱，考虑使用的方便程度预装柱将作为优选，同时在预装柱上加建出样端过滤截留出口易于被去除而使柱内固相填料易于转离柱层析结构。本发明技术所采用的层析柱其管道结构也是优选对象，在检测时层析填料被固定在管道的特定部位进行，分析完成后被排出管道，再进行新的 分析检测。所述的捕获相中的捕获载体包括包括但不限于1)凝胶颗粒；2)磁微粒。其中凝胶颗粒为多种柱层析填料，常用亲和层析填料，磁微粒为适用于待检物特异性结合物，如抗体、抗原等，进行标记的磁性微粒。所述的待检物样品为来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。所述的胶体金属包括常用的胶体金以及其它胶体金属显色剂，如胶体硒、胶体银、胶体铜、胶体铁。所述的检测器所用的检测方法包括但不限于1)被检测的检测相为液相时，直接用比色法测定待检测液相颜色的深度进行检测；2)被检测的检测相为液相时，通过纸层析技术将待检液相中胶体金属吸附到纸质材料上，形成显色带，用密度法测定待检测液相所形成的显色带的深度进行检测。所述的检测技术包括下列一种或一种以上的步骤1)用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相；2)将捕获相装载于柱层析结构内；3)用胶体金属标记待检物特异性结合物，制成检测相；4)将含有待检物的待检样品加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，待检物被捕获；5)用清洗液清洗层析柱内的捕获相上未被结合而残留的待检物及其待检样品；6)将检测相加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，检测相与被捕获的待检物特异性结合，形成捕获相-待检物-检测相复合物，进而捕获检测相；7)直接检测未被捕获而流出的检测相的量进而计算待检物的含量；8)用洗脱液洗脱被捕获的检测相和检测相复合物，检测检测相和检测相复合物的量进而计算待检物的含量。所述的检测技术，其特征在于联合使用多种胶体金属显色信号放大技术提高检测灵敏度，包括免疫金银染色放大技术、生物素-亲合素放大技术、生物素一链霉亲合素放大技术、第二抗体结合放大技术。所述的检测技术在多种检测产品开发中的应用。有环境、临床、药物分析、食品和工业分析等多领域的检测产品。
[有益效果]
I)本发明创造性地将柱层析分析技术与胶体金技术进行了有机结合，设计了柱层析胶体金检测技术，明显提高了胶体金技术检测的准确性，实现胶体金全定量检测的目的。2)本发明将待检样品的吸附分离过程全部控制在层析柱上，简化了操作程序，方便了使用，降低了检测成本。3)本发明采用柱层析吸附分离技术，大大简化了在仪器配制设计制作中的复杂程 度，降低仪器的设计和生产成本。因此，本发明技术对改善现有化学发光检测技术具有重要的意义和良好的应用前
旦
-5^ O具体实施方式
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通过以下具体实施实例，可以进一步了解本发明，但以下实例不是对本发明的限定。实施例I、本发明技术与现行化学发光检测技术检测结果的比较
实验材料装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的预装层析柱、抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质、辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体、胶体金标记抗人血红蛋白单克隆抗体、鲁米诺、对碘苯酹、过氧化脲、化学发光检测仪、分光光度仪、人血红蛋白溶液。实验方法取已知浓度的人血红蛋白溶液，用PBS溶液稀释配置100ng、300 ng、700 ng、lug、3ug、7ug 人血红蛋白溶液和 10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng 人血红蛋白溶液。另取健康人全血，加入等量的去离子水溶血释放血红蛋白，再用PBS进行1000倍稀释用于本发明技术测定，再用PBS进行10000倍稀释用于化学发光技术测定。本发明技术测定100ng、300 ng、700 ng、lug、3ug、7ug人血红蛋白溶液并绘制标准曲线,然后测定健康人血红蛋白，并计算血红蛋白浓度。化学发光技术测定10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng人血红蛋白溶液并绘制标准曲线，然后测定健康人血红蛋白，并计算血红蛋白浓度。取42个试管，分为本发明技术组和现行化学发光检测技术组。每个样品做3个平行管。现行化学发光检测技术组，每管加入抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul，再分别加入已知浓度的人血红蛋白溶液和待测健康人血红蛋白溶液各50ul, 37°C震摇温育30分钟(之前实验证实37°C震摇温育30分钟为最佳反应时间)，3000转、分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul,混匀，3000转、分离心3分钟，弃上清，加入辣根过氧化物酶标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，37°C震摇温育30分钟(之前实验证实37°C震摇温育30分钟为最佳反应时间)，3000转、分离心3分钟，弃上清，加入PBS 300ul,混勻，3000转、分离心3分钟,弃上清,转移凝胶介质至发光杯,加入IOOul鲁米诺、对碘苯酹和过氧化脲等配置的发光底物工作液，反应进行2分钟时，记录发光量6秒钟，计算样品含量。本发明技术组，取装有抗人血红蛋白多克隆抗体标记的NHS活化琼脂糖凝胶介质50ul的预装层析柱，分别加入已知浓度的人血红蛋白溶液和待测健康人血红蛋白溶液各50ul,收集流出液，加入PBS缓冲液IOOul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，再加入PBS缓冲液300ul清洗，弃流出液，加入胶体金标记抗人血红蛋白单克隆抗体50ul，收集流出液，加入PBS缓冲液IOOul，收集并合并流出液，合并流出液重新上样两次，共约2分钟，收集合并流出液，转移合并流出液至比色杯，用分光光度仪进行比色，记录520nm处的吸光值(OD)，计算样品含量。预装层析柱再用300ul PBS缓冲液清洗，然后用150ul亲和洗脱液分三次进行洗脱，并收集洗脱液，转移洗脱液至比色杯，用分光光度仪进行比色，记录520nm处的吸光值(OD)，计算样品含量。实验结果现行技术完成实验时间80分钟，测定结果3. llug/50ul，本发明流出 液检测技术完成实验时间15分钟，测定结果3. 09ug/50ul，洗脱液检测技术完成时间为18分钟，测定结果3. 26ug/50ul，两种实验方法所得结果基本一致，但本发明的完成实验时间明显短于现行技术。
权利要求
1.一种胶体金属定量检测技术，其特征在于所述的检测技术是以胶体金属标记物作为检测相的柱层析结构，由层析柱、捕获相、待检物样品、检测相和检测器组成。
2.根据权利要求I或2所述的检测技术，具有如下特征 1)用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相； 2)捕获相装载于层析柱内使用； 3)检测相由胶体金属标记待检物特异性结合物而制成； 4)用检测器检测被捕获的检测相的量进而计算待检物的含量和/或用检测器检测未被捕获而流出的检测相的量进而计算待检物的含量。
3.根据权利要求I-2任一所述的检测技术，其特征在于所述的层析柱的结构包括下列一种或一种以上的特性 1)刚性管道结构； 2)非刚性管道结构； 3)为预装柱； 4)为使用前装载的柱状结构； 5)为加有开关控制装置的管道结构； 6)为出样端过滤截留出口易于被去除而使柱内固相填料易于转离柱层析结构进行下一级分析的柱状结构。
4.根据权利要求I-3任一所述的检测技术，其特征在于所述的捕获相中的捕获载体包括包括但不限于 1)凝胶颗粒； 2)磁微粒。
5.根据权利要求I-4任一所述的检测技术，其特征在于所述的待检物样品为来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。
6.根据权利要求I-5任一所述的检测技术，其特征在于所述的胶体金属包括胶体金、胶体硒、胶体银、胶体铜、胶体铁。
7.根据权利要求I-6任一所述的检测技术，其特征在于所述的检测器所用的检测方法包括但不限于 1)被检测的检测相为液相时，直接用比色法测定待检测液相颜色的深度进行检测； 2)被检测的检测相为液相时，通过纸层析技术将待检液相中胶体金属吸附到纸质材料上，形成显色带，用密度法测定待检测液相所形成的显色带的深度进行检测。
8.根据权利要求1-7任一所述的检测技术，其特征在于所述的检测技术包括下列一种或一种以上的步骤 1)用待检物特异性结合物偶联捕获载体，制成捕获相； 2)将捕获相装载于柱层析结构内； 3)用胶体金属标记待检物特异性结合物，制成检测相； 4)将含有待检物的待检样品加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，待检物被捕获； 5)用清洗液清洗层析柱内的捕获相上未被结合而残留的待检物及其待检样品； 6)将检测相加载至柱层析结构上，然后流经捕获相，检测相与被捕获的待检物特异性结合，形成捕获相-待检物-检测相复合物，进而捕获检测相； 7)直接检测未被捕获而流出的检测相的量进而计算待检物的含量； 8)用洗脱液洗脱被捕获的检测相和检测相复合物，检测检测相和检测相复合物的量进而计算待检物的含量。
9.根据权利要求1-8任一所述的检测技术，其特征在于联合使用多种胶体金属显色信号放大技术提高检测灵敏度，包括免疫金银染色放大技术、生物素-亲合素放大技术、生物素一链霉亲合素放大技术、第二抗体结合放大技术。
10.权利要求I-9任一所述的检测技术在多种检测产品开发中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金属定量检测技术，由层析柱、捕获相、待检物样品、检测相和检测器组成，可用于多种分析检测技术产品的开发，具有良好的适用价值和市场前景。
文档编号G01N30/50GK102680619SQ20111005513
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者刘凤鸣 申请人:北京康华源医药信息咨询有限公司